Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

Riepilogo

L'obiettivo del presente protocollo è quello di valutare l'effetto dei fattori pro - e anti - migratory su migrazione delle cellule all'interno di una matrice tridimensionale di fibrina.

Abstract

Attualmente, maggior parte dei modelli in vitro di cicatrizzazione, come ben consolidate saggi gratta e Vinci, coinvolgono studiando la chiusura della ferita e di migrazione di cellule su superfici bidimensionali. Tuttavia, l'ambiente fisiologico in cui in vivo di cicatrizzazione avviene è tridimensionale, piuttosto che bidimensionale. Sta diventando sempre più chiaro che il comportamento delle cellule differisce notevolmente in bidimensionale vs ambienti tridimensionali; di conseguenza, c'è una necessità per i modelli più fisiologicamente rilevanti in vitro per studiare i comportamenti di migrazione cellulare in chiusura della ferita. Il metodo descritto nel presente documento consente lo studio della migrazione cellulare in un modello tridimensionale che meglio riflette le condizioni fisiologiche di saggi di gratta e Vinci bidimensionale precedentemente stabiliti. Lo scopo di questo modello è di valutare di conseguenza delle cellule tramite l'esame della migrazione cellulare lontano un corpo sferoide incorporato all'interno di una matrice di fibrina in presenza di fattori pro - o anti - migratory. Utilizzando questo metodo, conseguenza delle cellule dal corpo sferoide in una matrice tridimensionale può essere osservato ed è facilmente quantificabile nel tempo tramite microscopia in campo chiaro e analisi dell'area del corpo di sferoide. L'effetto dei fattori pro-migratori e/o inibitori su migrazione delle cellule possa anche essere valutato in questo sistema. Questo metodo fornisce ai ricercatori con un semplice metodo di analizzare la migrazione cellulare in matrici tridimensionali ferita associata in vitro, aumentando così la rilevanza di in vitro delle cellule studia prima dell'uso di in vivo animale modelli.

Introduzione

Guarigione delle ferite è un processo complesso che comporta il ripristino dell'integrità del tessuto dopo la lesione. Questo processo è suddiviso in quattro fasi sovrapposte di emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento, che ciascuno sono regolati da una complessa combinazione di stecche solubile, interazioni cellula-matrice e comunicazioni cellula-cellula. ^{1 , 2} l'orchestrazione di questi spunti controlla una moltitudine di risposte cellulari nella guarigione delle ferite, tra cui, importante, migrazione delle cellule. ^{3 , 4} migrazione cellulare è un processo altamente dinamico dipendono sia fenotipi cellulari e le proprietà biochimiche e biofisiche del milieu di matrice extracellulare. ⁵ cellule continuamente sonda loro ambiente extracellulare attraverso vie di integrina-mediata; Questo processo permette che le cellule di percepire una vasta gamma di proprietà di matrice tra cui topografia, rigidità e confinamento. Bidimensionale (2D) analisi della migrazione cellulare dimostra che la migrazione è guidato da formazione di lamellipodi all'avanguardia attraverso la generazione di fasci di filamenti di actina. Conseguente formazione di adesioni focali all'avanguardia, in combinazione con actomiosina guidato contrazione e retrazione del bordo posteriore, guida la cellula in avanti. ⁶ migrazione cellulare tridimensionale (3D) attualmente non è ben compreso, tuttavia, studi recenti dimostrano che la migrazione 3D è nettamente diverso da quello il afore descritto meccanismo in 2D e probabilmente è guidato dai meccanismi alterative. Ad esempio, gli studi recenti da Petrie et al. ha dimostrato che, a seconda delle proprietà del ECM, celle in matrici 3D possono passare tra lamellipodio e lobopodium guidato meccanismi di migrazione. ⁷ perché la migrazione cellulare è una componente critica della ferita risposta curativa, modelli 3D di migrazione delle cellule sono critici per capire le risposte fisiologiche a vari stimoli durante la guarigione della ferita. Anche se il comportamento migratore cella su superfici 2D è stato indicato per variare notevolmente dalla migrazione in matrici 3D, modelli più attuali in vitro della migrazione cellulare durante il processo, compreso il saggio di gratta e Vinci ben consolidato, di cicatrizzazione utilizzano 2D colture dello strato monomolecolare. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} più recentemente sviluppati saggi hanno utilizzato una matrice 3D, ma ancora della coltura le cellule in un monostrato in cima la matrice, limitando così la possibilità di veramente ricapitolare la tridimensionalità dell'ambiente delle cellule in vivo. ¹⁵

