Registrazione in tempo reale In Vivo di Arabidopsis segnali di calcio durante l'alimentazione dell'insetto utilizzando un biosensore fluorescente

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo semplice per analizzare segnali di calcio negli impianti generati da insetti Pentatomomorfi, come gli afidi. Thaliana di Arabidopsis trasformate con il biosensore di calcio GFP GCaMP3 consentire per l'imaging in tempo reale in vivo della dinamica del calcio con un'alta risoluzione temporale e spaziale.

Abstract

Gli ioni di calcio sono preveduti per essere chiave segnalazione entità durante le interazioni biotiche, con segnalazione del calcio che formano parte integrante della risposta di difesa della pianta di elicitori microbiche e di ferite causate da insetti, suscitando sistemica del calcio da masticare segnali in piante. Tuttavia, il ruolo del calcio in vivo durante stress biotico è ancora poco chiaro. Questo protocollo descrive l'uso di un sensore di calcio geneticamente codificato per rilevare segnali di calcio nelle piante durante l'alimentazione da un parassita ematofago. Emitteri come gli afidi perforare un piccolo numero di cellule con specializzato, succhiare apparato boccale, che li rende lo strumento ideale per studiare la dinamica del calcio quando una pianta si trova ad affrontare uno stress biotico, che è distinto da una risposta al ferimento di forma allungata. Inoltre, biosensori fluorescenti stanno rivoluzionando la misurazione di segnalazione molecole in vivo negli animali e piante. Esprimendo un biosensore GFP-basato del calcio, GCaMP3, nella pianta modello Arabidopsis thaliana consente l'imaging in tempo reale della dinamica del calcio pianta durante insetto alimentazione, con un'elevata risoluzione spaziale e temporale. Un dosaggio ripetibile e robusto è stato sviluppato utilizzando la microscopia a fluorescenza di foglie GCaMP3 distaccate, consentendo per la misurazione continua della dinamica del calcio citosolico prima, durante e dopo l'alimentazione dell'insetto. Questo rivela un'elevazione di calcio rapida altamente localizzato intorno l'afide alimentazione sito che si verifica in pochi minuti. Il protocollo può essere adattato ad altri stress biotici, come altre specie di insetti, mentre l'uso di Arabidopsis thaliana permette la rapida generazione di mutanti per facilitare l'analisi molecolare del fenomeno.

Introduzione

Calcio (Ca^{2 +}) è uno degli elementi più onnipresenti segnalazione nelle piante. Un aumento transitorio nella concentrazione citosolica di Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_cyt) viene decodificato da una complessa rete di componenti a valle ed è coinvolto nella risposta a entrambi stress abiotici e biotici^1,2. Un aumento in [Ca^{2 +}]_cyt è una delle risposte prime di elicitori microbiche, formando una parte comune della pianta difesa risposta^3,4,5. Aumenti in [Ca^{2 +}]_cyt sono stati osservati anche in risposta al ferimento causato da masticare insetti, come lepidotteri^6,7. Tuttavia, il ruolo potenziale della pianta Ca^{2 +} segnali in risposta a vivere minacce biotiche che danneggiano solo poche cellule non è stato esplorato. L'afide verde pesco Myzus persicae è un insetto ematofago che rappresenta una grave minaccia per il mondo dell'agricoltura^8,9, e Ca^{2 +} efflusso dallo spazio extracellulare è stata osservata in foglie infestata da M. persicae¹⁰. Questo illustra protocollo un metodo affidabile e ripetibile per misurare pianta Ca^{2 +} segnali mentre M. persicae feed da foglie usando un fluorescente^{2 +} biosensore, di Ca con sia gli afidi e GCaMP3 offrendo nuovi strumenti con cui sezionare il ruolo del Ca^{2 +} durante interazioni biotiche.

CA^{2 +}-microelettrodi selettivi sono stati già utilizzati per misurare [Ca^{2 +}] in piante^11,12. Più recentemente, approcci bioluminescenti e fluorescenti sono diventato standardizzati. Questi biosensori legano Ca^{2 +} ed emettono luce, permettendo di non-parallelo opportunità per studiare Ca^{2 +} dinamica in tutta tessuti e cellule. Biosensori^{2 +} CA possono essere iniettati come coloranti o stabilmente prodotto dopo l'introduzione del biosensore codifica sequenza nel genoma dell'organismo tramite trasformazione (cioè, geneticamente codificato biosensori). Quest'ultimo offre i principali vantaggi di essere facilmente espressa nel tessuto vivo e in grado di localizzazione subcellulare¹³. La proteina equorina, isolata da Aequorea victoria (Medusa) era il primo codificato geneticamente Ca^{2 +} biosensore distribuito in piante¹⁴. Come una proteina bioluminescente, equorina non richiede eccitazione da luce esterna, che evita il cromoforo candeggio e autofluorescenza¹⁵. Aequorina è stato usato con successo per misurare flussi [Ca^{2 +}] in risposta a vari stimoli, tra cui temperatura¹⁶, agenti patogeni^17,18,19, sale lo stress^{20 ,21}e ferendo⁷. Tuttavia, esso è svantaggiata dalla intensità del segnale relativamente basso, rendendo la rilevazione dei flussi [Ca^{2 +}] in singole celle e dai tessuti con sensore scarsa espressione difficile¹³.

Lo sviluppo di Ca^{2 +} biosensori che può essere flourescente ha completato equorina, consentendo una dettagliata analisi subcellulare e livello del tessuto di Ca^{2 +} dinamiche. Uno del più comuni biosensori fluorescenti sono il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET)-base Cameleons. FRET Cameleons sono composti da due proteine, in genere PCP e YFP, che entrano in stretto contatto del cambiamento conformazionale indotto dal legame di Ca^{2 +} a un dominio di calmodulina nella regione linker CFP-YFP. Questo contatto permette il trasferimento di energia da CFP di YFP, e il conseguente cambiamento di fluorescenza di questi fluorofori permette la quantificazione accurata della [Ca^{2 +}] attraverso il calcolo del rapporto tra i segnali di fluorescenza da due fluorofori²². FRET Cameleons sono superiori ai coloranti fluorescenti equorina e non-raziometrici, quanto sono che meno colpiti dal livello di espressione della proteina²³ e spesso hanno una maggiore resa fluorescente, permettendo per imaging cellulare e subcellulare²³. Ad esempio, FRET Cameleons sono stati recentemente utilizzati per identificare a distanza Ca^{2 +} segnali in piante e risolvere questi al livello cellulare^24,25,26.

Un'innovazione recente con servizio fluorescente^{2 +} biosensori per Ca basata su GFP è stato lo sviluppo di biosensori altamente sensibile singolo-fluoroforo (singolo-FP). Singolo-FP biosensori sono costituiti da un singolo circolarmente permutato GFP legata ad una calmodulina e peptide di M13, con Ca^{2 +} associazione a calmodulina, causando così una reazione acqua-mediata tra calmodulina e GFP protonare GFP e aumento rendimento fluorescente^27,28,29. Singolo-FP sensori offrono parecchi vantaggi sopra Cameleons FRET, tra cui disegno sperimentale più semplice e una risoluzione temporale potenzialmente maggiore di imaging³⁰. Anche se single-FP sensori non possono quantificare assoluto [Ca^{2 +}] semplicemente come come sensori di FRET, sono superiori per l'analisi della dinamica temporale e spaziale del Ca^{2 +} segnali^5,23. GCaMPs sono uno dei sensori di singolo-FP affermati²⁸ e hanno subito diverse revisioni per migliorare il loro rendimento fluorescente, gamma dinamica, Ca^{2 +} affinità e rapporti segnale-rumore^{31,32 , 33 , 34}. the GCaMPs sono stati utilizzati con successo in sistemi animali, come zebrafish motoneuroni³⁵ e frutta Vola giunzioni neuromuscolari³⁴. Mutagenesi casuale di GCaMP3 ha provocato ulteriori classi di singolo-FP sensori, tra cui il GCaMP6 ultrasensibile³⁶ e il GECOs²⁹. La GECOs recentemente sono stati utilizzati in Arabidopsis thaliana (d'ora in poi denominato Arabidopsis) per misurare Ca^{2 +} flussi in risposta all'ATP, la chitina e la flg22 batterica elicitori. Questo studio ha anche dimostrato che il biosensore R-GECO ha superato il FRET Cameleon YC3.6 in termini di segnale massima cambiamento e signal-to-noise ratio⁵.

