Dissezione della Retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica

Riepilogo

La retina umana è composta in modo funzionale e molecolare distinte regioni, tra cui la fovea, la macula e la retina periferica. Qui, descriviamo un metodo utilizzando biopsie punch e rimozione manuale di strati di tessuto da un occhio umano per sezionare e raccogliere queste regioni distinte della retina per analisi proteomica a valle.

Abstract

La retina umana è composto della neuroretina sensoriale e il sottostante dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), che è saldamente complessato allo strato coroidico vascolare. Diverse regioni della retina sono anatomicamente e molecolare distinte, facilitando funzioni uniche e dimostrando la suscettibilità alla malattia. Analisi proteomica di ciascuna di queste regioni e strati possono fornire le comprensioni vitale nel processo molecolare di molte malattie, compreso degenerazione Macular relativa all'età (AMD), mellito di diabete e il glaucoma. Tuttavia, separazione delle regioni retiniche e strati è essenziale prima analisi proteomic quantitativa possono essere compiuta. Qui, descriviamo un metodo per la dissezione e la collezione delle regioni retiniche foveale, maculare e periferiche e sottostante RPE-coroide complesso, che coinvolge le biopsie del punzone regionali e rimozione manuale di strati di tessuto da un occhio umano. Unidimensionale SDS-PAGE, nonché analisi proteomica a valle, come liquida cromatografia-spettrometria di massa (LC-MS/MS), possono essere utilizzato per identificare le proteine in ogni strato retinico dissecata, rivelando biomarcatori molecolari per malattia retinica.

Introduzione

La retina, RPE e coroide sono tessuti complessi che mostrano importanti differenze regionali nell'espressione della proteina, funzione fisiologica e patologica predisposizioni^1,2. Per esempio, malattie come la degenerazione Macular relativa all'età (AMD), retinite pigmentosa e retinopatia sierosa centrale dimostrano caratteristica localizzazione all'interno della fovea, macula o retina periferia^{1,3, 4,6}. Qui, presentiamo un metodo dimostrando retinico come distinta regioni possono essere campionate in modo indipendente. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire una guida affidabile per la raccolta di campioni di tessuto dalle regioni foveale, maculare e periferiche della retina umana e RPE-coroide per analisi proteomica. La spiegazione razionale per lo sviluppo e l'uso di questa tecnica è che attraverso analisi proteomica di queste regioni specifiche della retina, importanti intuizioni molecolare possono essere acquisite nelle funzioni fisiologiche e fisiopatologiche di queste regioni.

Questo approccio promette di rivelare la base di proteomica per la suscettibilità relativa malattia regionale e di facilitare l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici specifici. Infatti, le indagini di proteomica del vitreo e delle sue interazioni con la retina hanno fornito spunti preziosi per la composizione molecolare e la funzione del tessuto sano e malato^{5,7,8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. Tuttavia, analisi proteomica comparativa chiaro di distinte regioni retiniche sono carenti. La tecnica contribuirà a sostenere questi studi tanto necessaria, fornendo vantaggi rispetto ad altri metodi dimostrando un approccio di raccolta del tessuto affidabili e riproducibili. Più così, l'approccio è molto accessibile, approfittando del punzone di tessuto di dimensioni standard e prontamente disponibili strumenti di biopsia. La nostra tecnica enfatizza l'appropriata raccolta e conservazione dei tessuti per proteomica elaborazione, facendo considerazioni importanti per la stabilità proteica e degradazione. Così, questo metodo è più adatto per gli investigatori considerando l'analisi molecolare a valle di proteomica fattori.

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Protocollo

questo studio è stato approvato dall'Università dell'Iowa ' s Institutional Review Board e aderisce ai principi stabiliti nella dichiarazione di Helsinki.

1. Foveal e maculare biopsia Punch

1. Open e farfalla l'occhio umano, tale che si compone di 4 distinti lembi di tessuto, come descritto in una precedente pubblicazione. ⁵
2. a partire da un occhio umano butterflied inserito in una capsula Petri, centro uno strumento di biopsia del punzone da 4 millimetri sopra la fovea, premere verso il basso e rotolare delicatamente fino a quando non viene fatta un'incisione intorno alla fovea.
3. Successivamente, generare un'incisione intorno al macula di centraggio e premendo verso il basso uno strumento di biopsia del punzone 8 mm pelle entro le arcate della macula, applicando una pressione delicata e rotolamento. Questo produrrà un anello di tessuto che circonda il primo secondo, esterno.