Lo scopo del metodo descritto nel presente documento è quello di studiare la migrazione delle cellule in un modello 3D fisiologicamente rilevante, piuttosto che su una superficie 2D, al fine di ottenere una comprensione più robusta delle risposte di migrazione associati con gli stimoli applicati. Questo metodo permette la valutazione della migrazione cellulare all'interno di una matrice di coagulo di fibrina 3D in presenza di fattori che attivano o inibiscono vie connesse con migrazione cellulare. Una matrice di fibrina è stato scelto per questo metodo per i giochi di ruolo critico della fibrina nelle prime fasi di guarigione della ferita; seguenti lesioni, un coagulo di fibrina sono formata all'interno degli ambienti di ferita per arginare la perdita di sangue e serve come impalcatura per infiltrazione iniziale delle cellule durante la riparazione dei tessuti e il rimodellamento. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} inoltre, fibrina è usata clinicamente come sigillante chirurgico e la composizione dei sigillanti è stata legata alla migrazione cellulare e risultati di guarigione definitiva. Uno studio precedente da Cox et al. studiato la migrazione dei fibroblasti con coaguli di fibrina composto da varia fibrina e trombina concentrazioni allo scopo di ottimizzare un sigillante di fibrina. In questi studi, è stato quantificato la migrazione delle cellule fuori coaguli di fibrina su piatti di plastica. ²⁰ qui presentiamo un metodo che consente la quantificazione della migrazione delle cellule all'interno dell'ambiente 3D della fibrina. Mentre il metodo descritto in questo protocollo specificamente utilizza fibrina, questo modello può essere modificato facilmente per utilizzare materiali alternativi matrice come desiderato, ad esempio collagene o altre matrici 3D. Inoltre, presentiamo l'uso di sferoidi del fibroblasto in questo saggio, poiché la migrazione dei fibroblasti nel letto della ferita è di fondamentale importanza per la sintesi di matrice extracellulare e la riparazione/rimodellamento tissutale. Tuttavia, durante la riparazione processo neutrofili sono il tipo di cella primo di migrare nel letto della ferita, seguito dai macrofagi. Fibroblasti allora cominciano a infiltrarsi l'ambiente della ferita circa 48 ore dopo la lesione iniziale, all'inizio della fase proliferativa del processo di guarigione arrotolato. ¹⁹ questo test potrebbe essere facilmente modificato per includere i neutrofili, macrofagi o altri tipi di cellule per valutare come alterazioni nella struttura del coagulo di fibrina influiscono sulla migrazione di questi tipi di cellule. ²¹

Per implementare questo test, in primo luogo, uno sferoide del fibroblasto è formato usando una modifica delle tecniche descritte in precedenza per la coltura delle cellule staminali. ²² la sferoide dei fibroblasti è successivamente trasferita in una matrice di fibrina 3D, e la conseguenza quindi può essere facilmente monitorata e quantificata per diversi giorni. Questo protocollo prende in considerazione il 3D dei sistemi fisiologici incorporando sferoidi cellulare 3D all'interno di una matrice di fibrina, evitando così le limitazioni nella rilevanza provocata da un uso di una superficie di crescita 2D con un monostrato di cellule per comportamento migratore modello, mentre consentendo comunque per la valutazione del comportamento delle cellule in un ambiente altamente controllato in vitro .

Protocollo

1. giorno 1: cella e preparazione dei reagenti

Nota: tutti i cellulari e reagente preparazione deve essere eseguita in un armadietto per prevenire la contaminazione dei campioni di sicurezza biologica.

