Utilizzazione di capsule per la colorazione negativa di campioni virali all'interno del Biocontainment

Riepilogo

Questo protocollo fornisce istruzioni per i campioni di virus di colorazione negativi che possono essere facilmente utilizzati nei laboratori BSL-2, -3, o -4. Comprende l'utilizzo di una innovativa capsula di elaborazione che protegge la griglia di microscopia elettronica di trasmissione e fornisce all'utente la gestione più agevole negli ambienti più turbolenti all'interno del biocontainment.

Abstract

La microscopia elettronica di trasmissione (TEM) è usata per osservare l'ultrastruttura di virus e altri patogeni microbici con risoluzione nanometrica. La maggior parte dei materiali biologici non contengono elementi densi in grado di spargere elettroni per creare un'immagine; Pertanto, è necessaria una macchia negativa che pone sali duri di metalli pesanti intorno al campione. Per visualizzare i virus in sospensione sotto il TEM devono essere applicati a piccole griglie rivestite con una superficie trasparente solo in nanometri spesse. A causa della loro piccola dimensione e fragilità, queste griglie sono difficili da gestire e facilmente mosse dalle correnti d'aria. La superficie sottile è facilmente danneggiata, lasciando difficile o impossibile l'immagine. I virus infettivi devono essere trattati in un armadio di biosicurezza (BSC) e alcuni richiedono un ambiente di laboratorio per la bioconvenzione. La colorazione dei virus nei livelli di biosicurezza (BSL) -3 e -4 è particolarmente impegnativa perché questi ambienti sono più turbolenti e sono richiesti tecniciO indossare equipaggiamento protettivo personale (PPE), che diminuisce la destrezza.

In questo studio abbiamo valutato un nuovo dispositivo per aiutare i virus di colorazione negativi nel biocontain. Il dispositivo è una capsula che funziona come una punta specializzata della pipetta. Una volta che le griglie vengono caricate nella capsula, l'utente semplicemente aspira i reagenti nella capsula per consegnare il virus e le macchie alla griglia incapsulata, eliminando così la manipolazione degli utenti delle griglie. Anche se questa tecnica è stata progettata appositamente per l'uso in biocontain di BSL-3 o -4, può facilitare la preparazione del campione in qualsiasi ambiente di laboratorio, consentendo una facile colorazione negativa del virus. Questo stesso metodo può essere applicato anche per preparare campioni TEM negativi negativi di nanoparticelle, macromolecole e campioni simili.

Introduzione

La microscopia elettronica di trasmissione (TEM) è uno strumento efficace per visualizzare la morfologia e l'ultrastruttura di campioni biologici troppo piccoli da vedere con un tradizionale microscopio leggero ^{1 , 2 , 3 , 4} . I TEM sparano gli elettroni attraverso un esemplare molto sottile che produce un'immagine di risoluzione più elevata in quanto gli elettroni hanno una lunghezza d'onda molto più breve della luce. Le regioni del campione che piegano o bloccano gli elettroni appaiono scuri, mentre le regioni che sono elettricamente lucenti appaiono bianche.

La mancanza di materia elettronica densa rende difficile la visualizzazione di virus sotto un TEM perché non possono spargere elettroni. La colorazione negativa è il metodo più comune utilizzato per creare il contrasto e visualizzare i virus con un TEM. La prima procedura di colorazione negativa è stata proposta da Brenner e Horne nel 1959, basata su un esperimento in cui Hall (1955) e Huxley (1957) osservanoVeda l'apparizione di strutture biologiche in contrasto contrario quando immerse in una sostanza elettronica-densa ⁵ . Il processo di colorazione negativa è stato praticamente invariato nel corso del mezzo secolo. La colorazione negativa comporta brevemente l'applicazione di una soluzione salina di metalli pesanti ad un campione su una griglia TEM nel tentativo di circondare il virus con materiale densa senza infiltrarsi il virus ⁶ . Questo crea un bordo scuro e rivela la forma della particella ⁵ . Questo studio utilizza due reagenti per la colorazione negativa, l'uranil acetato (UA) e l'acido fosfatugnitico di potassio (PTA). Entrambe queste macchie sono comunemente utilizzate per negare negativamente piccoli campioni biologici, come i virus, i complessi proteici e le nanoparticelle ^{7 , 8 , 9} .