2. Periferico della retina biopsia Punch

1. uso il punch di 4 mm pelle strumento di biopsia per fare una serie di pugni nella retina periferica, appena fuori l'arcade. Qui, fare due punzoni per ogni falda quadrante.
   Nota: Dopo tutti i pugni sono fatte, l'occhio avrà due pugni concentrici nel centro, che rappresenta la fovea e macula, e due pugni alla base di ogni falda-per un totale di 8 pugni nella retina periferica.

3. Fovea e Macula biopsia collezione

1. come il tessuto è ora pronto per la raccolta, raccogliere tutte le biopsie di tessuto in tubi separati del microfuge e congelamento con azoto liquido per l'elaborazione a valle. Conservare tutti i campioni a-80 ° C fino al momento di utilizzo.
2. Utilizzare una pinzetta Colibri 0,12 per afferrare i bordi del tessuto traslucido della fovea retinica. Per raccogliere, elevare e separare il tessuto foveal dalla sottostante coroide-RPE.
3. Allo stesso modo, utilizzare il forcipe Colibri 0,12 per afferrare l'anello esterno del tessuto traslucido macula. Se il tessuto è ancora attaccato al tessuto sottostante o adiacente, è possibile utilizzare un paio di forbici di Westcott attentamente tagliare il bordo, catturare solo il componente retinico e dissezione distanza qualsiasi tessuto di nervo ottico incluso nel punzone.

4. Collezione di Retina periferica

1. utilizzare la pinzetta Colibri 0,12 per separare delicatamente i dischi di tessuto retinico periferico da RPE-coroide sottostanti e posto all'interno di tubi individuali del microfuge.
2. Nel caso di residuo gel vitreale, usare il forcipe per sollevare e separare il gel di distanza per quanto possibile prima dell'accumulazione del tessuto retinico. Una volta tolta la retina, pigmentata RPE-coroide rimane di sotto.

5. Foveal e Macula RPE-coroide collezione

1. uso il 0.12 Colibri pinze per afferrare i bordi del tessuto RPE-coroide scuro che si trova sotto l'area della fovea rimossa. Separare con cura questo tessuto dalla sclera e raccogliere.
2. Usando la pinza stessa, afferrare i bordi dell'anello esterno di tessuto scuro di RPE-coroide sottostanti l'area maculare rimossa. Separare con cura questo tessuto da sclera afferrando i bordi in diversi punti intorno al ring e tirando leggermente. Alla fine, l'anello di tessuto RPE-coroide sarà essere sloggiato e possono essere raccolto.
   Nota: Forcipe secondario nella mano opposta può essere utile nel manipolare il tessuto RPE-coroide durante la rimozione. Come il tessuto retinico, Wescott forbici possono essere utilizzate per aiutare a rimuovere tutto il tessuto che non è stato completamente inciso utilizzando lo strumento punch.

6. Collezione di RPE-coroide Retina periferica

1. utilizzare il forcipe Colibri 0,12 per staccarsi le RPE-coroide nei settori periferici punch 8.
2. Come in precedenza, posizionare il tessuto RPE-coroide in tubi del microfuge e congelamento con azoto liquido per l'elaborazione a valle. Mantenere tutti i campioni a-80 ° C fino a utilizzo.

7. Dissezione di forbici

Nota: se la lama di biopsia del punzone è noiosa o lo strumento di biopsia punch non viene spinto abbastanza duro, potrebbe non esserci un Clean-Cut che circonda il tessuto.

1. In questi casi, tirare via il tessuto per quanto possibile e quindi utilizzare Westcott forbici per tagliare e separare.

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Risultati

Tessuto di RPE-coroide e della retina possono essere elaborati in vari modi per soddisfare un'indagine individuale. Dopo la raccolta, il ricercatore sarà in possesso di campioni di tessuto RPE-coroide dalla regione foveal, macula esterno e retina periferica (Figura 1) e della retina. In particolare, il pugno di regione foveal includerà la fovea, il parafovea e una piccola quantità del perifovea adiacente. Il punzone maculare include il resto della regione ...

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Discussione

Dopo tessuto raccolta, manipolazione e trattamento sono cruciali considerazioni¹⁴. Conservazione in azoto liquido è preferibile fissazione chimica, come quest'ultimo può causare danni alla struttura della proteina, che potrebbe inclinare analisi a valle. Inoltre, la conservazione in azoto liquido è preferito ai metodi che non comportano congelamento di campioni. In particolare, Ferrer et al hanno evidenziato differenze significative nei livelli della proteina tra cervello campioni cons...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-34
8-mm skin punch biopsy tool	Miltex	REF 33-37
0.12 Colibri Forceps	Stephens Instruments	S5-1145
Wescott Scissors	Sklar Surgical Instruments	64-3146
Microfuge tubes	Eppendorf	#022364111	1.5 mL
Liquid Nitrogen	Praxair, Inc.	7727-37-9 [R]