Applicazione di MultiColor FlpOut tecnica per studiare ad alta risoluzione singola cella morfologie e interazioni delle cellule della Glia in Drosophila

Riepilogo

Le cellule visualizzare diverse morfologie e stabilire una serie di interazioni con i loro vicini. Questo protocollo descrive come per rivelare la morfologia delle singole cellule e per indagare l'interazione cellula-cellula utilizzando il sistema di espressione Gal4/UAS ben consolidato.

Abstract

Celle sono visualizzate diverse morfologie e complessi rapporti anatomici. Come le cellule interagiscono con i loro vicini? Le interazioni differiscono tra tipi cellulari o anche all'interno di un determinato tipo? Quali tipi di regole spaziali seguono? Le risposte a tali domande fondamentali in vivo sono state ostacolate finora da una mancanza di strumenti per l'etichettatura di alta risoluzione singola cella. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per singole celle con una tecnica di MultiColor FlpOut (MCFO) di destinazione. Questo metodo si basa su tre in modo diverso con tag reporter (HA, bandiera e V5) sotto il controllo UAS che sono taciuti da un terminatore trascrizionale fiancheggiato da due siti di FRT (FRT-fermata-FRT). Un impulso di scossa di calore induce l'espressione di un calore indotta da shock Flp ricombinasi, che rimuove in modo casuale le cassette di FRT-fermata-FRT in singole celle: espressione si verifica solo nelle cellule che esprimono anche un driver GAL4. Questo porta a una matrice di celle diversamente colorate di un tipo dato delle cellule che permette la visualizzazione delle morfologie di cella singola ad alta risoluzione. Ad esempio, la tecnica MCFO combinabile con driver GAL4 glial specifici per visualizzare le morfologie dei diversi sottotipi gliali nel cervello adulto Drosophila .

Introduzione

Glia, la popolazione delle cellule non neuronali del sistema nervoso (NS), sono stati a lungo creduto di fornire un quadro statico per i neuroni e pertanto non sono stati studiati in dettaglio. Tuttavia, negli esseri umani, glia costituiscono la stragrande maggioranza delle cellule del NS (~ 90%) e rientrano in diverse categorie, tra cui gli astrociti, oligodendrociti, microglia e cellule di Schwann. In Drosophila, glia costituiscono circa il 10% delle cellule nel NS. Intrigante, loro morfologie e funzioni sono notevolmente simili a quelli trovati in vertebrati^1,2. Loro morfologie includono barriera emato - encefalica (BBB) formando epiteli, gliali e Astrocita-come le cellule.

Il sistema nervoso centrale di Drosophila (CNS) si compone delle seguenti strutture principali: regioni della corteccia che contengono i corpi cellulari neuronali; neuropils che porto connessioni sinaptiche; tratti di piccole e grandi dell'assone che collegano i diversi neuropiles; nervi periferici che collegano gli organi sensoriali e muscoli con il CNS (Figura 1). Glia sono trovati collegati con tutte queste strutture anatomiche: glia di corteccia (CG) nelle regioni corticali, Astrocita-come glia (ALG) e gliali glia (EG) nelle regioni compresa, gliali glia sono anche associate a tratti assone centrale e periferico nervi (EGN) e infine, due foglio-come glia, glia perineurial (PG) e subperineurial (SPG), che insieme formano uno strato contiguo che copre l'intera NS (Figura 2).

Studi precedenti hanno dimostrato che cellule gliali svolgono un ruolo importante nello sviluppo del NS; monitorare un numero di cellulare di un neurone reagendo ai peptidi del tipo di insulina di circolazione sistemica, forniscono supporto trofico ai neuroni, tra cui la navetta di lattato di astrociti ed eliminare i neuroni morenti di fagocitosi^{3,4 , 5 , 6}. nel NS maturo, glia mantenere la BBB, occupano neurotrasmettitori e mantenere l'omeostasi ionica, agire come le principali cellule immunitarie nel NS, poiché i macrofagi non possono violare la BBB e modulare l'attività sinaptica, nonché il comportamento animale^{6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11}.

Se i diversi sottotipi gliali svolgono funzioni specializzate rimane un importante problema irrisolto. Tuttavia, un'analisi sistematica del genoma della glia, soprattutto nell'adulto, è stata ostacolata dalla mancanza di appropriati strumenti genetici per la loro manipolazione. Qui, un metodo che permette la caratterizzazione efficiente e facile di forme di cella per studiare le interazioni cellula-cellula complessa è presentato. Questa tecnica è stata applicata per caratterizzare la morfologia dei diversi sottotipi gliali nel cervello adulto Drosophila , ma, a seconda del driver GAL4 specifico utilizzato, potrebbe essere adattato per studiare i neuroni^12,13 , qualsiasi tipo di macrosezioni cellule e in linea di principio qualsiasi tessuto in tutte le fasi inerenti allo sviluppo.

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Protocollo

1. preparazione di mosche per esperimenti MultiColor FlpOut (MCFO)

Nota: The MCFO tecnica si riferisce a una versione modificata dell'asportazione così chiamato per la cassetta fermata Flp-mediata (FlpOut). Transgenici MCFO mosche trasportano un promotore di scossa di calore (hsp)-ricombinasi Flp e diversi giornalisti sotto UAS di controllo. Ogni giornalista è costituito da una dorsale comune di una miristoilate (myr) proteina fluorescente verde super cartella (sfGFP), in cui 10 copie di un epitopo tag (ad es., HA, bandiera o V5) sono stati inseriti. Le proteine non fluorescente risultante sono denominate " il mostro di spaghetti GFPs " (smGFPs) ¹⁴ e può essere rilevata utilizzando anticorpi specifici contro l'epitopo diverso.

1. Croce Vola con la cassetta MCFO e la hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) per le righe appropriate gliale GAL4 driver (Vedi tabella materiali) .
   1. Come il hsp è già attivo a 25 ° C e alcune cellule possono subire ricombinazione che conduce a un'etichettatura non specifico, impostare croci a 18 ° C al fine di evitare la permeabilità del sistema. Attendere circa 20 giorni a 18 ° C per ottenere la generazione F1. Dopo il calore shock (Vedi punto 2), mantenere le mosche a 25 ° C ( Figura 3).

2. Colpo di calore

Nota: a seconda del sito di inserimento, può differire l'efficienza di hsp-Flp; di conseguenza, il tempo di scossa di calore ottimale deve essere ottimizzato. Per questo protocollo, è stato utilizzato uno stock di volare MCFO in cui è stato inserito l'hsp-Flp sul cromosoma X (Vedi Tabella materiali).

1. Trasferimento la progenie della Croce nel passaggio 1.1 (mosche di generazione F1, 3-4 giorni) nei nuovi flaconi contenenti cibo e calore shock li a 37 ° C in bagnomaria.
   Nota: Giovane mosche (1-2 giorni) sono molto sensibili allo shock termico. Attendere 1 o 2 giorni prima di eseguire la scossa di calore al fine di ridurre il tasso di mortalità causato dal trattamento. Uso alcuni della generazione F1 Vola come un controllo, senza shock termico.
2. Durante la scossa di calore, mantenere mosche in fiale normale con il cibo al fine di diminuire il tasso di mortalità indotta da stress. Mettere le femmine e i maschi in flaconcini separati.
3. Assicurati di immergere il flacone intero nell'acqua per assicurare una scossa di calore omogeneo. Utilizzare uno shock di 5-8 min come punto di partenza adatto per il contrassegno sparse delle cellule di glia con molte linee di GAL4 driver; la durata di shock deve essere ottimizzata per ogni driver e l'esperimento (volte di scossa di calore più o meno lunghi potrebbero essere necessarie).
4. Dopo la scossa di calore, ponga le fiale orizzontalmente in panchina per qualche minuto al fine di consentire le mosche a riprendersi dallo shock termico.
   Nota: Non è necessario cambiare i flaconcini.
5. Mantenere le mosche a 25 ° C e (vedere il passaggio 3 e 4) li sezionava 2 o più giorni dopo la scossa di calore per l'espressione ottimale reporter.

3. Preparazione di dissezione e soluzioni

1. il giorno della dissezione, preparare soluzione fissante fresco in provette per PCR 200 µ l con 180 µ l di terreno di coltura cellulare S2 con 20 µ l di 20% paraformaldeide (PFA) per ottenere una soluzione di 2% PFA. Mantenere la soluzione fissante sul ghiaccio prima e durante la dissezione.
   Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.
   Nota: Mescolare 160 µ l di terreno di coltura cellulare S2 con 40 µ l di 20% paraformaldeide (PFA) in un tubo PCR di 200 µ l per preparare una soluzione PFA 4% invece di una soluzione di 2%.
2. Utilizzare un tubo di PCR per genotipo con un massimo di 8-10 cervelli per tubo per ottenere ottimi risultati di macchiatura.
3. Preparare il cervello adulto, soluzione di lavaggio: albumina di siero bovino di 0,5%, 0,5% Triton X-100 in PBS.
   Nota: A seconda della colorazione, una soluzione contenente 1% Triton X-100 può essere necessaria. Una maggiore concentrazione di Triton X-100 aumenta la penetrazione dell'anticorpo nel tessuto ed è necessario per le regioni di macchia che si trovano dentro il tessuto (ad es., regioni sinaptica nel cervello adulto Drosophila).
4. Preparare la soluzione bloccante: siero di capra normale 3%, 3% donkey normale siero e 0,5% Triton X-100 in PBS.
5. Il cervello adulto lavaggio soluzione e la soluzione bloccante può essere memorizzato a 4 ° C per un paio di settimane.
6. Mettere la lastra di vetro di depressione profonda pozzi sul ghiaccio e riempire ogni bene con le seguenti soluzioni: uno con etanolo al 70%, uno con PBS e uno con mezzo di coltura cellulare S2.

4. Dissezione del cervello adulto

1. posizionare un 3cm piatto di dissezione sul palco di uno stereomicroscopio e riempirlo con freddo medium di coltura cellulare di S2. Condurre tutte le dissezioni in questo mezzo per garantire che il tessuto rimanga sano durante la procedura di dissezione.
   Nota: Utilizzare un piatto per dissezione fiancheggiato da alcuni millimetri di silicone nero che fornisce un buon contrasto (nelle immagini) e preservare il forcipe durante la dissezione.
2. Anestetizzare le mosche del genotipo desiderato con CO ₂.
3. Con il forcipe, afferrare al volo dalle ali e lavarlo in etanolo 70% freddo per 30 s, quindi con PBS freddo per ulteriori 30 s.
4. Trasferire al volo nella depressione profonda ben che viene riempita con terreno di coltura cellulare S2.
5. Ripetere la stessa procedura per tutte le mosche dello stesso genotipo e mantenerli in mezzo di coltura cellulare S2 freddo fino a dissezione, che conserverà il tessuto.
   Nota: Anestetizzare solo il numero di mosche che può essere sezionata in un periodo di tempo di circa 30 min., lunghi tempi di incubazione in terreno di coltura cellulare di S2 può danneggiare il tessuto.
6. Afferrare al volo con il forcipe e, sotto un microscopio stereoscopico, immergere la Mosca in mezzo di coltura cellulare S2.
7. Staccare la testa dal resto del corpo. Scartare il corpo e tenere la testa immersa nel mezzo di coltura cellulare di S2. È estremamente importante tenere la testa con il forcipe per tutta la durata della dissezione. Se la testa inizia a galleggiare, sarà difficile per recuperarla senza danneggiare il tessuto.
8. Iniziare la dissezione tirando fuori un occhio, mentre si tiene la testa con il forcipe almeno una in ogni momento. Assicurarsi che la punta della pinza è appena di sotto della retina per evitare di danneggiare il tessuto sotto. Tirare fuori l'altro occhio e iniziare a rimuovere la cuticola finché non viene visualizzato il cervello.
9. Rimuovere il tessuto tracheale e cuticola intorno al cervello fino a quando il tessuto appare pulito. Assicurarsi di rimuovere tutto il tessuto trachea intorno al cervello per ottenere ottimi risultati di colorazione; i tessuti sono ora pronti per essere riparato e macchiato.
10. Mantenere tutti i cervelli sezionati in S2 freddo delle cellule di coltura prima di trasferirli nella soluzione PFA per tempo il passo di fissazione.

5. La macchiatura del cervello adulto

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Trasferire il cervello isolato con una pipetta P10 nella soluzione PFA a temperatura ambiente (TA). Per evitare danni ai tessuti, mai utilizzare pinze per trasferire il cervello dopo la dissezione. Eseguire tutti i passaggi in provette per PCR 200 µ l su un nutator.

Per tutti i passaggi, prima di gettare la vecchia soluzione con una pipetta P200, permettono il cervello per depositarsi sul fondo del tubo. Se si tenta di rimuovere il supernatante senza aspirare il tessuto. Proteggere il tessuto dall'esposizione della luce.

Difficoltà i cervelli in 200 µ l di 2% PFA in mezzo di coltura cellulare di S2 per 1 h o in 4% PFA per 30 minuti. Mantenere i tempi di fissazione identici tra campioni al fine di aumentare la riproducibilità.

Dopo 3 (o più) lavaggi di 15 minuti ciascuno in 200 µ l di soluzione di lavaggio di cervello adulto bloccare i tessuti con 200 µ l di soluzione bloccante per 30 minuti. Tempi di incubazione più lunghi nella soluzione di blocco sono possibili.

Incubare il cervello durante la notte a 4 ° C con gli anticorpi primari diluiti nel cervello adulto, soluzione di lavaggio in un volume totale di 200 µ l.
Nota: I tempi di incubazione possono variare a seconda del tipo di anticorpo utilizzato. Le incubazioni più lungo potrebbero essere necessarie.

1. Per l'etichettatura dei tre marcatori MCFO, incubare i cervelli con anti-HA (1: 500), anti-FLAG (epitopo DYKDDDDK) (1: 100) e gli anticorpi primari anti-V5.
Gli anticorpi coniugati direttamente
2. primaria potrebbero essere utilizzati invece della normale combinazione primaria + secondaria (ad es., anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). In questo caso, trattare gli anticorpi coniugati direttamente come anticorpi secondari.
   Nota: Per ciascun genotipo, tenere alcuni cervelli come controlli per verificare la specificità della colorazione. Saltare l'incubazione dell'anticorpo primario e andare direttamente al passaggio successivo.

Lavare i tessuti 3 volte per 1 h a 200 µ l di soluzione (punto 3.3) di lavaggio di cervello adulto e li incubare con secondari fluorophore-coniugati/primario anticorpi coniugati direttamente diluiti nel cervello adulto, soluzione di lavaggio durante la notte alle 4 ° C o per 4 h a RT, in un volume totale di 200 µ l
Nota: esempi degli anticorpi adatti: AlexaFluor 488 (1: 250), anti-V5:DyLight 549 (1: 200) e DyLight 647 (1: 100)-anticorpi.

Lavare il cervello 3 volte per 1 h a 200 µ l di soluzione, seguita da un lavaggio finale in 200 µ l di PBS durante la notte a 4 ° C o per 1-2 h a RT di lavaggio di cervello adulto; la fase di lavaggio finale in PBS rimuove qualsiasi traccia di Triton X-100 ed è necessaria per risultati di colorazione ottimali. Montare i cervelli in mezzo di montaggio con un agente anti-dissolvenza su vetrini coprioggetti.

6. Montaggio dei cervelli per l'Imaging

1. Trim un imaging distanziale la dimensione desiderata utilizzando le forbici. Per microscopia ad alta risoluzione, a sandwich tra due lamelle di vetro il distanziale esemplare e imaging.
   Nota: Imaging distanziali sono sottili (0,12 mm di spessore) distanziali adesivi che buccia e bastone per vetrini coprioggetti o microscopio, che permette il montaggio dei campioni senza compressione.
2. Using pinze, rimuovere il rivestimento adesivo da una superficie e applicare il distanziale, il lato adesivo verso il basso, sulla superficie del vetrino coprioggetti (22 x 60 mm). Applicare 10 µ l di mezzo di montaggio nuovo vetrino coprioggetti.
3. Pipetta con un P10, trasferire i cervelli dal tubo 200 µ l per il vetrino coprioggetto, vicino a quella del mezzo di montaggio. Insieme con i tessuti, trasferire alcuni PBS al fine di mantenere il cervello in soluzione.
4. Pipetta con un P10, spostare i cervelli da PBS a goccia di mezzo di montaggio cercando di limitare la quantità di PBS. Trasferire gli esemplari in mezzo di montaggio il coprivetrino con il distanziale imaging. Utilizzare abbastanza mezzi di montaggio per coprire il campione.
5. Rimuovere altri il rivestimento adesivo dal lato superiore del distanziatore e aggiungere un vetrino coprioggetti in cima gli esemplari. Con la punta di un forcipe, applicare una leggera pressione sulla zona adesiva per sigillare. Immagine dei tessuti montati immediatamente o archiviare le diapositive a-20 ° C per un'analisi successiva.

7. Acquisizione immagini

1. pile di acquisizione di immagini di fluorescenza confocale utilizzando un microscopio confocale con un 40x (NA = 1.2, immersione in acqua) obiettivo o 63 X (NA = 1.4, olio da immersione) obiettivo (le dimensioni dei pixel = 1.024 x 1.024 nel piano xy; Distanza tra due sezioni confocale = 0,5 µm). Regolare il rivelatore guadagno e offset in ogni canale in modo tale che nessun pixel saturato e zero i valori dei pixel sono presenti nelle immagini; Questo evita la perdita di informazioni e garantisce l'utilizzo della gamma dinamica completa del rivelatore.
   Nota: Poiché l'imaging 3D è molto tempo, le misurazioni possono essere automatizzate analizzando campioni multipli in parallelo alle posizioni differenti. Per evitare l'evaporazione con l'obiettivo a immersione in acqua, utilizzare olio speciale immersione mezzo con indice di rifrazione n = 1.33.
2. Elaborare gli stack confocale per proiezioni di densità massima, cambiamenti nel canale tonalità e regolazione della luminosità e il contrasto utilizzando qualsiasi software di analisi di immagine standard (Vedi Tabella materiali).

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Risultati

In questa sezione sono riportati esempi di risultati che possono essere ottenuti utilizzando la tecnica MCFO nel cervello adulto della drosofila . La figura 3 Mostra un disegno schematico del metodo. Tre giornalisti diversamente membrana-etichetta (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-FLAG e myr-smGFP-V5) sotto il controllo UAS sono taciuti da un terminatore trascrizionale fiancheggiato da due siti di FRT (FRT-fermata-FRT). Un impulso di scossa...

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Discussione

Questo protocollo descrive un metodo semplice ed efficace per studiare la morfologia dei diversi tipi di cellule all'interno di un tessuto di interesse ad alta risoluzione. Con la tecnica del MCFO reporter multipli con differenti epitopo tag sono utilizzati in combinazione per multicolor stocastico etichettatura (Figura 2). Simili ad altri metodi come Brainbow/Flybow^15,16,17, MCFO aumenta la diversi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water bath	Grant	GD100
PCR tubes	Sarstedt	72.737.002
Forceps	Dumont	11251-20
Dissecting dish 30 mm x 12 mmm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dish
Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate	Corning	7223-34	Glass dissection plates
Sylgard Black	SYLGARD, Sigma-Aldrich	805998	home made with charcoal
ExpressFive S2 cell culture medium	Invitrogen	10486-025
20% PFA	Electron Microscopy Sciences	15713
Triton X-100	Roth	3051.3
Normal goat serum	Jackson Laboratories	005-000-121
Normal donkey serum	Jackson Laboratories	017-000-121
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647
Rabbit HA-tag	Cell Signaling	C29F4	Primary antibody, dilution 1:500
Rat FLAG-tag	Novus Biologicals	NBP1-06712	Primary antibody, dilution 1:100
Mouse V5-tag:DyLight 549	AdSerotec	0411	Conjugated antibody, dilution 1:200
anti-rabbit AlexaFluor 488	Invitrogen	A11034	Secondary antibody, dilution 1:250
anti-rat DyLight 647	Jackson Laboratories	712-605-153	Secondary antibody, dilution 1:100
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000
SlowFate Gold	Invitrogen	S36937
Secure Seal Spacer	Grace Biolabs		Contact company for ordering
Microscope cover glass 22 X 60 mm	Marienfeld	101152
Microscope cover glass 22 x 22 mm	Roth	H874
Stereo Microscope, Leica MZ6	Leica
Confocal laser scanning microscope LSM710	Zeiss
Immersol	Zeiss	518 F	Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free
Immersol	Zeiss	W 2010	Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free
R56F03-GAL4 (EG)	Bloomington Stock Center	39157	GAL4 driver
R86E01-GAL4 (ALG)	Bloomington Stock Center	45914	GAL4 driver
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5	Bloomington Stock Center	64085	UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Fiji (Image J)			Image analysis software
Multi Time Macro	Zeiss		Software for automated scanning