La tradizionale tecnica di colorazione negativa è la tecnica di colorazione negativa a goccia manualeNique ⁷ . Questo metodo richiede una precisa manipolazione di piccole e fragili griglie TEM con pinze per applicare piccole quantità di campioni di virus, macchia e risciacqui. Il tipico protocollo di preparazione prevede l'applicazione di una gocciolina di sospensione campione sulla superficie di una griglia TEM rivestita con film ( Figura 1A ). Dopo aver attaccato il campione alla superficie del film, la griglia viene risciacquata per rimuovere virus non aderenti e macchiata con UA ​​o PTA per alcuni secondi a un minuto, a seconda del tipo di campione. Il liquido in eccesso è malvagio lontano dalla griglia toccando un pezzo di carta filtrante al bordo della griglia.

Il metodo manuale a goccia richiede che ciascuna griglia venga creata singolarmente. Se non vengono trattati con cura, le reti TEM rivestite sono facilmente forate, piegate o contaminate. L'elaborazione di più campioni può portare a difficoltà nel monitoraggio delle griglie e nel garantire una colorazione coerente per ciascun campione. Questa procedura di colorazione manuale è molto più dÈ difficile se effettuato nei laboratori di bioconducibilità a livello di biosicurezza (BSL) -3 e -4, a causa delle necessarie attrezzature protettive (PPE) necessarie per questi ambienti. Il PPE è ingombrante e l'ambiente di bioconvettività è molto più turbolento rispetto ad un normale laboratorio. I dipendenti che lavorano nei laboratori di bioconducibilità BSL-3 sono tenuti a indossare 2 coppie di guanti e lavorare in un armadio di biosicurezza (BSC). Questo doppio strato di guanti riduce la sensibilità tattile e limita il movimento fine del motore. Il flusso d'aria del BSC che protegge l'utente e aiuta a prevenire la contaminazione del campione può causare che i campioni e le macchie si asciugano troppo rapidamente, compromettendo così la qualità della macchia. Il forte flusso d'aria turbolento nel BSC può anche rapidamente soffiare via una griglia non ben assicurata. Nei laboratori di bioconducibilità BSL-4 ci sono ulteriori requisiti di sicurezza. Il personale è tenuto a indossare un aspetto positivo, che limita ulteriormente il movimento fisico e la capacità di vedere e manipolare chiaramenteGriglie di ulate. Il tecnico che lavora in BSL-4 indossa anche almeno 2 paia di guanti, con la coppia esterna che è un guanto spesso che riduce notevolmente la destrezza e la sensazione tattile. Infine, le pinze utilizzate per gestire le griglie TEM sono taglienti, presentando così un rischio per il tecnico a causa della loro capacità di puntare i guanti. Con le capsule contenenti griglie, le pinze non sono necessarie, offrendo così un'alternativa sicura e priva di pesi per la manipolazione di griglie nel biocontainment. Infine, le capsule forniscono anche un modo efficace per memorizzare le griglie durante la lavorazione, la decontaminazione del vapore osmio e durante lo stoccaggio; Mantenendo così le griglie organizzate e sicure da danni.

In questo rapporto, introduciamo un nuovo metodo per le griglie TEM di colorazione negativa nei laboratori di biocontainment che utilizza le capsule mPrep / g, un dispositivo basato sulla capsula per la gestione e la colorazione delle griglie ^{10 , 11 , 12} . La capsula accomModifica due griglie TEM, minimizza la gestione diretta e riduce il potenziale di danni alla griglia. La capsula si attacca direttamente a una pipetta singola o multicanale nello stesso modo di una punta pipetta, permettendo l'applicazione di vari liquidi nelle griglie contenute all'interno. Ciò consente la preparazione simultanea di campioni multipli con griglie duplicate ( Figura 1B ). Alla macchia negativa con capsule il campione di virus viene aspirato nella capsula e mantenuto per 10 minuti per lasciare che i virus assorbono sulle superfici della griglia. Le griglie con virus adsorbito vengono successivamente lavate con acqua deionizzata (dI) e macchiate con UA ​​o PTA per alcuni secondi a 1 min. Questo processo utilizza gli stessi passaggi di protocollo e reagenti come il metodo manuale a goccia; La differenza è che tutto il lavoro avviene all'interno della capsula senza alcuna manipolazione fisica delle griglie. ( Figure 1C , 1D ).

