Preparazione del dissociato Culture Neuron mouse corticale

Riepilogo

Questo video mostra una procedura per la generazione di culture neuronali dall'embrione fine e l'inizio della corteccia del mouse postnatale. Queste culture possono essere utilizzati per immunocitochimica, biochimica, elettrofisiologia, calcio e sodio di imaging e di fornire una piattaforma per studiare lo sviluppo neuronale di animali transgenici che portano una mutazione genetica postnatale letale.

Abstract

Questo video vi guiderà attraverso il processo per la generazione di neuroni corticali culture dall'embrione fine e l'inizio del cervello di topo postnatale. Queste culture può essere utilizzato per una varietà di applicazioni, tra cui immunocitochimica, biochimica, elettrofisiologia, imaging di calcio e sodio, proteine ​​e / o RNA isolamento. Queste culture anche fornire una piattaforma per studiare lo sviluppo neuronale di animali transgenici che portano una mutazione in ritardo embrionale o postnatale gene letale. La procedura è relativamente semplice, richiede una certa esperienza nelle tecniche di coltura e non dovrebbe richiedere più di due o tre ore se si è adeguatamente preparati. Un'attenta separazione della crosta corticale dal talamo-corticale del tratto di fibra ridurrà il numero degli indesiderati cellule non neuronali. Per aumentare la resa delle cellule neuronali triturare i pezzi del tessuto corticale delicatamente dopo la fase di incubazione dell'enzima. Questo è indispensabile in quanto previene inutili danni alle cellule e la morte prematura delle cellule neuronali. Dato che queste colture sono mantenute in assenza di cellule di alimentazione glia, offrono anche un vantaggio aggiunto di culture crescente arricchito nei neuroni.

Protocollo

I preparativi prima del giorno di coltura:

• Preparare soluzione sterile dissezione (DS).
• Preparare NBM/B27 (Mediom Neurobasal con supplementi di B27).
• Autoclave DDH ₂ O e sterilizzare coversilps vetro, se necessario.
• Cappotto tessuto piatti cultura o coprioggetto di vetro con poli-D-lisina.

Poli-D-lisina Coating:

Preparare il giorno prima della coltura in condizioni di sterilità.

• Aliquota del disgelo PDL 10X e posto sul ghiaccio.
• Aggiungere 9 ml sterile ultra-filtrata acqua a 1 ml di PDL e mescolare bene (1X).
• Superfici cappotto con 1X Pdl notte a temperatura ambiente come segue:
  • vetro coprioggetti (Bellco gatto di vetro, Inc. # 1943-00012.): 75 microlitri / coprioggetto
    O
  • 24 pozzetti cultura: 300 ml / pozzetto
    O
  • 35 millimetri piatto cultura: 1ml/dish
• Risciacquare con acqua sterile 5X (usare pipette Pasteur sterili per aspirare liquidi).
• Eliminare l'acqua in superficie fino a quando è completamente asciutto.

Coltura procedura (fatto in cappa a flusso laminare in condizioni sterili)

1. Tagliare blocco di agar e la colla sul blocco sostegno della Vibraslicer microtomo (Campden Instruments Ltd.) con colla super.
2. Quando si utilizza tardo fase embrionale (E17-18) feti di topo, diga euthanise, togliere utero e feto singolo libero dal sacco embrionale. Feti posto in piastra di Petri sterile e procedere come descritto di seguito.
3. Decapitare feto mouse o cucciolo (seguire le linee guida approvate dalla vostra cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa).
4. Togliere la pelle e il cranio e il cervello posto sul disco Whatman carta da filtro in una capsula di Petri riempite con 60 millimetri DS freddo.
5. Tagliare il cervelletto con una lama di rasoio sterile.
6. Pick up cervello con una spatola e scarico liquidi in eccesso su carta da filtro, poi il trasferimento cervello per bloccare il supporto Vibraslicer e il cervello colla al posto (lato caudale e parte ventrale fronte agar).
7. Riempire da camera con DS freddo. Impostare il selettore della velocità a 8-9.
8. Tagliare sezioni 200-400 micron, a partire dal bulbo olfattivo. Una volta che la lama del Vibraslicer penetri nella corteccia, iniziare il taglio 600μm sezioni coronali. Un cervello E17-18 topo produce tipicamente 3-4 fette utilizzabile, mentre un P0 cervello di topo cede 4-5 fette utilizzabile.
9. Trasferimento fettine di cervello di piatto da 35 mm di Petri etichettati DS 2 usando fine inverso di un-inserito 10 ml di vetro pipetta Pasteur.
10. Sezionare fuori corteccia e rimuovere le meningi con aghi di vetro tirato da tubi capillari.
11. Scorze tagliate corticale in piccoli pezzi, 0,5-1 mm di lunghezza.
12. ES Filtrare 0,2 micron filtro attaccato ad una siringa da 5 cc in un piatto 35 millimetri di Petri.
13. Trasferire i pezzi di tessuto corticale capsula di Petri contenente ES filtrata.
14. Incubare a 37 ° C per 30 min.

Nel frattempo:

1. Pulire cappuccio, Vibraslicer e strumenti di dissezione.
2. Aggiungere 5 ml di caldo NBM/B27 in un piatto 60 millimetri di Petri.

Dopo 30 min. incubazione:

1. Trasferimento di tessuto a 10 ml DS. Lasciare riposare per 1 minuto.
2. Trasferimento di tessuto al primo turbinii tubo Hi e lasciare riposare per 2-3 minuti.
3. Trasferimento a Hi secondo. Ripetere come sopra.
4. Trasferimento al primo Li. Ripetere come sopra.
5. Trasferimento alla seconda Li. Ripetere come sopra.
6. Cessione a terzi Li. Ripetere come sopra.
7. Trasferimento di tessuto al piatto 60 mm con i media.

Sotto il microscopio dissezione:

1. Eliminare i detriti dal tessuto e triturare ogni pezzo con delicatezza passando attraverso una pipetta di vetro tirato (minor utilizzo diametri) per allentare il tessuto.
2. Trasferimento sospensione cellulare a 15 ml tubo contenente il resto della NBM + B27 (per un totale di 13 ml per una piastra ben 24 o 11 ml per 5 - 35. Piatti millimetri Mescolare delicatamente e attendere grandi pezzi di tessuto per risolvere).
3. Trasferimento di sospensione cellulare (0,5 ml / pozzetto di una piastra ben 24 o 2 ml / 35 piatto cultura mm).
4. Quando si utilizza coprioggetto di vetro, aggiungere 80 microlitri di sospensione cellulare per coprioggetto e lasciare 1 ora nel tessuto culturale incubatore per le cellule di aderire prima di allagare la camera con più NBM/B27 media.
5. Mantenere le culture a 37 ° C e 5% di CO _2.

Giorno successivo

24 pozzetti: Feed ciascun pozzetto con 0,5 ml di cellule non neuronali condizionata NBM/B27 medio (cNBM/B27; Protocollo per la preparazione di cNBM/B27 media appare sotto)

Piatti 35 mm: Sostituire 0,5 ml con cNBM/B27 media.

Mantenere la cultura sostituendo 0,5 ml di media con cNBM/B27 fresca ogni 2-3 giorni.

Sebbene i media cultura non promuove la proliferazione delle cellule gliali, le culture possono essere trattate con FDU 5 micron (5-Fluoro-2'-deossiuridina, Sigma F0503) al giorno 3-5 in cultura per ridurre ulteriormente il numero di cellule gliali, se necessario.

SET -UP per la dissezione e la Cultura

Sterilizzare gli strumenti dissezione nel 70% EtOH o autoclave loro:

• Forbici (aziende medie e piccole) Spatole (aziende medie e piccole)
• Pinzetta (aziende medie e piccole) Razor blade
• Lama per il bagno Buffer vibraslicer
• Piccolo cuneo di metallo per il supporto della lama per il cervello

Altri materiali:

• Piastre di Petri (60 mm)
• Piastre di Petri (35 mm)
• Filtro di carta
• Pipetta di vetro da 10 ml
• Pipette sterili monouso, 5,10 e 25 ml
• Siringa filtro, 0,2 micron
• Siringa da 5 cc
• Provette per centrifuga, 15 ml
• Sterile di vetro pipette Pasteur
• PDL piatti cultura rivestiti o coprioggetto di vetro

Etichetta sei provette da 15 ml e seguire la preparazione:

Tubo # 1: soluzione enzimatica:

Aggiungere 50 U di papaina (Worthington LS 03126) a 5 DS ml contenente:

• 100μl di L-cisteina (0,8 mg)
• 7 microlitri 0.1N NaOH
• 50 microlitri APV (5mm)

Lasciare la soluzione a temperatura ambiente per cancellare. Si noti che appariranno soluzione enzimatica 'torbida' in un primo momento e ha bisogno di pulire prima dell'uso.

Tubo # 2 e # 3: inibitore Max:

3 ml DS + 300 ml BSA / Ti + 30 microlitri APV (5mm).

Mescolare delicatamente per evitare le bolle, poi dividere in due aliquote da 1,5 ml.

Tubo # 4 - # 6: inibitore Basso:

8 ml DS + 80 microlitri BSA / Ti + 80 microlitri APV (5mm).

Mescolare delicatamente per evitare le bolle, si dividono in tre aliquote da 2,6 ml.

Tubi posto numerato # 2 al # 6 su ghiaccio. Lascia tubo # 1 (soluzione enzimatica) a temperatura ambiente.

SOLUZIONI E aliquote

• Soluzione A (Buffered Saline) Sigma Formula wt 500 ml [conc.]
• Cloruro di sodio NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm
• Cloruro di potassio KCl P-4504 74,56 4,0 G 5.4mm
• Fosfato di sodio bibasico anidro Na ₂ HPO ₄ S-0876 142,0 0.24g 0,17 mm
• Potassio fosfato monobasico anidro KH ₂ PO ₄ P-5379 136,09 0,22 mm 0,3 g

Pesare tutti gli ingredienti e mescolare fino a sciogliere con 400 ml di acqua ultra filtrata. Portare il volume finale a 500 ml. Mettere in una bottiglia pulita e autoclave. Conservare a 4 ° C e l'etichetta "Soluzione DS A".

• Soluzione B (Hepes) Sigma Formula wt 250 ml [conc.]
• Hepes Hepes H-3375 283,3 20.97g 9,9 mm

Aggiungi ultra-filtrata l'acqua fino a 200 ml. Mescolare fino a scioglimento e portare il volume finale a 250 ml. Mettere in una bottiglia pulita e autoclave. Conservare a 4 ° C e l'etichetta "DS Soluzione B".

• Soluzione di lavoro da 500 ml [conc.]
• Ultra 400 ml di acqua filtrata
• Soluzione A 25 ml
• Soluzione B 14 ml
• D (+)-glucosio Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM
• Sigma saccarosio S-0389 7,5 g 43,8 mm

Regolare il pH a 7,4 con NaOH 1N. Portare il volume finale a 500 ml con acqua ultra filtrata. Decantare in una bottiglia di vetro pulita e autoclave. Conservare a 4 ° C. Etichetta "Soluzione dissezione".

Poli-D-lisina Preparazione:

1. Preparare la soluzione 10x stock di poli-D-lisina (PDL; Sigma P-7280) in sterili H ₂ O a 1mg/ml.
2. Fai aliquote 1,0 ml. Questa soluzione può essere conservata a -20 ° C per un massimo di 3 mesi.

MEDIA

1. Aggiungere 10 ml di B-27 Supplemento (Gibco 17504-044) per flacone da 500 ml NBM (Medium Neurobasal, Gibco 21103-049).
2. Fai 40 aliquote da ml e conservare a 4 ° C.

APV

1. Aggiungere 10 ml di H ₂ O sterile per flaconcino da 10 mg APV (2-Amino-5-phosphonopentanoic acido, Sigma A-5282) e mescolare accuratamente.
2. Preparare aliquote di 180 microlitri e conservare a -20 ° C.

BSA / Ti

1. Sciogliere 1 g di BSA (albumina bovina. Sigma A-7030) e 1 g di tripsina inibitore (Sigma T-9253) in 10 ml DS.
2. Regolare il pH a 7,4 con NaOH 1N.
3. Sterilizzare per filtrazione attraverso filtro da 0,2 micron siringa.
4. Dividere in aliquote da 400 microlitri e conservare a -20 ° C.

L-cisteina

In una provetta Eppendorf sciogliere 0,6 mg L-cisteina (Sigma C-7755) in 200 microlitri DS.

AGAR (4%)

1. Sciogliere 4 g di Agar Bacto (Difco 0140-01) in 100 ml di acqua sterile. Conservare a 4 ° C fino al momento della cultura.
2. Agar microonde per fondere e riempire un piatto di 35 millimetri di Petri. Lasciate riposare per raffreddare e polimerizzare.

Papaina (Worthington LS 03126)

e_title "> non neuronali CULTURE IN BOTTIGLIA CULTURA NUNC

RIVESTIMENTO BOTTIGLIA CULTURA (4 bottiglie Nunc)

1. Aggiungere 9 ml di acqua sterile a ciascuno dei 3 tubi del PDL 10X per rendere PDL 1X.
2. Trasferire 30 ml 1X PDL nella prima bottiglia.
3. Spostare leggermente fino a quando tutte le superfici di crescita sono coperti. Lasciate riposare per 1 minuto.
4. Trasferimento 1x PDL a seconda bottiglia. Lasciate riposare per 1 minuto.
5. Ripetere con le bottiglie terzo e quarto.
6. Risciacquare tutte le quattro bottiglie 2X con 150 ml sterile H ₂ O.

PREPARARE soluzione enzimatica (ES):

1. In un peso 0,6 ml in provetta da centrifuga 0,8 mg L-cisteina (Sigma C7755), aggiungere DS 150ml e vortice fino a quando i cristalli si sciolgono.
2. Trasferire 5 ml DS in una provetta da 15 ml, poi aggiungere 150ml L-cisteina.
3. Papaina aggiungere 50 unità. (Worthington LS 03126)
4. Aggiungi 7ml 0.1N NaOH.

PREPARARE MEM (GIBCO # 11090-081)

1. Togliere 65 ml dalla bottiglia da 500 ml MEM. Risparmia il 10 ml per preparare glucosio.
2. Aggiungere 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063).
3. Aggiungere 10 ml di glucosio 1M (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml di MEM)
4. Aggiungere 50 ml di siero fetale bovino (Gibco # 16140-071) o siero bovino di vitello (Omega aC-04).
5. Mescolare bene, aliquota e conservare a 4 ° C.

NEUROBASAL MEDIUM/B-27 SUPPLEMENTO (NBM/B27)
NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049), B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17504-044)

1. Aggiungere l'intero contenuto di B-27 vial alla bottiglia NBM e mescolare.
2. Aliquota e conservare a 4 ° C.

DISSEZIONE del tessuto cerebrale

1. Secco dissezione strumenti dal 70% EtOH prima della dissezione.
2. Trasferire 10 ml DS in ogni tubo di 3-15 ml.
3. Seleziona cuccioli mouse (P0 - P3), avrete bisogno di tre cervelli per 4 bottiglie.
4. Aggiungi DS piatto freddo a 35 mm di Petri.
5. Decapitare il mouse cucciolo e sezionare i cervelli.
6. Cervello posto nella capsula di Petri contenente DS freddo.
7. Tritare tessuto in pezzi, abbastanza piccolo da passare attraverso una pipetta di vetro.

ENZIMA DISSOCIAZIONE

1. Rimuovere il DS più possibile il piatto con una pipetta Pasteur.
2. ES filtrare attraverso una siringa da 0,2 micron filtro e 5 cc.
3. Luogo ES nel piatto con il tessuto.
4. Incubare il tessuto a 37 ° C incubatore (CO _{2 anni} gratis) per 30 minuti.

LAVAGGIO DEL TESSUTO

1. Tessuto trasferimento con pipetta di vetro per il primo tubo DS, avendo cura di avere come ES meno possibile.
2. Centrifugare per 30 sec a 1500 giri al minuto.
3. Trasferimento di tessuti e ripetere la procedura altre due volte.

TRITURAZIONE

1. Mettere 38 ml di MEM / FBS in un tubo da 50 ml per centrifuga
2. Aggiungere 3 ml di MEM / FBS a un piatto da 35 mm e il tessuto di trasferire a questa capsula di Petri.
3. Dissociare il tessuto con delicatezza triturazione attraverso un 1000μl punta della pipetta eppendorf.
4. Trasferimento sospensione cellulare alla provetta contenente 38ml di MEM / FBS e mescolare bene.

PLATING

1. Stare le bottiglie cultura in posizione verticale per ottenere la stessa quantità di sospensione cellulare e dei media in ogni bottiglia.
2. Mettere 90 ml di MEM / FBS in ogni bottiglia cultura.
3. Aggiungere 10 ml di sospensione cellulare in ogni bottiglia.
4. Etichetta: non neuronali, iniziali e la data. Incubare a 37 ° C e 5% di CO _2.

ALIMENTAZIONE

1. Il giorno 3 o 4, le cellule di alimentazione con caldo MEM / FBS (decantare tutti i media e sostituirlo con 100 ml di MEM / FBS). Culture possono prendere 7-10 giorni per diventare confluenti.
2. Il giorno di 7-10 cambiare il supporto per NBM/B27.
3. Il giorno dopo, raccogliere i media. Filtro con 0.22μm
4. Fai aliquote di 40 ml e mangimi cultura con MEM / FBS.
5. Prossimi 2 o 3 giorni, cambio dei media per NBM/B27
6. Il giorno dopo, raccogliere e ripetere la procedura.
7. Continuare a raccogliere i media per ca. 2 settimane.

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!