A causa della facilità di uso, fluorescente ad alto rendimento e alta risoluzione temporale che può essere raggiunto con GCaMP biosensori, GCaMP3 geneticamente codificato in Arabidopsis sotto il promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore . Gli strumenti genetici disponibili per la ricerca di Arabidopsis consentono l'analisi molecolare dettagliata del Ca^{2 +} segnale misurato da GCaMP3. Inoltre, il biosensore GCaMP3 possa essere visualizzato sotto un microscopio a fluorescenza, piuttosto che un più costoso sistema confocale. Questo protocollo consente tutto-tessuto di imaging, essenziale quando conducendo esperimenti con stress biotici dal vivo. L'esperimento è progettato tali che foglie distaccate da piante di 35S::GCaMP3 sono fatto galleggiare in acqua, per impedire la fuga dell'insetto e per limitare l'alimentazione ad un tessuto specifico. Il metodo descritto in questo documento permette quindi l'analisi di foglia dynamics^{2 +} Ca durante l'alimentazione di M. persicae, conseguente la caratterizzazione di un novello della pianta risposta di segnalazione. Questo metodo può anche essere adattato per funzionare con altri stress biotici, come altre specie di insetti e microrganismi patogeni e con altri tessuti vegetali, come le radici.

Protocollo

1. preparazione della pianta (giorni 1 - 4)

1. il giorno 1, sterilizzare 35S::GCaMP semi utilizzando tre lavaggi di etanolo di 75%, 1 min per lavare e piastra li su 100 mm ² quadrato piatti di plastica con ¼-forza Murashige e Skoog (MS) medio (ricetta: 1,1 g di mezzo di Murashige e Skoog, 7,5 g di saccarosio, 10 g di agar agar Formedium e 1 L di acqua deionizzata) ³⁷.
2. Stratificare i semenzali nel buio per tre giorni a 8 ° C per ottenere la germinazione sincrono.
3. Il giorno 4 dell'esperimento, spostare le piantine di GCaMP in una camera di ambiente controllato (CER) a 23 ° C, con un fotoperiodo di scuro luce e 8 h 16 h.

2. Allevamento dell'insetto (giorni 11 - 12)

1. il giorno 11 di questo esperimento, aggiungere 15 adulto M. persicae a piante di Arabidopsis coltivate in terreno di 5-settimana-vecchio utilizzando un artista umido ' pennello s (dimensione 2 o 4) (coltivato in un'area CER a 22 ° C con 10 h luce e 14h scuro photoperio d).
2. gabbia gli afidi sulla pianta inserendo tubi in plastica trasparente (10 x 15 cm) intorno alla pianta e il tappo con un coperchio di plastica.
3. Lasciare le piante infestate dagli afidi per 24 h in un'area CER a 22 ° C con un 16-h luce e fotoperiodo scuro 8-h.
4. Il giorno 12 dell'esperimento, rimuovere tutto l'adulto M. persicae utilizzando un pennello.
   Nota: Gli insetti possono essere visto ad occhio sulla pianta. Questo dà una popolazione di ninfe con una simile età evolutiva. All'incirca 1 Ninfa per adulto sarà prodotta durante questo periodo.
5. Lasciare le piante infestate in una CER di basso-temperatura a 16 ° C, con un 8 h luce e 16h scuro fotoperiodo, per impedire l'aumento delle dimensioni troppo rapidamente le ninfe.

3. Foglia di distacco (giorno 19)

1. il giorno 19 dell'esperimento, rimuovere le piantine 35S::GCaMP3 dal CER e staccare la foglia più grande da ogni pianta usando un paio di forbici affilate.
2. Utilizzando un paio di pinzette, posizionare la foglia staccata nel pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenenti 300 µ l di acqua distillata, abbagliai superficie rivolta verso l'alto. Ripetere per altre foglie ( Figura 1).

Figura 1: analisi di foglia di 35S::GCaMP3. La foglia più grande da ogni piantina Arabidopsis 16 giorno-vecchio 35S::GCaMP3 è staccata e fatto galleggiare su 300 µ l di acqua distillata in una piastra a 96 pozzetti. Foto scattata il giorno dopo il distacco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. coprire la piastra in involucro di plastica trasparente e foglio di alluminio e lasciare a temperatura ambiente durante la notte per consentire lo stress del distaccamento a placarsi.

4. microscopia a fluorescenza (giorni 20 - 22)

1. il giorno 20 dell'esperimento, rimuovere la piastra a 96 pozzetti dal foglio di alluminio e trasferirlo in un microscopio stereoscopico di fluorescenza. Configurare il microscopio a fluorescenza stereo per eccitare GFP con una luce di 450-490 nm e per catturare l'emissione fluorescente tra 500 e 550 nm.
2. Raccogliere gli afidi invecchiati dalla colonia fondata il giorno 11 rimuovendo la pianta dal terreno e collocandolo in una scatola trasparente con un coperchio. Tenere gli insetti contenuti nella casella durante l'esperimento.
3. Posto la piastra a 96 pozzetti sotto il microscopio. Alterare l'esposizione alla luce fino alla fluorescenza di GCaMP3 possa essere visualizzata chiaramente nelle vene delle foglie distaccate. Mantenere l'esposizione costante per tutti gli esperimenti; per il protocollo attuale, un'esposizione di 1-s è stata utilizzata con un guadagno di 3.5 ( Figura 2).
4. Regolare l'ingrandimento e zoom del microscopio in modo che 4 pozzi possono essere osservati in un fotogramma; per il protocollo attuale, è stato utilizzato un 7,8 X ingrandimento e un fuoco di-127,8330 mm.
5. Trasferire un afide una foglia staccata al microscopio, usando un pennello umido. Posa una foglia adiacente non trattata come un controllo, ma toccare leggermente con il pennello per imitare la toccante che si verifica durante il trasferimento dell'afide. Ricordarsi di posizionare l'involucro di plastica sulla parte superiore della piastra a 96 pozzetti durante microscopia per impedire la fuga di insetto.
6. Iniziare la registrazione di fluorescenza delle foglie a coppie (1 afide-trattati e non trattati 1) cliccando " inizio esperimento " nel software incorporato microscopio ( Figura 2). Registrare misurazioni per 50 min.
   Nota: per il protocollo attuale, un intervallo di tempo di 5 s tra misurazioni è stato utilizzato.
7. Dopo 50 min, interrompere la registrazione cliccando su " interrompere esperimento " e rimuovere l'afide dalla foglia. Le misure di fluorescenza di salvare come file di immagine (ad esempio, TIFF tagged image file format,).
8. Ripetere l'esperimento con altre coppie di foglie; imaging può essere esteso per 2 paia di foglie di immagine contemporaneamente, consentendo la formazione immagine simultanea di 2 genotipi.

5. Raccolta di dati

1. importare i file di immagine in Fiji (figura J) e convertirli in 32 bit cliccando su " immagine " > " tipo " > " 32-bit; " questo consente per la conversione delle immagini in video heatmap (vedi step 7).
2. Scartare i campioni in cui gli afidi non accontentano in un'unica posizione per più di 5 min visualizzando il movimento dell'insetto sotto il microscopio.
   Nota: Questa è spesso la maggior parte dei campioni, e fino a 100 trattamenti potrebbe essere necessario trovare 30 campioni espositrici successo sedimentazione.
3. Impostare la scala di misurazione in pixel (o Converti in mm, se noto) e il lasso di tempo per lo stesso intervallo di tempo utilizzato durante la microscopia facendo clic su " immagine " > " Properties. "
4. Utilizzando il cursore, posizionare una regione di interesse (ROI) intorno all'area del tessuto per l'analisi GFP.
   Nota: Nel protocollo attuale, una circolare ROI 50 pixel (0,65 mm) di diametro è stato utilizzato in 3 posizioni di interesse: l'afide alimentazione sito (Fs), una regione sistemica sulla nervatura centrale della foglia (Sm) e una regione sistemica adiacente la nervatura centrale (" laterale del tessuto " Sl) ( Figura 2).
   1. Creare il ROI disegnando un ovale (utilizzare il " strumento ovale ") e modificare la dimensione utilizzando " modificare " > " selezione " > " specificare. " vedere la Figura 2.
5. Per il controllo non trattato, selezionare ROIs in regioni paragonabili della foglia a quelli selezionati sulla foglia trattata (vale a dire, la stessa regione della foglia come dove l'afide nutriti sulla foglia trattata) ( Figura 2).

Figura 2: analisi al microscopio di fluorescenza GCaMP3. Sinistra: foglia di controllo non trattato. A destra: afide-trattati foglia. Il sito di alimentazione afide è indicato con una freccia. Barra della scala = 1 mm. (A) immagine del campo luminoso. Ingrandimento: 7,8 X, fuoco:-127,8330 mm, esposizione: 1 s. (B) GFP immagine decorareng ROIs utilizzato per l'analisi quantitativa della fluorescenza. FS = sito di alimentazione, Sm = sistemica nervatura centrale, Sl = sistemica del tessuto laterale. Ingrandimento: 7,8 X, fuoco:-127,8330 mm, esposizione: 1 s. La GFP è stata eccitata con una lampada ad alogenuri metallici di 450 a 490 nm, ed emissione fluorescente è stato catturato tra 500 e 550 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. utilizzare il plugin di Time Series Analyzer cliccando " plugin " > " Time Series Analyzer " per analizzare i valori di fluorescenza crudo (F) nel ROI nel tempo. Aggiungere il ROI di interesse (" Aggiungi [t] "). Assicurandosi che il ROI è selezionato, selezionare " ottenere media; " Questo visualizzerà una tabella di valori di F per ogni frame in quel ROI.
7. Copiare i dati in un foglio elettronico.
8. Calcolare l'area del sito alimentazione segnale selezionando prima la regione con il " strumento selezione a mano libera. " delineare il massimo segnale GFP e quindi calcolare l'area di questa forma cliccando " Analyze " > " misura. "
9. Calcolare la velocità del segnale sito alimentazione utilizzando il plugin MTrackJ facendo " plugin " > " Tracking " > " MTrackJ. "
   1. clic sulla " Aggiungi " pulsante e quindi scegliere il cursore al centro della il segnale quando in primo luogo è visibile. Clicca nuovamente sul bordo del segnale al relativo punto di ulteriore diffusione. Fare clic su " misura " per calcolare la velocità del segnale.

6. Analisi dei dati

1. definire il punto di afide sedimentazione giocando attraverso le cornici delle immagini dal microscopio in Fiji.
   Nota: Il tempo di sedimentazione è il telaio durante il quale l'afide rimane in un'unica posizione per 5 minuti o più. La durata della sedimentazione di eventi può essere calcolata anche dalle immagini in Fiji.
2. Normalizzare i dati F (ΔF/F) secondo l'equazione ΔF/F = (F - F ₀) / f ₀, dove F ₀ è la fluorescenza basale medio calcolato dalla media di F sopra i primi 60 fotogrammi della registrazione prima dell'afide si stabilirono. Ripetere l'operazione per il controllo non trattato.
3. Tracciare la fluorescenza di GFP normalizzata (ΔF/F) nel tempo per quel ROI nella foglia trattata e non trattata. Scartare i campioni (entrambe le ante), se al controllo non trattato Mostra grande Ca ^{2 +} transitori (cioè, ΔF/F aumenta sopra 0.2).
4. Ripetere fino ad almeno 20-30 vitali campioni sono stati analizzati per genotipo.

7. Creazione di Video di tempo-corso

1. convertire l'immagine a 32-bit file in heatmaps usando il plugin NucMed_Image LUTs cliccando " plugin " > " NucMed " > " tabelle di Lookup. " nel menu tabelle di ricerca, selezionare " blu rosso verde " per convertire le immagini in calore maps.
2. Migliora il contrasto tra l'heatmap per evidenziare la GFP afide-suscitata segnali utilizzando " processo " > " migliorare il contrasto " > " regolare saturi pixel %. "
3. Aggiungere informazioni di tempo utilizzando il plugin di tempo Stamper cliccando su " plugin " > " tempo Stamper ". Impostare il " orario di inizio " alle " 0 " e il " intervallo " base all'intervallo di tempo utilizzato per la microscopia (ad es., 5 s).
4. Esportare questo video come un audio video interleaved (AVI) file.
   Nota: Questo video può quindi essere modificato ulteriormente in altri pacchetti software (ad esempio, Microsoft Movie Maker).

Risultati

Figura 3 e Figura 4 sono rappresentante risultati da un esperimento confrontando una foglia di afide-trattati con un controllo non trattato. Un aumento altamente localizzato in fluorescenza GFP può essere visto nei dintorni del sito di alimentazione in pochi minuti nella maggior parte dei campioni, mentre il Ca^{2 +} dinamica nel controllo non trattato foglia soggiorno relativamente stabile (Figura 3A e 3B). È anche possibile osservare aumenti secondari in fluorescenza di GFP dopo il picco iniziale in alcuni esperimenti (Figura 3B). Fino al 50% delle foglie trattate, gli afidi non accontentano e i campioni dovrebbero essere eliminati. Dei campioni in cui sedimentazione si verifica, 27% di campioni non manifestano chiaro aumenta in fluorescenza di GFP intorno del sito di alimentazione (Figura 3 e tabella 1); di conseguenza, 25-30 campioni replicati dovrebbero calcolare la media per l'analisi quantitativa. Visualizzazione dell'area e la velocità dell'alimentazione elevazione sito [Ca^{2 +}]_cyt dovrebbe rivelare un segnale di circa 110 µm che viaggiano a 6 µm/s (tabella 1). Inoltre, nessun [Ca^{2 +}]_cyt elevazioni dovrebbero essere rilevate sistematicamente all'interno della foglia sul trattamento dell'afide, nella nervatura centrale sistemica (Figura 4A) o le regioni di tessuto laterale sistemica (Figura 4B). Un campione rappresentativo della [Ca^{2 +}]_cyt dinamica nel corso del tempo è mostrato nel Video 1. Inoltre è possibile analizzare il comportamento di sedimentazione di afide tracciando il numero e la durata dei singoli eventi di sedimentazione sotto il microscopio. Risultati rappresentativi per questi comportamenti sono riportati nella tabella 1, dimostrando che gli afidi prendere circa 10 min prima di stabilirsi, e quando si installano correttamente, questo dura in media per 20 min. Di conseguenza, gli insetti sono depositati in un'unica posizione per l'interezza dell'elevazione [Ca^{2 +}]_cyt .

Figura 3: GCaMP3 può essere utilizzato per rilevare afide-suscitata Ca^{2 +} segnali presso il sito di alimentazione a fogli staccati. Sinistra: rappresentante tracce (n = 30) di fluorescenza GFP normalizzato (ΔF/F) nei dintorni del sito di alimentazione di una foglia di 35S::GCaMP3 . Le tracce visualizzare 5 min prima di stabilirsi fino a 25 min post-sedimentazione. Controllo = posizione equivalente su una foglia di non trattata 35S::GCaMP3 . Destra: immagine stereomicroscopio rappresentativo della [Ca^{2 +}]_cyt elevazione visto in giro un afide sito su una foglia di 35S::GCaMP3 di alimentazione. La fluorescenza di GFP è color-coded secondo la scala di inserto. L'id di afide delineato in bianco e del sito di alimentazione indicato con una freccia. Ingrandimento: 7,8 X, fuoco:-127,8330 mm, esposizione: 1 s. La GFP è stata eccitata con una lampada ad alogenuri metallici di 450 a 490 nm e l'emissione fluorescente è stato catturato tra 500 e 550 nm. (A) un esempio di un grande afide [Ca^{2 +}]_cyt elevazione indotta. (B) un esempio di una media indotta da afide [Ca^{2 +}]_cyt elevazione. (C) un esempio di nessun afide [Ca^{2 +}]_cyt elevazione indotta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parametro	Media (± SEM)
[Ca2 +] CYT elevazione
Percentuale di campioni visualizzati da un'elevazione dicyt [Ca2 +]	73%
Velocità del fronte d'onda un	5,9 µm/s (± 0.6)
Area massima di diffusione	110 µm2 (± 18)
Comportamento di afide
Numero di settles (> 5 min)	2 (± 0,1)
Numero totale di settles (tutte le durate)	3.8 (± 0,4)
Tempo si stabilì per l'imaging di b	20 min (± 2)
Tempo fino al primo settle c	11 min (± 1.4)
Percentuale del tempo totale trascorso depositato	62% (± 3)

Tabella 1: [Ca^{2 +}]_cyt elevazione e parametri di comportamento di afide durante 35S::GCaMP3 Imaging. Parametri calcolati da campioni vitali quali illimpidimento > 5 min si è verificato. (A) velocità del segnale visibile dal punto di inizio per il punto più lontano della diffusione. (B) durata degli eventi sedimentazione iniziale utilizzato per l'analisi di fluorescenza. (C) lunghezza di tempo tra l'inizio dell'imaging e dell'afide primo stabilirsi. [Ca^{2 +}] i dati di elevazione di _CYT precedentemente inviati a The Plant Cell (stato attuale: iniziale QC).

Figura 4: GCaMP3 non riesce a rilevare afide-suscitata Ca^{2 +} segnali sistemici per il sito di alimentazione. Rappresentante tracce (n = 30) di fluorescenza GFP normalizzato (ΔF/F) in località sistemica per l'afide alimentazione sito in lascia 35S::GCaMP3. Le tracce visualizzare 5 min prima di stabilirsi fino a 25 min post-sedimentazione. Controllo = posizione equivalente su una foglia di non trattata 35S::GCaMP3 . (A) ΔF/F nella regione sistemica nervatura centrale. (B) ΔF/F nella regione sistemica del tessuto laterale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: GCaMP3 Florescence nel tempo come un feed di afide. La fluorescenza di GFP è color-coded secondo la scala di inserto. La posizione del sito alimentazione afide è indicata con una freccia. Sinistra: foglia di 35S::GCaMP3 esposto a un M. persicae adulto. A destra: Una 35S::GCaMP3 controllo no-afide foglia. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Discussione

Il metodo descritto in questo documento permette l'analisi in tempo reale della pianta di Ca^{2 +} segnalazione durante uno stress biotico come l'alimentazione dell'insetto. Questo dimostra che una delle prime risposte pianta a tali minacce è una localizzata_cyt elevazione [Ca^{2 +}] intorno al sito d'alimentazione dell'insetto. Attraverso l'uso di mutanti, questo metodo consentirà la caratterizzazione fisiologica e molecolare di tali segnali, che non era possibile in precedenza. Un passaggio fondamentale in questo protocollo è quello di assicurare che le foglie distaccate non siano eccessivamente disturbate durante il processo di distacco (punto 3.2) o durante il trasferimento di insetti alle foglie (punto 4.5). Dato che l'attuale protocollo fornisce una misura relativa della [Ca^{2 +}]_cyt , piuttosto che una concentrazione assoluta, è vitale che le impostazioni di microscopio vengono mantenute costanti in tutto l'esperimento. C'è anche il potenziale per la parzialità umana durante la selezione di ROIs e l'analisi dei dati, e come tale, è consigliabile che gli esperimenti vengono condotti in doppio-cieco.

Ci sono diversi vantaggi significativi di misurazione [Ca^{2 +}]_cyt durante stress biotico con questo protocollo. In primo luogo, l'uso di un fluoroforo unico con un alto rendimento fluorescente permette l'imaging essere condotto su uno stereomicroscopio, che è meno costosa rispetto all'utilizzo di un microscopio confocale. L'utilizzo di un fluoroforo unico anche rende e analisi dei dati semplice, come non c'è solo una misura per registrare. Inoltre, l'uso di un microscopio stereoscopico permette per l'imaging di foglie intere, che è essenziale, dato che molte interazioni biotiche, incluse le interazioni pianta-afide, verificano su larga scala spaziale. L'alta risoluzione temporale dell'immagine cattura possibile con GCaMP3, basato sulla dissociazione rapida del Ca^{2 +} dal sensore dopo associazione^23,30 e l'alta resa fluorescente, consente per le misure da adottare fino a ogni 5 s. Inoltre, il dosaggio di foglia non permette la fuoriuscita dell'insetto, una chiave che limita il punto per lo svolgimento di tali esperimenti su piante intere ^{(in preparazione)}. Le foglie distaccate, inoltre, garantire che l'insetto si nutre da un percorso pre-definito, consentendo l'analisi di Ca^{2 +} dinamiche prima, durante e dopo la poppata. Questo protocollo garantisce anche che le foglie delle fasi di sviluppo simili sono usate per analisi.

Lo svantaggio principale di questo protocollo ha origine dall'uso di un biosensore non raziometrici. Con singolo-FP biosensori, variazione nell'emissione di GFP può derivare da variabili sperimentali diversi da [Ca^{2 +}]_cyt, quali cambiamenti di pH cellulare, movimento o il livello di espressione del biosensore. Questi problemi non sono rilevati con FRET Cameleons durante FRET, come il trasferimento di energia da CFP di YFP si verifica solo al momento di legame di Ca^{2 +} . Altre condizioni che alterano le proprietà fluorescenti di singoli fluorophores rischiano di imitare l'avversari cambiamenti nell'intensità della PCP e YFP, e il calcolo di raziometrici utilizzato intrinsecamente normalizza le misurazioni per molti di questi altri artefatti ottico^23,30. Questo rende più affidabile con FRET Cameleons stime di assoluto [Ca^{2 +}]_cyt . Di conseguenza, GCaMP3 è meglio utilizzato come un biosensore per misurare la relativa [Ca^{2 +}]_cyt, anche se è ancora sufficiente rilevare e caratterizzare i fenomeni biologici in piante^{5,(in preparation)}. Pertanto, è essenziale utilizzare i controlli per dimostrare che l'effetto osservato è a causa di Ca^{2 +}, tra cui Ca^{2 +}-correlati mutanti genetici^{(in preparazione)} o Ca^{2 +} canale inibitori farmacologici quali La^{3 +} . D'importanza, singolo-FP biosensori in genere di visualizzare una maggiore resa fluorescente e una maggiore gamma dinamica (vale a dire, un aumento in fioritura al momento di legame^{2 +} Ca) oltre FRET Cameleons²³, che rende più adatto a GCaMP livello del tessuto imaging, mentre Cameleons FRET sono uno strumento utile per l'imaging cellulare con un microscopio confocale^5,25.

Durante l'esecuzione del presente protocollo, è possibile che non si verificheranno alcuni problemi che richiedono la risoluzione dei problemi. Ad esempio, si raccomanda che i campioni in cui i display di controllo (non trattato) foglia grande [Ca^{2 +}]_cyt elevazioni sono scartati (punto 6.3). Tali transitori sono probabilmente il risultato di stress indotto da microscopia. Infatti, la luce blu è noto per suscitare Ca^{2 +} segnali^38,39,40,41, e la luce ad alta intensità potrebbe anche tradursi in temperatura e stress osmotico, entrambi i quali anche suscitare [Ca^{2 +}]_cyt elevazioni^21,25,42. Di conseguenza, per ridurre tali sollecitazioni, è importante per condurre l'esperimento in una stanza ben ventilata e temperatura controllata e per evitare tempi di esposizione inutilmente lunghi. È anche importante per non disturbare le foglie eccessivamente durante il distacco o la microscopia per prevenire tocco-suscitata [Ca^{2 +}]_cyt elevazioni^43,44,45. Possono inoltre verificarsi problemi con la sedimentazione degli insetti. Con M. persicae, gli insetti non si insediano sulle foglie in diversi campioni. Questo potrebbe essere un risultato di difesa ferita-suscitata nelle foglie distaccate^46,47, o la dispersione degli insetti dalla luce blu. Infatti, visione in M. persicae è governata da tre fotorecettori, tra cui uno con un picco di sensibilità di 490 nm⁴⁸. Riduzione dell'esposizione di microscopia e la gestione gli afidi con cura potrebbe ridurre il disagio e favorire la sedimentazione.

Il protocollo descritto nel libro corrente dà nuove intuizioni sulla comprensione dei meccanismi molecolari delle interazioni pianta-insetto e risposta della pianta a stress biotici. Consente la visualizzazione di una delle prime risposte pianta all'alimentazione dell'insetto e facilita ulteriormente le indagini attraverso l'utilizzo di notevoli risorse genetiche Arabidopsis disponibili. Inoltre, questo protocollo consente l'uso di organismi viventi, al contrario di estratti⁴⁹ o elicitori⁵⁰. In futuro, questa tecnica potrebbe essere applicata ad altri stress biotici, come altre specie di insetti, nematodi o microrganismi patogeni, come pure agli stress abiotici. La microscopia di GCaMP3 possa anche essere modificata per altri tessuti vegetali, alternativa ROIs sulla foglia, o anche intere piante di immagine. Inoltre, esiste il rischio potenziale per il biosensore essere geneticaly codificati in altre specie. Di conseguenza, il protocollo descritto in questa carta ha il potenziale per undercover la base molecolare del Ca^{2 +} segnalazione in una gamma di nuove interazioni biotiche tra piante e altre specie.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::GCaMP3 Arabidopsis	John Innes Centre/Universty of Wisconsin	-	Step 1.1
100 mm2 square plastic plates	R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK		For growing GCaMP plants (Step 1.1)
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium	homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water	-	For growing GCaMP plants (Step 1.1)
Col-0 Arabidopsis	-	-	For growing aged aphid colony (Step 2.1)
Myzus persicae(Sulzer)	clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn	-	Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1)
Artist's paintbrush size 2	Hobbycraft	610101	To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6)
96-well MicrotitreTM plate	ThermoFisher Scientific	2101	To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2)
Aluminium foil	Wrap Film Systems, Telford, UK	26B06	To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3)
Clear plastic wrap	SC Johnson & Son, Racine, WI, USA		To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7)
M205FA stereo microscope	Leica Microsystems	-	For GFP imaging (Step 4.1)
Leica Application Suite v3.2.0	Leica Microsystems		Microscope software (Step 4.1)
Fiji (Image J) v1.48a	National Institutes of Health, USA)	-	For image analysis (Step 6.1)