1. Calda filtrata Dulbecco ' s Modified Eagle ' s Medium (DMEM), siero bovino fetale (FBS), L-glutamina e penicillina/streptomicina in bagnomaria a 37 ° C.
2. Media di fibroblasti cutanei umani neonatale (HDFn) di preparare completando riscaldato DMEM con 10% FBS, 1% di penicillina/streptomicina e 1% L-glutammina.
3. Scongelare una fiala di HDFns congelati e centrifugare per 8 min a 200 x g per rimuovere il mezzo di crioconservazione. Risospendere le cellule in preparati HDFn media ad una densità di 1 x 10 ⁶ cellule/mL e semi in un matraccio di cultura T-75.
4. Immergere la muffola in un'incubatrice (37 ° C, 5% CO ₂) per consentire la proliferazione delle cellule.
5. Media store HDFn a 4 ° C.
6. Preparare pro - e anti - migratory reagenti come necessario.

2. Giorno 3: Sferoide preparazione

1. eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio di cultura per prevenire la contaminazione dei campioni.
2. Quando le cellule raggiungono 80% confluency, aspirare media e aggiungere 5 mL di 0,25% tripsina-EDTA. Boccetta di archivio in un incubatore a 37 ° C per 5 min staccare completamente le cellule dalla superficie del pallone.
3. Aggiungere 5 mL di terreno riscaldato al pallone per neutralizzare la tripsina.
4. In un tubo del microcentrifuge, mescolare 10 μL di Trypan Blue e 10 μL della sospensione cellulare.
5. Centrifugare la sospensione cellulare originale per 8 min a 200 x g.
6. Mentre la sospensione cellulare è essere centrifugata, aggiungere 10 μL della sospensione delle cellule di Trypan Blue per un emocitometro ed eseguire un conteggio delle cellule.
7. Dopo la centrifugazione, aspirare media senza sloggiare il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare ad una concentrazione di 1,25 x 10 ⁵ cellule/mL.
8. Aggiungere 5 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS) alla parte inferiore di un 10 cm di Petri per mantenere un ambiente idratato durante la crescita della sferoide.
9. Inverti il coperchio del piatto Petri. Aggiungere qualche goccia di 20 µ l della sospensione delle cellule sulla superficie interna del coperchio di Petri.
10. Rapidamente invertire nuovamente il coperchio e reimmetterlo sul fondo del piatto, facendo attenzione a non staccare le gocce d'attaccatura. la figura 1 illustra gocce di sospensione correttamente formato.
11. Attentamente mettere il piatto in un incubatore a 37 ° C e consentire sferoidi a crescere in una sospensione goccia cultura per un periodo di 72 h.

3. Giorno 6: Incorporamento di sferoidi in 3D Matrix

1. eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio di cultura per prevenire la contaminazione dei campioni.
2. Per la formazione del primo strato di fibrina, creare una soluzione di coagulo di volume sufficiente per aggiungere 100 μL di soluzione di coagulo per pozzetto per come molti pozzi come richiesto (1 sferoide per pozzetto). I grumi sono costituiti da 10% 10 X HEPES buffer di volume (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50mm CaCl ₂, pH 7.4), fibrinogeno umano 2 mg/mL e 0.1 U/mL trombina umana alfa. Il resto del volume coagulo è composto di acqua ultrapura.
   1. Aggiungi trombina Ultima e rapidamente aggiungere soluzione desiderata nei pozzetti in una piastra a 48 pozzetti al fine di impedire la polimerizzazione prima di essere aggiunto ai pozzi di coaguli.
3. Delicatamente shake/rubinetto ben piatto per garantire che miscela di coagulo di fibrina è il rivestimento l'intero bene e quindi posizionare ben piatto nell'incubatrice per 1 h per consentire lo strato di coagulo inferiore a polimerizzare. Non agitare bene piatto abbastanza duro per indurre la formazione di bolle; semplicemente rock piastra se necessario fino a quando la totalità del pozzo è rivestita. Se vengono utilizzati più grandi volumi di coagulo, questo passaggio potrebbe non essere necessario.
4. Trasferire lo strato di fibrina sferoidi. Piastra
   1. Rimuovi il pozzo e la capsula di Petri contenente sferoidi nell'impiccagione goccia cultura dall'incubatrice ed esaminare sferoidi sotto un microscopio. Poi mettere la teglia nel cofano cultura.
   2. Inverti con cautela il coperchio del piatto Petri per consentire l'accesso per l'impiccagione goccia culture.
   3. Con attenzione usando un ago 21G collegato a una siringa da 1 mL, trasferire una goccia dal coperchio rovesciato al centro di ogni bene, facendo attenzione a non per forare lo strato di fibrina polimerizzata rivestimento del fondo del pozzo. Per trasferire in modo efficace la goccia, tirare lentamente la discesa nell'ago. Smettere di tirare lo stantuffo al più presto la caduta di intera è all'interno dell'ago; tirando la goccia indietro troppo lontano può introdurre bolle d'aria, che possono interferire con trasferimento efficace sferoide o formazione immagine successiva.
   4. Esaminare la piastra ben sotto un microscopio per garantire che sferoidi sono correttamente trasferite nei pozzetti tutto desiderate.
5. Per la formazione del secondo strato di fibrina, creare un'altra soluzione di coagulo utilizzando la stessa preparazione come sopra per la creazione del primo strato di fibrina (punto 3.2). Con attenzione aggiungere 100 μL in ogni goccia di sferoide-contenenti ed esaminare sotto un microscopio nuovo affinché sferoidi sono ancora intatte e non sono stati spinti ai bordi dei pozzi.
6. Restituire la piastra ben nell'incubatore e consentire il secondo strato di polimerizzare per 1 h.

4. Giorno 6: Aggiunta di Pro-migratori o fattori inibitori

1. media HDFn calda a 37 ° C.
2. Eseguire le seguenti operazioni in un cappuccio per evitare contaminazione.
3. Preparare supporti per ogni gruppo incluso concentrazioni adeguate di agenti pro/anti-migratory da valutarsi a.
4. Rimuovere la piastra ben da incubatrice e posto in una cappa di cultura.
5. Aggiungere 500 μL di supporti standard per ciascun pozzetto nel gruppo di controllo sferoide, 500 μL di inibitoria media in ciascun pozzetto del gruppo sferoide ha inibito la migrazione e 500 μL di media pro-migratori in ciascun pozzetto del gruppo migrazione avanzata sferoide.
6. Riporre la piastra ben nell'incubatore.
7. Media di cambiamento ogni 48 h.

5. Giorni 6-9: valutazione della migrazione cellulare e la proliferazione

1. immagine sferoidi mediante microscopia in campo chiaro immediatamente dopo l'aggiunta di media (0 h) e quindi ogni 24 h per 72 h. Optional: ogni punto del tempo, prendere un immagine dello stack z al fine di determinare se migrazione avviene nei piani fuori della zona principale di messa a fuoco. Nella nostra esperienza questo non avviene; Tuttavia, è utile garantire questo è il caso in ogni esperimento.
2. Uso ImageJ per determinare di conseguenza delle cellule in ogni pozzetto analizzando aumento percentuale della superficie per ogni sferoide traccia il bordo della cella per ogni sferoide in ciascun punto di tempo successivi e utilizzando il " misura " la funzione per ottenere l'area.

Risultati

Cultura della sferoide possa essere utilizzata per valutare correttamente l'effetto di agenti pro e anti-migratori sulla migrazione dei fibroblasti in vitro
Sferoidi del fibroblasto 3D possono essere formate tramite sospensione goccia cultura per un periodo di 72 h (Figura 1). Dopo il periodo di coltura, sferoidi sono incorporati all'interno della matrice di coagulo ed imaged utilizzando la microscopia a campo chiaro (...

Discussione

Questo protocollo permette per l'esame della migrazione cellulare nella guarigione delle ferite associato ECMs attraverso un modello 3D in vitro . Un passo fondamentale nella corretta esecuzione della procedura è il corretto sviluppo di sferoidi del fibroblasto; concentrazione di cellule durante la preparazione è stata ottimizzata per dare una concentrazione iniziale di 2.500 cellule/goccia, permettendo sferoidi per formare in modo affidabile su un periodo di incubazione di 72 h. Se vengono utilizzato un numer...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes