Solubilità dei composti idrofobici in soluzione acquosa utilizzando combinazioni di autoassemblanti peptidi e aminoacidi

Riepilogo

Questo protocollo descrive un mezzo clinicamente applicabile di dissoluzione composti idrofobici in ambiente acquoso, utilizzando combinazioni di autoassemblanti soluzioni peptidi e aminoacidi. Il nostro metodo risolve una limitazione importante di terapeutica idrofobica, che mancano mezzi sicuri, efficienti metodi di solubilità e consegna nelle regolazioni cliniche.

Abstract

I peptidi autoassemblanti (SAPs) sono promettenti veicoli per la consegna di idrofobo terapeutica per applicazioni cliniche; loro proprietà amphipathic permettono loro di sciogliere composti idrofobici in ambiente acquoso del corpo umano. Tuttavia, autoassemblanti soluzioni del peptide hanno sangue scarsa compatibilità (ad es., bassa osmolarità), ostacolando la loro applicazione clinica attraverso le amministrazioni per via endovenosa. Recentemente abbiamo sviluppato una piattaforma generalizzata per la somministrazione di farmaci idrofobici, che combina SAPs con soluzioni dell'amminoacido (SAP-AA) per aumentare la solubilità del farmaco e aumentare osmolarità di formulazione per raggiungere i requisiti per usi clinici. Questa strategia di formulazione è stata testata nell'ambito di tre composti idrofobici strutturalmente diversi – PP2, rottlerina e curcumina – al fine di dimostrare la sua versatilità. Inoltre, abbiamo esaminato gli effetti di sostituire i componenti di formulazione analizzando 6 diversi succhi, 20 aminoacidi naturalmente esistenti alle alte e basse concentrazioni e due diverse co-solventi dimetil solfossido (DMSO) ed etanolo. La nostra strategia si è dimostrata efficace nell'ottimizzazione di componenti per un dato farmaco idrofobo e funzione terapeutica dell'inibitore formulato, PP2, è stata osservata sia in vitro che in vivo. Questo manoscritto delinea il nostro metodo di formulazione generalizzata attraverso combinazioni di SAP-AA composti idrofobici e l'analisi di solubilità come un primo passo verso l'uso potenziale di queste formulazioni negli studi più funzionale. Includiamo risultati di solubilità rappresentativi per la formulazione della curcumina composto, idrofobo e discutere di come la nostra metodologia funge da piattaforma per futuri studi biologici e modelli di malattia.

Introduzione

SAPs sono una classe di biomateriali che sono stati studiati estesamente come impalcature 3D in medicina rigenerativa^1,2,3,4. Più recentemente, tuttavia, essi sono stati sfruttati come veicoli per la consegna di terapeutica a causa di loro proprietà biologiche uniche^5,6,7,8. SAPs naturalmente assemblare in nanostrutture stabile⁹, fornendo così un mezzo di incapsulamento di droga e di protezione. SAPs sono amphipathic, composto da un modello specifico di ripetizioni dell'aminoacido idrofobico e idrofilico, guida loro auto-assemblaggio^9,10 e permettendo loro di servire da mezzo tra idrofobico e idrofilico ambienti. Di conseguenza, per la consegna clinica di farmaci idrofobici – che hanno estremamente bassa biodisponibilità e l'assorbimento nel corpo a causa della mancanza di solubilità in ambienti acquosi^11,12 -SAPs sono promettenti come una consegna veicolo. Inoltre, i loro pattern di sequenza implica anche che SAPs può essere razionalmente progettato e realizzato per ottimizzare la compatibilità con qualsiasi dato farmaco o composti (cioè, basato su gruppi funzionali) e agevolare ulteriormente la solubilità.

SAPs sono stati applicati come veicoli di consegna di farmaco efficace in molti in vitro e in vivo le impostazioni^13,14,15,16. Hanno anche mostrato biocompatibilità e grande sicurezza. Tuttavia, a causa della bassa osmolarità dei preparativi di SAP-droga, non possono essere utilizzati per iniezioni endovenose come in contesti clinici¹³. Considerando questo fermo, abbiamo recentemente sviluppato una strategia che combina SAPs con soluzioni di aminoacidi al fine di ridurre l'uso di co-solventi tossici e aumentare l'osmolarità di formulazione e pertanto, rilevanza clinica. Ci ha scelto di usare gli aminoacidi sono gli elementi costitutivi di SAPs, sono già clinicamente accettata, e in combinazione con SAPs, aumentano la solubilità del farmaco idrofobo mentre riducendo la quantità di SAP ha richiesto^17,18.

Noi abbiamo esaminato combinazioni di SAP-AA come una piattaforma generalizzata per solubilità farmaco idrofobo e successiva consegna creando una pipeline di screening multifase e applicarlo all'inibitore Src, PP2, come un composto idrofobo di modello. In questo processo, abbiamo esaminato l'effetto di sostituire i componenti della formulazione – in ultima analisi, prove 6 diversi SAPs, tutti i 20 amminoacidi a 2 differenti concentrazioni (bassa e alta; basso basate sulle concentrazioni in applicazioni cliniche esistenti e di alta le concentrazioni erano 2x, 3x o 5x la concentrazione clinica basata sulla solubilità massima di ciascun amminoacido in acqua) e 2 diversi co-solventi – e combinazioni selezionate che solubilizzato PP2 per ulteriori analisi. Questa formulazione di droga ha dimostrato di essere efficace come un veicolo di consegna di droga in coltura delle cellule, come pure in vivo modelli utilizzando le amministrazioni intratracheale sia per via endovenosa. Allo stesso modo, il nostro lavoro ha toccato la versatilità delle combinazioni di SAP-AA in multiplo solubilizzante, strutturalmente diversi composti idrofobici in ambienti acquosi; in particolare, i farmaci rottlerina e curcumina¹⁸. Questo manoscritto delinea la formulazione ed analisi delle solubilità di curcumina come un esempio del passaggio primario nella nostra pipeline di screening SAP-AA. Questo protocollo fornisce un modo semplice e riproducibile per schermo per le combinazioni ottimale SAP-AA, che si dissolvono qualsiasi dato composto idrofobo.

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Protocollo

1. preparazione delle soluzioni dell'amminoacido

1. preparare ed etichetta due provette di centrifuga a fondo conico da 50 mL per ogni amminoacido (uno ciascuno per entrambi " basso " e " alta " concentrazioni).
2. Preparare un pallone da 2 L grande contenente acqua purificata (18,2 MΩ·cm a 25 ° C).
3. Calcolare la quantità di ciascun amminoacido (in grammi) per raggiungere la concentrazione desiderata e pesare la quantità appropriata di amminoacido in loro tubi di centrifuga rispettivi 50 mL utilizzando una spatola.
   Nota: Per la " alta " concentrazione dei due amminoacidi caricati negativamente, PBS viene utilizzato al posto dell'acqua. Non potremmo aumentare le loro concentrazioni a causa della loro solubilità in acqua bassa e utilizzando PBS invece di acqua aiuta a mantenere il pH basso. Inoltre, i calcoli di concentrazione sono stati ottenuti utilizzando un volume finale di 40 mL per ogni soluzione di aminoacidi. Tutte le concentrazioni di aminoacidi sono descritti nella tabella 3. Assicuratevi di risciacquare la spatola tra gli aminoacidi per evitare la contaminazione. Si consiglia un risciacquo con acqua, quindi asciugare con etanolo al 70%.
4. Aggiungere 40 mL di acqua purificata (o PBS) in ogni provetta 50 mL utilizzando una pipetta sierologica. Coprire le provette e vortexare o agitare vigorosamente fino a completa dissoluzione. Acqua bagno sonicazione (temperatura ambiente, 130 W, 40 kHz) può essere utilizzato anche per aiutare nel processo di solubilità.
   Nota: Le seguenti soluzioni di aminoacidi sono sensibili alla luce e dovrebbe essere coperto con carta stagnola: triptofano, fenilalanina e tirosina (che consistono di strutture simili a anello aromatiche) e la cisteina (reattiva - gruppo SH).

2. Preparazione delle soluzioni SAP-AA

1. preparare 20 mL fiale di scintillazione per l'auto-assemblaggio peptidi. Per un determinato peptide autoassemblanti, preparare un flaconcino per soluzione preparata dell'amminoacido (ogni combinazione sarà effettuato in un flaconcino separato).
2. Utilizzando una bilancia analitica ad alte prestazioni (con risoluzione fino a 0,1 mg o meno), pesano circa 1 ± 0,2 mg di peptide nella parte inferiore di ogni flacone. Tappo dopo aver soppesato e registrare il peso esatto del peptide sul Cap.
3. Dispensare il volume appropriato di soluzione dell'aminoacido (preparato nella sezione 1) in ogni flaconcino contenente il peptide, al fine di raggiungere la concentrazione desiderata di auto-assemblaggio del peptide (0,1 mg/mL per i peptidi lunghi con una lunghezza di 16 aminoacidi, o 0,2 mg/mL per più brevi peptidi con una lunghezza di 8 aminoacidi).
4. Sonicate per 10 min in un sonicatore di vasca del acqua (130 W, 40 kHz) a temperatura ambiente, garantendo le soluzioni all'interno di flaconcini sono completamente immersi nel bagno d'acqua.

3. Preparazione del farmaco-DMSO o droga-etanolo Stock soluzioni

1. Combine 1 mg di farmaco (in questo caso, la curcumina con 100% DMSO) e un altro 1 mg con etanolo al 100% per creare due soluzioni stock.
   Nota: Abbiamo aggiunto 200 µ l di DMSO e 400 µ l etanolo a fare scorte di DMSO-curcumina ed etanolo-curcumina che erano 5 mg/mL e 2,5 mg/mL, rispettivamente, a causa della diversa solubilità in ogni solvente; Tuttavia, è importante notare che la concentrazione di stock dovrebbe essere regolata secondo la droga idrofobica di interesse. Fattori quali la solubilità di droga e concentrazione biologica efficace sono importanti nel determinare questo valore. Inoltre, tenete a mente che il brodo sarà diluito 100 volte e 50 in formulazioni di DMSO ed etanolo, rispettivamente, quando combinato con le soluzioni SAP-AA (Vedi sezione 4). Può essere preferito per preparare un volume maggiore di magazzino in base al numero di formulazioni richiesto – in questo caso, potrebbe essere utilizzato più di 1 mg di farmaco. Lo stock possa essere conservato a-20 ° C; scongelare il ghiaccio e agitare prima dell'uso.
2. Vortex fiale per 15 s per sciogliere completamente il farmaco.

4. Preparazione delle formulazioni di droga

1. preparare chiaro, microcentrifuga da 1,5 mL per ogni formulazione. Assicurarsi di etichettare provette con la modalità auto-assemblanti peptidi, aminoacidi (e concentrazione) e co-solvente.
2. Aggiungere 10 µ l di droga-DMSO stock, o magazzino di droga-etanolo 20 µ l per microcentrifuga appropriato.
Le provette microcentrifuga di
3. aggiungere 990 µ l di soluzioni acide di SAP-AA per l'appropriato contenenti droga-DMSO stock e 980 µ l a quelli contenenti Stock in droga-etanolo. Questo produce formulazioni di farmaci 1 mL con 1% di DMSO o 2% di etanolo.
   Nota: La concentrazione finale di tutte le formulazioni della curcumina era 0,5 mg/mL secondo il protocollo. Ancora una volta, questo può variare quando utilizzando altri composti idrofobici e/o cominciando con una diversa concentrazione di stock (Vedi punto 3.1)
4. Vortex vigorosamente per 30 s e permettono formulazioni a riposare per 30 min.

5. test di solubilità

1. dopo il periodo di riposo, vortexare vigorosamente nuovamente per 30 s.
2. Centrifugare le formulazioni a 14.220 x g per 1 min.
3. Analizzare il fondo delle provette microcentrifuga per precipitazione (di visualizzazione).

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Risultati

Il farmaco idrofobo, curcumina, abbiamo realizzato formulazioni utilizzando tutti i 20 naturalmente esistenti aminoacidi a basse concentrazioni, in combinazione con un solo SAP, EAK16-II, come una prova-de-principio. Abbiamo testato anche formulazioni usando DMSO e etanolo come co-solventi. In totale, questo prodotto 40 formulazioni della curcumina, ciascuna contenente diversi componenti. È importante notare che, nei nostri studi precedenti utilizzando l'inibitore di Src, PP2, abbiamo in...

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Discussione

Nella procedura di formulazione, ci sono varie fasi critiche e punti da considerare nella risoluzione dei problemi. Innanzitutto, come stiamo lavorando con i vari componenti e concentrazioni, più passaggi di vortice in tutto il protocollo assicurano che tutte le concentrazioni sono uniforme e corretta. Alcune delle soluzioni dell'amminoacido ad alta concentrazione, idrofobo, ancora non può essere completamente sciolta dopo Vortex, e in questo caso, può essere scosso vigorosamente a mano per facilitare il processo. All...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
EAK16-I	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AEAKAEAKAEAKAEAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EAK16-II	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AEAEAKAKAEAEAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EAK16-IV	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AEAEAEAEAKAKAKAK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
EFK8-II	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: FEFEFKFK, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
A6KE	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: AAAAAAKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
P6KE	CanPeptide Inc.	Custom peptide	Sequence: PPPPPPPKE, N-terminus acetylation and C-terminus amidation, >95% pure by HPLC
Alanine	Sigma-Aldrich	A7469-100G	L-Alanine
Isoleucine	Sigma-Aldrich	I7403-100G	L-Isoleucine
Leucine	Sigma-Aldrich	L8912-100G	L-Leucine
Methionine	Sigma-Aldrich	M5308-100G	L-Methionine
Proline	Sigma-Aldrich	P5607-100G	L-Proline
Valine	Sigma-Aldrich	V0513-100G	L-Valine
Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P5482-100G	L-Phenylalanine
Tryptophan	Sigma-Aldrich	T8941-100G	L-Tryptophan
Tyrosine	Sigma-Aldrich	T8566-100G	L-Tyrosine
Glycine	Sigma-Aldrich	G8790-100G	L-Glycine
Asparagine	Sigma-Aldrich	A4159-100G	L-Asparagine
Glutamine	Sigma-Aldrich	G8540-100G	L-Glutamine
Serine	Sigma-Aldrich	A7219-100G	L-Serine
Threonine	Sigma-Aldrich	T8441-100G	L-Threonine
Histidine	Sigma-Aldrich	H6034-100G	L-Histidine
Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-100G	L-Lysine
Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-100G	L-Arginine
Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G	L-Aspartic Acid
Glutamic Acid	Sigma-Aldrich	G8415-100G	L-Glutamic Acid
Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-100G	L-Cysteine
Dimethyl Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540-500ML	DMSO
Ethanol	Sigma-Aldrich	277649-100ML	Anhydrous
Curcumin	Sigma-Aldrich	08511-10MG	Hydrophobic drug, curcumin
Rottlerin	EMD Millipore	557370-10MG	Hydrophobic drug, rottlerin
PP2	Enzo	BML-EI297-0001	Hydrophobic drug, PP2
Scintillation Vials	VWR	2650-66022-081	Borosilicate Glass, with Screw Cap, 20 mL. Vials for weighing peptide.
Falcon 50 mL Conical Centrifugation Tubes	VWR	352070	Polypropylene, Sterile, 50 mL. For amino acid solutions.