Lo scopo di questo studio era valutare le capsule comeUn nuovo metodo per la colorazione negativa di campioni di virus negli ambienti di bioconvestimento. Questo studio ha inoltre esaminato la qualità delle immagini TEM prodotte da due diverse procedure di inattivazione del virus: 1) inattivazione rapida, con 1% osmio tetroxido vapore, e 2) 24 ore di inattivazione con glutaraldeide 2%. Entrambe sono state condotte usando le capsule. Infine, abbiamo valutato due macchie negative usuali, UA e PTA, per l'uso nella capsula. ¹³

Protocollo

1. Preparazione dell'esperimento in un ambiente BSL-2 prima di utilizzare i campioni di virus

1. Preparare o acquistare Formvar e griglie di rame TEM, rivestite di carbonio, di solito 200-400 maglie.
2. Inserire le griglie TEM rivestite in capsule.
   1. Utilizza una lente ingrandita per rendere questo processo facile da eseguire. Una o due griglie possono essere inserite in ciascuna capsula. Le capsule pre-caricate possono essere acquistate per eliminare questa fase se lo si desidera.
3. Trasferire le capsule con griglie trattate con TEM, insieme ad altre forniture e reagenti, al bioconvettore dove i virus saranno negativamente macchiati.

2. Il metodo della capsula per la colorazione negativa nel biocontainment usando la glutaraldeide acquosa e l'inattivazione del vapore di ossido di ossido di osmio dell'1%

1. All'interno del biocontain BSC, aspirare 40 μL di sospensione virale nella capsula attaccata ad una pipetta.
   NOTA: la pipetta rimane attaccata a thE la capsula fino al completamento del processo. La preparazione del virus è secondo la nostra precedente pubblicazione ¹⁴ .
2. Posizionare la pipetta sul fianco per 10 min con griglie orientate orizzontalmente. Questo è quello di promuovere una distribuzione uniforme di particelle di virus sulle griglie ricoperte.
3. Inattivare il virus all'interno della capsula all'interno del biocontainment BSC.
   1. Prendere la pipetta e premere lo stantuffo per distribuire la soluzione di virus in un contenitore di rifiuti.
   2. Aspirare 40 μL di fissatore di glutaraldeide al 2% nelle capsule.
      Attenzione: La glutaraldeide è una sostanza chimica pericolosa e richiede una protezione adeguata. La glutaraldeide può essere impiegata per brevi periodi in un normale BSC, ma il reagente aperto aperto richiede la lavorazione in un cappuccio fumettato BSC o chimico.
   3. Posizionare la pipetta sul fianco per 20 min. Ciò è per garantire che i campioni siano ben fissati.
   4. Espelle il fissativo e aspira 40 μL di acqua dI nelle capsule fino aCenere via il fissativo. Ripetere questo passaggio di lavaggio per un totale di 3 cicli di lavaggio.
4. Aspirare 40 μL di 1% di uranil acetato (UA) o di 1% di acido fosfatastico di potassio (PTA) nelle capsule e lasciare riposare per 30 s.
   NOTA: il tempo di colorazione può variare da 10 s a 1 min in base al campione di virus.
   Attenzione: UA è un emettitore alfa e una tossina cumulativa. Maneggiare con una protezione adeguata.
5. Rimuovere la capsula dalla pipetta e asciugare le griglie toccando un pezzo di carta filtrante al bordo delle griglie mentre le griglie rimangono all'interno della capsula.
6. Procedura di inattivazione del vapore di ossido di tetra ossido.
   1. Posizionare la capsula, con il coperchio aperto, in un tubo centrifuga da 50 ml contenente carta filtrante imbevuto in una soluzione tetrossido di osmio dell'1%.
      Attenzione: Il tetrossido di osmium è estremamente tossico e con bassa pressione di vapore. Deve essere utilizzato in un canale fumettato BSC o chimico. Maneggiare con una protezione adeguata. Messaggio di avvisoInformazioni nell'area di lavoro.
   2. Sigillare il tubo di centrifuga da 50 ml per 1 h per consentire la completa permeazione del vapore di ossido di ossido di osmium. Quindi, successivamente decontaminare e trasferire il tubo dal biocontainer alla struttura BSL-2 EM.
7. Rimuovere le griglie EM dalla capsula.
   1. Nella funzione BSL-2 EM, rimuovere la capsula dal tubo di centrifuga e metterla su una pipetta.
   2. Aspirare 40 μL di acqua dI nella capsula e dispensare l'acqua in un contenitore di rifiuti tre volte.
   3. Rimuovere la capsula dalla pipetta e asciugare le griglie con la carta filtrante per toccare il bordo delle griglie.
   4. Dopo essiccazione ad aria, conservare le griglie per la successiva imaging TEM.

