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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, descriviamo un metodo che unisce in situ MHC-tetramero colorazione immunoistochimica per determinare la localizzazione, fenotipo e la quantità di cellule T antigene-specifiche nei tessuti. Questo protocollo viene utilizzato per determinare le caratteristiche spaziali e fenotipiche delle cellule CD8 T antigene-specifiche rispetto a strutture in tessuti e altro tipo di cellula.

Abstract

Le cellule T sono fondamentali per molti processi immunologici, compreso rilevazione ed eliminando le cellule infettate da virus, impedendo l'autoimmunità, assistendo nella produzione delle cellule di B e delle cellule di plasma di anticorpi e rilevare ed eliminare le cellule tumorali. Lo sviluppo di MHC-tetramero macchiatura delle cellule T antigene-specifiche analizzate tramite flusso cytometry ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare e comprendere l'immunobiologia delle cellule T. Mentre estremamente utile per determinare la quantità e il fenotipo delle cellule T antigene-specifiche, citometria a flusso non può determinare la localizzazione spaziale delle cellule T antigene-specifiche ad altre cellule e strutture nei tessuti e le attuali tecniche di disaggregazione per estrarre le T cellule necessarie per citometria a flusso hanno un'efficacia limitata in tessuti non linfoidi. In situ MHC-tetramero macchiatura (IST) è una tecnica per visualizzare le cellule T che sono specifiche per gli antigeni di interesse nei tessuti. In combinazione con immunohistochemistry (IHC), IST può determinare l'abbondanza, la posizione e il fenotipo delle cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche nei tessuti. Qui, descriviamo un protocollo per macchiare ed enumerare le cellule CD8 T antigene-specifiche, con specifici fenotipi che si trova all'interno di compartimenti tissutali specifici. Queste procedure sono le stesse che abbiamo usato nella nostra recente pubblicazione da Li et al., intitolato "cellule producenti su Virus dell'immunodeficienza delle scimmie in follicoli sono parzialmente soppresso da CD8+ cellule In Vivo." I metodi descritti sono ampiamente applicabili perché può essere utilizzati per localizzare, fenotipo e quantificare essenzialmente qualsiasi cella di CD8 T antigene-specifiche per cui i tetrameri MHC sono disponibili, in tutto il tessuto.

Introduzione

Le cellule T sono fondamentali per molti processi immunologici, compreso rilevazione ed eliminando le cellule infettate da virus, impedendo l'autoimmunità, assistendo nella produzione delle cellule di B e delle cellule di plasma di anticorpi e rilevare ed eliminare le cellule tumorali. Lo sviluppo del peptide/MHC di classe I tetramero macchiatura di antigene-specifiche le cellule CD8 T1 e il più recente sviluppo di MHC classe II tetramero macchiatura delle cellule di T CD42 tramite flusso cytometry ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare e comprendere la immunobiologia delle cellule T. Mentre estremamente utile per determinare la quantità e il fenotipo delle cellule T antigene-specifiche, citometria a flusso non consente la rilevazione della localizzazione spaziale delle cellule T antigene-specifiche ad altre cellule e strutture nei tessuti e corrente tecniche di disaggregazione per estrarre le cellule T necessari per citometria a flusso hanno limitato l'efficacia in tessuti non linfoidi3.

Noi ed altri abbiamo sviluppato metodi utilizzando peptide-caricato MHC di classe I e classe II tetramer o multimer reagenti per macchiare le cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche in tessuti4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST questi metodi consentono la determinazione della posizione, abbondanza e fenotipo di cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche nei tessuti e forniscono un mezzo per rilevare di queste celle relative altre cellule e strutture nei tessuti. Il nostro gruppo ha utilizzato estesamente MHC-ho tetramero macchiatura per studiare il virus di immunodeficenza umana (HIV) - e virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) - cellule di T di CD8 specifiche nei tessuti linfoidi, genitale e rettale per acquisire una comprensione di HIV e SIV immunopatogenesi e per identificare correlazioni di vaccinazione successo strategie14,15,16,17. Inoltre, abbiamo anche sviluppato una tecnica che combina IST con ibridazione in situ (ISH) di localizzare e quantificare le cellule T CD8 specifici virus e cellule infettate da virus nei tessuti e di determinare i livelli di effettore--obiettivo in vivo 18 , 19.

Qui, descriviamo un protocollo utilizzando peptide-caricato MHC-I tetrameri per macchiare le cellule CD8 T antigene-specifiche nelle sezioni di tessuto fresco, a tessuti controcolorazione con IHC e quantificare le cellule con fenotipi specifici nei compartimenti tissutali specifici. Queste procedure sono le stesse sono state usate nella nostra recente pubblicazione da Li et al., in cui abbiamo determinato la posizione, l'abbondanza e fenotipo delle cellule di T di SIV-specific in tessuto linfoide durante l'infezione cronica di SIV in macachi20.

Per questa procedura, tessuti freschi sono sezionate e incubate durante la notte con caricamento del peptide di MHC-I tetrameri coniugati a molecole di tiocianato di fluorescina (FITC). Quindi sono fissati in paraformaldeide. Dopo aver sistemato il tessuto, il segnale dai tetrameri MHC viene amplificato usando gli anticorpi di coniglio anti-FITC e incubate con anticorpi di IgG di anti-coniglio fluorescente contrassegnati, che amplificano ulteriormente il segnale dai tetrameri associati. IHC è utilizzato in combinazione con IST per caratterizzare le cellule T antigene-specifiche e le cellule circostanti. Gli anticorpi che riconoscono epitopi sulla superficie delle cellule o nello spazio extracellulare sono inclusi in incubazione primaria con i tetrameri. Gli anticorpi che riconoscono epitopi intracellulari richiedono permeazione della parete della cellula prima della colorazione. Le sezioni di tessuto macchiato sono Imaging utilizzando un microscopio confocale e analizzati utilizzando software confocale. Cellule con etichettate vengono quantificate utilizzando software di microscopia confocale o ImageJ. Il protocollo descritto può essere utilizzato a macchiare essenzialmente qualsiasi cellule CD8 T antigene-specifiche in qualsiasi tessuto per cui MHC-I tetrameri sono disponibili.

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Protocollo

1. giorno 1: taglio di tessuto fresco e incubazione primaria

  1. uso un bisturi per tagliare il tessuto fresco in pezzi piccoli (circa 0,5 cm di larghezza di 0,5 cm di altezza). Separatamente ogni tessuto per un pistone per colla e incorporarli con 3-5 mL dell'agarosi di basso-fusione di 4% in PBS. Etichettare il pistone con le informazioni di tessuto usando un adesivo. Metterlo in un supporto refrigerato in un secchio di ghiaccio per solidificare.
  2. Accendere il microtomo e impostare lo spessore delle sezioni a 200 µm. installa una lama di rasoio sulle microtomo e inserire lo stantuffo montato con il tessuto nel bagno microtomo.
  3. Preparare il tampone fosfato salino con eparina (PBS-H) aggiungendo 100 µ g/mL o 18,7 eparina U/mL di PBS per preservare il RNA e per consentire applicazioni ISH potenziali a valle. Riempire la vasca di microtomo, che copre il tessuto incorporato, con 100-120 mL di PBS-h refrigerati, sterile. Aggiungere cubetti di ghiaccio di PBS-H per il bagno per mantenere la temperatura a 0 - 2 ° C. Start il microtomo e tagliare il tessuto in 200 µm sezioni.
    Nota: È importante mantenere i tessuti refrigerati sul ghiaccio per ridurre al minimo l'attività cellulare all'interno dei tessuti e perché tessuto fresco è più facile sezione quando è freddo. PBS da solo può essere utilizzato se non ci sono piani per ISH a valle.
  4. In alternativa, per i tessuti che non tagliano bene con un microtomo (ad es., intestino e polmone), utilizzare un bisturi o una lama di rasoio per tagliare il tessuto in strisce sottili come vicino possibile a 200 µm.
  5. Etichetta il coperchio di piastre di coltura del tessuto 24 pozzetti con le informazioni del campione sperimentale e posizionare gli alloggiamenti di tessuto nei pozzetti corrispondenti. Refrigerati utilizza un pennello per trasferire le sezioni a una camera di tessuto insieme nel pozzetto di una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti contenente 1 mL di PBS-H.
    Nota: Tessuto riutilizzabile camere dovrebbero essere fatto prima di iniziare la colorazione. Alloggiamenti del tessuto possono essere fatto utilizzando una provetta di snap con tappo rotondo-fondo in polipropilene 14 mL e rete metallica. Utilizzare una lama di rasoio affilata per tagliare sul fondo di una provetta di-salvapercussore rotondo-fondo in polipropilene 14 mL. Tagliare la rete metallica in cerchio per essere inserito nel foro nella parte inferiore del tubo. Calore il cerchio di maglia di filo con un becco Bunsen fino a quando è rovente. Impostare il cerchio di maglia di filo molto rapidamente e spingere il tubo sulla mesh. Verificare che la rete metallica è saldamente fissato alla parte inferiore del tubo e poi accuratamente tagliato fuori dalla parte superiore del tubo presso il marchio di 3 mL utilizzando una lama di rasoio affilata. Inserire fino a 3 sezioni di tessuto in ogni camera di tessuto, o fino a 1 cm 2 di tessuto per pozzetto. Mantenere almeno un pozzo vuoto tra pozzetti con combinazioni di diversi anticorpi per evitare la contaminazione incrociata.
  6. Procedere al primario tetramero e anticorpo che macchia immediatamente dopo aver terminato il trasferimento di tutte le sezioni di taglio negli alloggiamenti del tessuti. Mantenere le sezioni sommerso e refrigerati in 1 mL di PBS-H a tutte le ore.
  7. Incubare le sezioni di tessuto durante la notte con 0,5 µ g/mL di coniugato FITC, peptide-caricato MHC-I tetrameri diluiti in PBS-H con 2% di siero di capra normale (NGS). Includono mouse o altri non-coniglio anticorpi direzionati alle epitopi extracellulari di interesse in questa incubazione (per esempio, gli anticorpi di anti-CD8 ratto diluito 1: 500 in PBS-H con 2% NGS). Posizionare 1 mL di anticorpi diluiti in ciascun pozzetto.
    Nota: Occorre prestare attenzione quando si selezionano gli anticorpi CD8, come alcuni possono migliorare e alcuni in grado di inibire i tetrameri MHC vincolante a cellula T recettori 4 , 21. L'anticorpo di CD8 anti-umano di ratto descritto qui è instabile e a volte risulta in colorazione un po' debole. È usato qui per etichettatura triple perché è l'unico non-coniglio e CD8 non-anticorpo testato che le cellule T CD8 di macaco rhesus macchiato.
  8. Utilizzare 1 mL di soluzione ogni pozzetto per l'anticorpo primario e tutti i successivi incubazioni ed eseguire questo e tutti i successivi dopo incubazione a 4 ° C, con le piastre su una piattaforma a dondolo.
    Nota: Tessuti devono galleggiare liberamente nella camera.

2. Giorno 2: Fissazione e incubazione secondario

  1. dopo l'incubazione primaria, lavare le sezioni due volte con 1 mL di PBS-H refrigerati per 20 min ogni lavaggio. Fare questo trasferendo gli alloggiamenti del tessuto ad una piastra di coltura di tessuti diversi 24 pozzetti contenente 1 mL di PBS-H refrigerati nei pozzetti corrispondenti.
    Nota: Fare attenzione a non gocciolare contenuto da un campione sperimentale in un altro, quando si spostano tra camere di tessuto. Per tutte le successive incubazioni e lavaggi, allo stesso modo trasferire camera del tessuto per un piatto pulito contenente la soluzione appropriata. Assicuratevi di controllare le sezioni negli alloggiamenti del tessuto durante la procedura per assicurarsi che le sezioni non si blocca ai lati delle sezioni del tessuto. Se essi, spingere indietro nella soluzione.
  2. Fissare le sezioni con 1 mL di fresco paraformaldeide 4% tamponata con PBS per 2 h a temperatura ambiente (non sopra-difficoltà). Lavare con PBS freddo-H due volte per 5 min.
    Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare adeguati dispositivi di protezione personale.
    Nota: Se il ricupero dell'antigene e permeabilizzazione è necessario per rilevare gli epitopi intracellulari, antigeni possono essere recuperati facendo bollire le sezioni nell'urea di 0.01 mol dopo la fissazione del paraformaldeide.
  3. Trasferire le sezioni in piastre di coltura 24 pozzetti contenenti 0,01 mol urea e collocare questi piatti nel forno a microonde. Bollire le sezioni tre volte per circa 10 s ciascuno, per un totale di 30 s.
    Nota: State molto attenti, come bollire la soluzione possibile forzare le sezioni dalle fonti. Se questo accade, è possibile utilizzare un pennello a riportare le sezioni dai lati della camera del tessuto o dal coperchio della piastra nella parte inferiore della camera del tessuto appropriato.
  4. Prima per l'incubazione di anticorpo secondario, permeabilize e bloccare le sezioni di tessuto di incubarle in blocco soluzione contenente PBS-H, 0,3% detergente (PBS-H-T) e 2% NGS su un rocker per 1 h a 4 ° C. eseguire successive le incubazioni dell'anticorpo con NGS PBS-H-T/2%.
  5. Per l'incubazione secondaria, trasferire le sezioni negli alloggiamenti del tessuto a pozzetti contenenti coniglio anti-FITC anticorpo diluito 1: 10.000 in PBS-H-T/2% NGS. Incubare per una notte.
  6. Eseguire una colorazione di contrasto utilizzando anti-CD20 anticorpo diluito 1: 200 in PBS-H-T/2% NGS. Per questa opzione, recuperare gli epitopi se necessario, permeano le cellule e bloccare prima del termine dell'incubazione, come descritto in precedenza.

3. Giorno 3: Terziario incubazione

  1. dopo la seconda incubazione, lavare le sezioni tre volte in PBS-H a 4 ° C per almeno 20 min.
  2. Eseguire un'incubazione finale con l'appropriato con l'etichetta fluorescente anticorpi (ad es., capra anti-coniglio coniugato giallo-verdastro, colorante lontano rosso coniugati di capra anti-ratto e capra anti-topo coniugata colorante verde anticorpi diluito 1:5, 000, 1:5, 000 e 1:2, 000, rispettivamente, in PBS-H-T/2% NGS). Incubare per una notte.
    Nota: A questo punto, l'incubazione può essere estesa fino a tre giorni se necessario. Mantenere le sezioni protette dalla luce avvolgendo le piastre in carta stagnola durante questo incupassaggio di Angela e, successivamente, come luce disseta fluorofori.

4. Giorno 4: Montaggio delle sezioni

  1. lavare le sezioni tre volte in PBS-H per almeno 20 min.
    Nota: Se la pianificazione per downstream ISH 19, fissare le sezioni in paraformaldeide al 4% per 1 h per garantire i tetrameri e anticorpi in luogo e poi lavare le sezioni due volte con PBS-H per 5 minuti ciascuno.
    Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare adeguati dispositivi di protezione personale.
  2. Utilizzare un pennello per trasferire le sezioni su un vetrino da microscopio. Fare attenzione a non colpire il tessuto troppo. Spalmate ogni sezione glicerolo/gelatina contenente 4 mg/mL n-propyl gallate o un altro mezzo di montaggio contenente un fluoroforo conservante. Coprire con un vetrino coprioggetti.
  3. Conservare i vetrini in un contenitore protetto da luce diapositiva a -20 ° C. lavare le piastre di coltura del tessuto e rimuovere le etichette sui coperchi utilizzando alcool.
    Nota: Le piastre possono essere riutilizzate.

5. Acquisizione di immagini al microscopio confocale

  1. cattura immagini ad alta risoluzione con un microscopio confocale, utilizzando il laser appropriato e filtri per ogni fluoroforo ( Figura 1A e B).
    Nota: In questo esempio, (Vedi la Tabella materiali) è stato utilizzato un microscopio confocale. Immagini sono state raccolte utilizzando il 561 nm laser al 20% di energia per le cellule di T antigene-specifiche con etichetta giallo verdastre, il laser di 488 nm a potenza del 10% per le cellule di B che esprimono CD20 con etichetta verde e il laser di 640 nm a 15% di potenza per le cellule di T di CD8 lontano rosso-etichettati. Sono stati utilizzati il 20X obiettivo e un'apertura numerica di 0.8.
  2. Raccogliere in sequenza di intervalli di z-serie a 3 µm (o altro) nei tre canali in più campi di 800 x 800 pixel. Costruire un montaggio dei campi raccolti ( Figura 1 -E). Nome di ogni immagine di montaggio sulla base delle informazioni della diapositiva corrispondente e salvare per l'analisi.
  3. Eseguire analisi quantitativa delle immagini utilizzando il software di analisi e quantificazione del rispettivo microscopio confocale o ImageJ.

6. Analisi quantitativa delle immagini

Nota: analisi quantitativa delle immagini possono essere realizzato utilizzando software di analisi e quantificazione del microscopio confocale o utilizzando il software ImageJ. Qui, ImageJ è stata usata come esempio.

  1. Open al confocale montage trascinandolo nella finestra di ImageJ ( Figura 2A).
    Nota: ImageJ può aprire direttamente raccolti da molti microscopi confocali diversi montaggi. Se il montaggio non può essere aperto direttamente da ImageJ, esportare il z-scan selezionato come file TIFF per aprire it.
  2. Duplicare la z-scan selezionato per l'analisi (" immagine "-> " duplicare ") ( Figura 2B).
  3. Dividere i diversi canali (" immagine "-> " colore "-> " canali Split ") ( Figura 2).
  4. Disegnare il ROI per l'analisi quantitativa nel canale corrispondente per essere obiettivo e aggiungerlo al gestore di ROI premendo " T " sulla tastiera. Misurare l'area.
    Nota: Il gestore di ROI di ImageJ Mostra l'area in µm 2 ( Figura 2D).
  5. Regolare la fluorescenza luminosità e contrasto del canale da analizzare (" immagine "-> " regolare "-> " luminosità/contrasto ") ( Figura 2E).
  6. Appiattire il ROI sull'immagine (" manager ROI "-> " Flatten ") ( Figura 2F).
  7. Quantificare le cellule positive nell'immagine utilizzando il " multi-punto " strumento ( Figura 2).

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Risultati

Figura 1 Mostra come raccogliere immagini confocal utilizzando un microscopio confocale. Nella figura 2 viene illustrata l'analisi quantitativa immagine usando ImageJ. Figure 3 e 4 indicano rappresentante immagini dei tessuti di linfonodo da un SIV infettati macaco rhesus macchiato con tetrameri MHC, CD8 anticorpi e anticorpi CD20 e servono a dimostrare la specificità della MHC-tetramero coloraz...

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Discussione

IST combinato con IHC fornisce uno strumento essenziale per rilevare, caratterizzare e quantificare le cellule CD8 T antigene-specifiche in ambienti nativi con il contesto di altre cellule e strutture del tessuto. Qui, abbiamo descritto le procedure dettagliate per IST combinato con IHC, seguita da analisi dell'immagine quantitativa, per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T CD8 antigene-specifiche nei linfonodi da macachi rhesus. Macchiatura simile può essere applicata all'essere umano, del mou...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato dal servizio di sanità pubblica concede dal National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
MHC-I monomerNIH tetramer core facilityMaterials for MHC-tetramer preparation
ExtrAvidin-FITCSigma-AldrichE2716Materials for MHC-tetramer preparation
Normal goat serumJackson Immunoresearch005-000-121
Low melt agarosePromegaV3121
HeparinSigma-AldrichSLBL6391V
Triton X-100Sigma-AldrichT-6878
UreaJ.T.Baker4204-05
Glycerol gelatinSigma-AldrichSLBH2672V
n-propyl gallateSigma-AldrichP3130
rat-a-h-CD8 (1:500)Acris0714Antibody unstable, use single use frozen aliquot
m-a-h-CD20 (1:500)NOVOCASTRA6026819
m-a-h-Ki67 (1:500)Vector6022201
goat-a-m-A488 (1:2,000)Jackson Immunoresearch124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5,000)Jackson Immunoresearch106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5,000)Jackson Immunoresearch118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000)Jackson Immunoresearch86579
Compresstome: VF-300 MicrotomePrecisionary Instruments, LLC1079
Quick Set Instant AdhesiveLoctite46551
24-well flat bottomed tissue culture platesFalcon353226
Microscope slideGlobe scienfitic Inc.#1321
Razor  bladeTed Pella, Inc121-6
Feather Disposable ScalpelFEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.No. 21
Round paintbrush #2PRINCETON ART & BRUSH CO.4350RCan trim as needed with razor
Confocal MicroscopeOlympusFV1000
FV10-ASW_Viewer4.0Olympus

Riferimenti

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