3. Il metodo della capsula per l'inattivazione nel biocontainment con il 2% di glutaraldehide, seguito da una colorazione negativa in un laboratorio BSL-2

1. Procedura di inattivazione del virus.
   1. All'interno della biocontattazione BSC, mescolare bene la sospensione virale con lo stesso volume di glutaraldeide 4% per ottenere una concentrazione finale di glutaraldeide al 2%.
      Attenzione: La glutaraldeide è una sostanza chimica pericolosa e richiede una protezione adeguata. La glutaraldeide può essere impiegata per brevi periodi in un normale BSC, ma il reagente aperto aperto richiede la lavorazione in un cappuccio fumettato BSC o chimico.
   2. Inattivare i virus con fissativo per almeno 24 ore prima dell'imballaggio, della decontaminazione e trasferirlo allo stabilimento BSL-2 EM.
2. Nell'impianto BS-2 EM, aspirare il virus e la miscela fissativa nella capsula, contenente due griglie TEM, attaccate ad una pipetta.
3. Posizionare la pipetta orizzontalmente per 10 minuti con le griglie orientate orizzontalmente.
   NOTA: si tratta di promuovere una distribuzione uniforme di particelle di virus sulle griglie TEM.
4. Raccogliere la pipetta e premere lo stantuffo per espellere il virus in un contenitore di rifiuti. Aspirare 40 μL di dIL'acqua nelle capsule e lo espelle nel contenitore dei rifiuti per 3 cicli di risciacquo.
5. Aspirare 40 μL di 1% UA o 1% PTA nelle capsule per 30 s.
   NOTA: Il tempo di colorazione varia da 10 s a 1 min sulla base del campione di virus.
   Attenzione: UA è un emettitore alfa e una tossina cumulativa. Maneggiare con una protezione adeguata.
6. Rimuovere la capsula dalla pipetta e asciugare le griglie toccando il bordo delle griglie su un pezzo di carta filtrante. Aria asciugare le griglie e memorizzarle per la successiva imaging TEM.

Risultati

Il metodo della capsula produce una colorazione negativa di buona qualità per l'imaging TEM:

In primo luogo, abbiamo valutato la qualità delle immagini generate usando sia il metodo manuale a goccia che i metodi della capsula per la colorazione negativa Zaire ebolavirus. Gli ebolavirus sono membri della famiglia Filoviridae , insieme al virus di Marburg. Ebolavirus è in genere da 80 a 100 nm di diametro e può ess...

Discussione

La colorazione negativa è una preziosa tecnica TEM per valutare e dimensionare i virus, i complessi proteici e le nanoparticelle. La preparazione di goccioline di questi campioni mediante movimentazione manuale di griglie dal reagente a macchie negative è stata il classico protocollo da più di mezzo secolo. È un processo semplice, ma richiede competenze acquisite attraverso la formazione per il completamento del successo. Ottima colorazione negativa è ancora considerata un set di abilità all'avanguardia e alta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/f couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Tranmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM