Visualizzazione e Live Imaging del Oligodendrocyte organelli in fettine di cervello Organotypic utilizzando Virus Adeno-associati e microscopia confocale

Riepilogo

I oligodendrocytes myelinating promuovono la propagazione del potenziale d'azione rapida e la sopravvivenza neuronale. È descritto qui un protocollo per l'espressione del oligodendrocyte-specific di proteine fluorescenti in organotipiche fette del cervello con formazione immagine successiva di time-lapse. Inoltre, una procedura semplice per la visualizzazione non macchia mielina è presentata.

Abstract

I neuroni si basano sull'isolamento elettrico e supporto trofico dei oligodendrocytes myelinating. Nonostante l'importanza degli oligodendrociti, gli strumenti avanzati attualmente usati per studiare i neuroni, sono state prese solo parzialmente dai ricercatori del oligodendrocyte. Cella tipo-specifica colorazione di trasduzione virale è un approccio utile per studiare la dinamica dell'organello dal vivo. Questo articolo descrive un protocollo per la visualizzazione di mitocondri del oligodendrocyte nelle fette del cervello organotipiche di trasduzione con virus adeno-associato (AAV) portatori di geni per le proteine fluorescenti mirate mitocondriale sotto il controllo trascrizionale del il promotore di proteina basica della mielina. Esso comprende il protocollo per rendere organotipiche fette di cervello del topo coronale. Una procedura per time-lapse imaging dei mitocondri quindi segue. Questi metodi possono essere trasferiti ad altri organelli e possono essere particolarmente utili per lo studio di organelli nella guaina mielinica. Infine, descriviamo una tecnica prontamente disponibile per la visualizzazione della mielina non macchia in fette di vita da microscopia Confocal di riflessione (CoRe). CoRe non richiede nessun equipaggiamento supplementare e può essere utile per identificare la guaina mielinica durante la formazione immagine dal vivo.

Introduzione

Materia bianca del cervello è composto di cellule nervose assoni avvolti nella mielina, una membrana di plasma estesa specializzata formata da oligodendrociti. Mielina è necessaria per la propagazione del potenziale d'azione veloce e affidabile e sopravvivenza a lungo termine degli assoni myelinated e una perdita di mielina può causare disfunzione neurologica. Nonostante la loro importanza, le proprietà degli oligodendrociti sono meno conosciuti rispetto con i neuroni e astrociti. Di conseguenza, meno strumenti sono stati sviluppati per lo studio di oligodendrociti.

Live imaging di organelli cellulari come i mitocondri, reticolo endoplasmatico (ER) o diverse strutture vescicolari possono essere utile per studiare i cambiamenti dinamici negli organelli nel corso del tempo. Tradizionalmente, formazione immagine degli oligodendrociti vivente è stata eseguita in monocolture^1,2. Tuttavia, oligodendrociti in monocoltura non visualizzare compatta mielina e organotipiche o fettine di cervello acuto possono, quindi, essere un'opzione migliore quando si studia la localizzazione e il movimento degli organelli. Localizzazione di piccoli organelli e proteine nella guaina mielinica può essere difficile a causa della breve distanza tra l'assone myelinated e la guaina di mielina circostante. Così, le procedure di luce immunostaining microscopica da solo non avere la risoluzione spaziale di discriminare tra quelli nell'assone myelinated e organelli nella guaina mielinica. Questo può essere risolto attraverso la trasduzione virale con geni per le proteine fluorescenti targeting organello guidate dai promotori specifici del tipo di cella. I vantaggi sono un'espressione di cellula-specifico e rada, che consente una valutazione accurata della localizzazione dell'organello e dinamiche. Animali transgenici è utilizzabile anche per realizzare tale un organello targeting cellula-specifico espressione³. Tuttavia, la produzione e la manutenzione di animali transgenici è costosi e di solito non offrono l'espressione sparsa che possa essere raggiunti dai metodi virale.

Il metodo descritto qui utilizza trasduzione virale degli oligodendrociti con proteine fluorescenti targeting mitocondriale (dsred o verde proteina fluorescente, GFP) guidato dal promotore di proteina basica della mielina (MBP-mito-dsred o MBP-mito-GFP) per visualizzare mitocondri del oligodendrocyte nelle fette del cervello organotipiche. Inoltre, espressione di un'altra proteina fluorescente nel citoplasma (GFP utilizzato insieme a mito-dsred o tdtomato utilizzato con mito-GFP) viene utilizzato per abilitare la visualizzazione della morfologia delle cellule, compresi i comparti citoplasmatici della guaina mielinica. Il protocollo comprende la procedura per effettuare organotipiche fette del cervello (una versione modificata del protocollo descritto da De Simoni e Yu, 2006^4,5). Descriviamo quindi la procedura di imaging time-lapse per studiare il movimento mitocondriale. Questa procedura utilizza un microscopio confocale verticale con uno scambio continuo di imaging medio, un'installazione che consente la facile applicazione di farmaci o altri cambiamenti medi durante la formazione immagine. La procedura di imaging time-lapse può essere eseguita su qualsiasi microscopio confocale, con alcune attrezzature supplementari per il mantenimento della vita fette come descritto di seguito. Il protocollo contiene anche alcuni suggerimenti per ottimizzare la formazione immagine e ridurre la fototossicità.

Infine, è descritto un modo semplice e veloce per visualizzare mielina non macchia da microscopia Confocal di riflessione (CoRe). Questo può essere utile per identificare la guaina mielinica durante la formazione immagine dal vivo. Negli ultimi anni, diverse tecniche sono state sviluppate alla mielina immagine senza alcuna colorazione necessaria, ma la maggior parte di questi richiedono specifiche attrezzature e competenze^6,7,8. La procedura qui descritta utilizza le proprietà riflettenti della guaina mielinica ed è una versione semplificata di singolo-eccitazione lunghezza d'onda di microscopia Confocal di riflessione spettrale (Punteggio, in cui diverse lunghezze d'onda del laser è combinato per visualizzare mielina) ⁹. coRe può essere fatto su qualsiasi microscopio confocale che dispone di un laser a 488 nm e un filtro di emissione di 470-500 nm passa-banda o un filtro di emissione sintonizzabile.

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Protocollo

le procedure qui descritte sono state approvate dall'autorità norvegese per la ricerca animale. I fornitori e i numeri di catalogo per i materiali di consumo e altre richieste attrezzature sono disponibili nell'elenco materiali alla fine del documento.

1. preparazione di organotipiche fette

Nota: questa ricetta utilizza due cuccioli di topo postnatale giorno 7-9 (p7-9), che producono 24 fette organotipiche divisi su due piastre di coltura di sei-pozzo. Salvo diversa indicazione, tutte le procedure dovrebbero essere fatto in una cappa sterile e guanti in lattice o nitrile dovrebbero essere usati. Dovrebbero essere usati solo ingredienti di qualità cultura cellulare.

1. Autoclave bottiglie, strumenti di dissezione (grande 1 forbice, 1 piccola forbice, 1 grande spatola piatta, 1 piccola spatola arrotondata e affilata e 1 forcipe, vedi materiali lista per i dettagli), vetro pipette, puntali per pipette e salviette di tessuto utilizzati per la preparazione di fetta.
2. Come metà delle pipette di vetro deve essere utilizzata con la grande apertura, rompere l'estremità stretta.
   1. Punteggio con uno scriber diamante (se disponibile) della penna intorno la pipetta appena sotto il punto dove il vetro inizia il restringimento. Quindi posizionare l'estremità a punta della pipetta in un guanto di nitrile o simili. Interrompe con attenzione la punta piegando la pipetta e contemporaneamente spingerlo contro un banco di lavoro.
   2. Poi smussare l'estremità rotta da sfregamento su un pezzo di carta vetrata o fondere leggermente su un becco Bunsen. Le pipette rotte sono usate per trasferire fette tagliate del cervello con l'estremità rotta trasformato nel bulbo di gomma e la grande aperta fine toccare la soluzione/fette.
      Nota: Questo non è fatto in una cappa sterile e può essere fatto diversi giorni di anticipo.
3. Preparare piastre di coltura.
   Nota: Questo può essere fatto il giorno prima di affettare o almeno 2 ore prima di affettare.
   1. Membrane sterilizzare politetrafluoroetilene (PTFE) (" coriandoli "). Utilizzare due pinze sterili per rimuovere singoli coriandoli da pezzi di plastica blu circostanti e sterilizzare immergendo due volte in una piastra Petri contenente 96% etanolo (EtOH). Poi stendere coriandoli Appartamento in un grande piatto di Petri sterili asciugare.
      Nota: I confetti sono membrane in PTFE idrofiliche simile alle membrane negli inserti di cultura. L'uso dei coriandoli aiuti il live imaging poiché singole fette possono essere facilmente trasferite dall'inserto per il setup di microscopio sollevando i coriandoli con il forcipe (vedere 4.8. per i dettagli). In alternativa, le fette di cervello possono essere coltivate senza i coriandoli (in cui fisserà le fette direttamente alla membrana dell'inserto cultura). In questo caso, l'inserto di membrana deve essere tagliato con un bisturi per trasferire la fetta al bagno microscopio.
   2. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura (ricetta di reagenti ' tabella) in ogni pozzetto dei piatti sei pozzetti cultura.
   Una coltura di
   3. posto inserire in ciascun pozzetto usando pinze sterili. Evitare le bolle d'aria tra l'inserto e il terreno di coltura.
      Nota: Per risparmiare soldi e ambiente, è possibile riutilizzare gli inserti di cultura. Questo può essere fatto da un appropriato risciacquo in acqua distillata H ₂ O (dH ₂ O) seguita da incubazione in 70% EtOH per un minimo di 24h fino al riutilizzo. Quando si prepara per la nuova cultura, asciugare gli inserti in una piastra di coltura cellulare sotto ultravioletto (UV) luce per un minimo di 15-30
   4. Posto due coriandoli (sterilizzati e secco) su ciascuno degli inserti cultura. Posizionare i coriandoli verso i bordi degli inserti per ottenere la minima sovrapposizione.
   5. Mettere le piastre nell'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C con 5% CO ₂.
4. Medio di dissezione freddo di bolla (ricetta di reagenti ' tabella) con gas di biossido (95% O ₂ /5%CO ₂). Per mantenere la soluzione sterile, collegare il tubo della bombola ad un filtro siringa sterile (dimensione dei pori di 0.22 µm). Filtro
   1. coppia l'altra estremità della siringa in una provetta sterile collegato a una pipetta di vetro sterile. Inserire la pipetta di vetro nella soluzione, coprire con parafilm e accendere il gas. Mantenere il mezzo di dissezione su Ice.
5. Preparare l'area di dissezione/affettatura.
   Nota: Idealmente, questa procedura deve essere eseguita in una cappa sterile. Se questo non è possibile, del vibratome può essere lasciata su un banco di lavoro. In questo caso, si consiglia di utilizzare una maschera per capelli net e viso.
   1. Usando una lama di rasoio singolo bordo, tagliare un pezzo rettangolare (circa 2 cm x 0,5 cm) di gel di agarosio (ricetta di reagenti ' tabella) e incollare questo sul palco vibratome tale che il lato lungo verso la lama del vibratome.
   2. Pulire tutte le superfici e le parti del vibratome con 70% EtOH e asciugare con salviette di tessuto autoclavato.
      Nota: È importante che tutti i pezzi che saranno in contatto con il tessuto cerebrale siano completamente asciutti poiché EtOH può danneggiare le cellule.
   3. Fissare una lama di rasoio sterile del vibratome ed eseguire controllo di vibrazioni, se questa funzione è il vibratome.
   4. Strumenti di dissezione in autoclave posto nella cappa insieme tessuto autoclavato wipes, quattro piccole capsule di Petri, un bisturi arrotondata, 2 pipette in vetro con lampade in gomma, due pipette di vetro fisse (Vedi PT. 1.1) e super colla (spruzzato con EtOH).
   5. Versare mezzo dissezione propagati in barca vibratome e nei quattro piccoli piatti Petri.
      Nota: Questo passaggio solo dovrebbe essere eseguita immediatamente prima della dissezione poiché medio da questo punto in poi non è gorgogliare o mantenere sul ghiaccio.
6. Cervelli dissezionare e Monte.
   Nota: Per ottenere fette sani, questo passaggio deve essere fatto rapidamente e con precisione. È necessaria una certa pratica.
   1. Eutanasia animale #1 da dislocazione di neckor secondo le linee guida locali e poi decapitare con le forbici grandi.
   2. Using piccolo, forbici affilate, rapidamente rimuovere la pelle facendo un'incisione sagittale dal collo al naso e tirare da parte per rivelare il cranio.
      1. Tagliare lungo la sutura sagittale, seguita da incisioni laterali sopra la parte interna delle ossa frontali e la sutura di lamboid (al confine tra cervello e cervelletto).
      2. Usare pinze per piegare aperto il cranio su ogni lato. I nervi cranici sono tagliati fuori dal cervello inserendo una spatola arrotondata, sharp sotto il lato ventrale del cervello e delicatamente spostando lateralmente la spatola.
   3. Utilizzare una lama di rasoio singolo spigolo a fare un coronale tagliare rostral al cervelletto.
      Nota: Questo taglio sarà determinare l'angolo a cui vengono tagliate le fette. Si dovrebbe, quindi, essere fatta all'angolo retto.
   4. Flip il cervello fuori del cranio e in un piccolo piatto di Petri contenente mezzo dissezione.
   5. Ripetere i passaggi 1.6.1.-1.6.4. per animale #2 e posto questo cervello in un secondo Petri piatto.
      Nota: Gli animali non sono sterili. Eseguire la dissezione su un lato della cappa e poi passare al lato opposto, pulito, una volta che i cervelli sono stati rimossi dal cranio.
   6. Cambiare i guanti.
   7. Attach cervello vibratome stage: aggiungere un sottile strato di colla super sul palco proprio di fronte il gel dell'agarosi montato. Tenere il lato cervello #1 con una spatola piatta larga con appena tagliata (caudale) toccando la spatola e il rivestimento del lato ventrale (e di essere più vicino possibile a) il gel dell'agarosi.
      1. Poi posizionare delicatamente il cervello sulla colla spingendolo fuori la spatola con un set di pinze. Assicurarsi di lasciare abbastanza spazio per cervello #2.
         Nota: È importante che i cervelli sono fissati bene sul palco, ma senza eccessiva colla, come questo può ostruire il taglio.
   8. Immediatamente dopo il montaggio del cervello #1, usare la spatola grande per aggiungere alcune gocce di mezzo di dissezione in cima il cervello. Ciò manterrà il cervello umido, indurire la colla ed evitare che si attacchi ai lati dei cervelli.
   9. Ripetere i passaggi 1.6.7 e 1.6.8. per cervello #2.
   10. Collegare la fase sulla barca vibratome.
7. Fette 230 µm spessore coronale con un'ampiezza di 1-1,5 mm, una frequenza di 85 Hz e una velocità di 0,2 mm/s. raccogliere fette approssimativamente fra rostrale 1,4 e 2,1 mm caudale al Bregma.
   1. Raccogliere fette dopo ogni fetta è stato tagliato utilizzando pipette in vetro Open End (PT. 1.1). Trasferimento fette in una piastra Petri contenente mezzo di dissezione. Utilizzare un bisturi arrotondato per tagliare le fette in due pezzi, dividendo i due emisferi.
8. Quando vengono tagliate tutte le fette, inserire i piatti di cultura fette.
   1. Togliere la piastra di coltura (uno alla volta) l'incubatore.
   2. Utilizzando le pipette di vetro fissa, trasferire con cautela una fetta a ciascuno dei coriandoli.
      Nota: Le fette devono porre piatto nel mezzo i coriandoli. Questo richiede una certa abilità. Tuttavia, se alcune fette non sono perfette, è meglio lasciarli che to trascorrere del tempo cercando di spostarli come è importante ottenere tutte le sezioni in incubatrice velocemente come possibile.
   3. Utilizzare una pipetta di vetro (a punta fine) per rimuovere delicatamente l'eccesso del prodotto senza toccare la fetta.
      Nota: Le fette non devono essere immerso nel liquido durante l'incubazione. Così, eccesso di terreno deve essere aspirato tale che le fette sono esposti all'aria (un film sottile di mezzo ancora coprirà le fette). Fette che rimangano immerse in liquido solitamente saranno malsana o morire (4 e le nostre osservazioni).
   4. Spostare il piatto indietro nell'incubatrice, una volta che tutti i coriandoli hanno una fetta.
   5. Ripetere i passaggi da 1.7.8.-1.8.4. per piatto #2.
9. Cambiare il terreno di coltura.
   Nota: Questo dovrebbe essere fatto il giorno dopo il taglio (giorno 1 in vitro, DIV1) e poi ogni 2-3 giorni.
   1. Preriscaldare il terreno di coltura in un bagnomaria o l'incubatore.
   2. In una cappa sterile, utilizzare aspirazione di vuoto o di una pipetta regolare con punta sterile per aspirare il terreno di coltura da ciascun pozzetto. Questo viene fatto delicatamente le mance il piatto (di circa 30 gradi) e inserendo la punta della pipetta al bordo dell'inserto cultura.
   3. Rimuovere circa 800 µ l da ogni pozzetto (lasciando solo abbastanza mezzo per tenere la parte inferiore dell'inserto rivestito in mezzo). Quindi, utilizzando una pipetta pulita, aggiungere 800 µ l del mezzo pre-riscaldato in ciascun pozzetto. Poi rimettere i piatti nell'incubatrice della coltura cellulare.

2. Trasduzione virale

1. acquisto o fare AAVs con un plasmide di interesse, come descritto in precedenza ^{10 , 11}.
   Nota: Questo protocollo descrive l'uso di sierotipo AAV 2/8 (AAV 2/8) trasporto mitocondriale mirata dsred o GFP come un gene reporter sotto il controllo trascrizionale del promotore proteina basica della mielina ¹² (AAV2/8 MBP_mito_dsred o AAV2 / 8 MBP_mito_GFP) per visualizzare i mitocondri oligodendrociti. AAV 2/8 trasporto GFP o tdtomato come gene reporter guidato dal generale promotore CAG (AAV 2/8 CAG_GFP o AAV 2/8 CAG_tdtomato) utilizzato per visualizzare il citoplasma di oligodendrociti. Pertanto, la combinazione di AAV2/8 MBP_mito_dsred con CAG_GFP di AAV 2/8 dà rossi mitocondri e citoplasma verde negli oligodendrociti, mentre combinando AAV2/8 MBP_mito_GFP e AAV 2/8 CAG_tdtomato dà verdi mitocondri e citoplasma rosso. I costrutti sono descritti in maggior dettaglio altrove ¹³.
2. Il giorno 7 in vitro (DIV7), trasducono i oligodendrocytes con gli adenoassociati.
   Attenzione: Seguire le norme di sicurezza per l'utilizzo con AAVs. Assicurarsi di avere una formazione adeguata e l'approvazione di livello di biosicurezza richiesto. Tutti i seguenti punti dovrebbero essere effettuati in un armadio di sicurezza biologica classe II utilizzando guanti e camice da laboratorio. Qui, applicazione di AAV per la zona della corteccia delle fette è descritto, in quanto questa è l'area che mostra il miglior recupero. Terreno di coltura
   1. diluire l'AAV in pre-riscaldata (37 ° C). Per ottenere una trasduzione sparse degli oligodendrociti che permette l'imaging delle singole cellule all'interno della slice si consigliano diluizioni circa 2 × 10 ⁹ copie di genoma/mL (GC/mL). Tuttavia, un pilota utilizzando diversi titoli dovrebbe essere fatto per garantire una densità degli oligodendrociti trasdotte che è adatta per gli esperimenti specifici. Se vengono utilizzati due diversi AAVs, devono essere mescolati nella stessa soluzione e aggiunto alla sezione simultaneamente.
   2. Aggiungere circa 1,3 µ l diluito AAV per ogni fetta: assicurarsi che l'esterno della punta della pipetta sia asciutto. 1,3 µ l diluito AAV e tenere la pipetta sopra la corteccia, più vicino possibile senza toccare la fetta con la punta della pipetta (a circa 1 mm).
   3. Poi spingere lentamente la soluzione fuori la pipetta. Quando la soluzione tocca la fetta, spostare la punta della pipetta sopra la corteccia per diffondere la soluzione sopra la zona intera corteccia.
      Nota: Questa procedura deve essere eseguita velocemente quanto possibile di evitare di tenere le fette fuori della cappa più del necessario. Fare questo su un piatto al momento e mettere il primo piatto indietro nell'incubatrice prima di iniziare il piatto #2. Per ottenere una distribuzione soddisfacente di AAV senza danneggiare il tessuto richiede una certa pratica e una mano ferma.
3. Se un microscopio a fluorescenza in posizione verticale è disponibile in laboratorio delle cellule, l'espressione della proteina può essere controllata durante il tempo nella cultura inserendo il piatto sotto il microscopio.
   Nota: Il piatto non deve essere tenuto fuori dell'incubatrice per più di 2-5 minuti.

3. Time-lapse Imaging

Nota: l'imaging può essere eseguito ogni volta che i livelli di espressione dei marcatori fluorescenti sono sufficienti e le fette un aspetto sane (solitamente DIV11-14).

1. Assicurarsi che il microscopio, la perfusione e il riscaldamento sono impostati correttamente affinché propagati soluzione di imaging è riscaldata e può entrare ed uscire il bagno.
   Nota: Esistono varie soluzioni per le camere di bagno. Una versione semplice è presentata qui.
   1. Make in - e prese del bagno da aghi di siringhe smussata (piegate a ~ 45°) che sono attaccati ai lati della vasca di blu-tack/divertimento tack.
   2. Assicurarsi che la tubazione vada da un flacone di soluzione di imaging continuamente propagati, tramite la pompa peristaltica, attraverso il tubo di riscaldamento della caldaia e quindi l'ago della siringa di aspirazione nel bagno.
   3. Collegare un altro tubo per la presa dell'ago di siringa. Questo tubo poi va via la pompa peristaltica e torna alla bottiglia di soluzione di imaging (o a una bottiglia di scarico).
2. Bubble soluzione di imaging (ricetta di reagenti ' tabella) con gas di biossido.
   Nota: Questo dovrebbe essere stariportati almeno 15 minuti prima di formazione immagine e continuare in tutto l'esperimento.
3. Disabilita il pompa peristaltica e riscaldatore e soluzione di esecuzione attraverso il bagno per ottenere la temperatura ottimale (37 ± 0,5 ° C). Assicurarsi che il sensore del termometro collegato all'unità di temperatura sia immersa nella soluzione vasca.
4. Accendere il microscopio, Lampada fluorescenza e laser appropriato.
Percorso di
5. insieme a una luce adatta per l'esempio.
   Nota: Questo può variare a seconda della sonda e l'installazione di microscopio. Conoscenza generale di come utilizzare il microscopio confocale è richiesto e non saranno trattata.
6. Utilizzare un obiettivo a immersione in acqua con l'appropriato ingrandimento e apertura numerica (n.a.). Usiamo un acqua immersione piano-apochromat 40x (n.a. 1.0).
7. Open pinhole per raggiungere una sezione ottica di circa 2-2,5 µm per il video time-lapse. Questo riduce l'insorgenza dei mitocondri in movimento fuori fuoco durante il time-lapse.
8. Fetta organotypic trasferimento al bagno:
   1. aggiungere una goccia di terreno di coltura o soluzione di imaging per una piccola plastica di Petri.
   2. In una cappa sterile, uso pinze sterili per trasferire una fetta organotypic dalla membrana inserire alla goccia. Il forcipe deve solo toccare i coriandoli e non la fetta.
   3. Mettere il coperchio sul piatto Petri.
   4. Immediatamente mettere la piastra di coltura contenente il resto delle fette indietro nell'incubatore.
   5. Portare la capsula di Petri contenente fetta al microscopio.
   6. Spegnere la pompa peristaltica durante il trasferimento fetta al bagno di microscopio. In primo luogo, utilizzare pinze per sollevare coriandoli con fetta da capsula di Petri nella parte superiore della vasca (i coriandoli galleggerà). Poi mettere le due punte della pinza su ciascun lato di coriandoli che toccano i coriandoli senza toccare la fetta e spingere i coriandoli attraverso la soluzione per il fondo della vasca. Centrare i coriandoli nel mezzo della vasca.
   Forcipe di uso per posizionare il punto di ancoraggio di Hold-Down (arpa) in cima i coriandoli senza toccare la fetta di
   7. .
      Nota: Un'arpa è un ancoraggio di platino a forma di ferro di cavallo che è usato per prevenire la fetta da galleggianti o alla deriva nel bagno. Per fettine acute, sottili stringhe correre da una parte dell'arpa a altro (simile ad un'arpa di musica). Per fette organotipiche, l'arpa dovrebbe essere Bacelli e adattarsi alle dimensioni dei coriandoli in modo tale che può posare sopra i confetti senza toccare la fetta.
   8. Accendere pompa peristaltica.
9. Abbassare l'obiettivo verso il basso per esempio.
10. Selezionare la cella e regione immagine.
    Nota: Evitare l'esposizione eccessiva delle cellule di luce laser come questo può causare tossicità cellulare (vedere suggerimenti nei punti che seguono).
    1. Utilizzare gli oculari e la lampada fluorescente per trovare un aspetto sano del oligodendrocyte con l'espressione corretta. In genere, gli oligodendrociti che hanno una forte sovraespressione della proteina fluorescente appaiono malsani. Oligodendrociti malsani avrà processi con un'apparenza blobby e mitocondri appariranno frammentati. Negli oligodendrociti sani, il soma e processi appaiono uniformi e i mitocondri hanno lunghezze diverse (anche se in genere molto più breve in neuroni e astrociti ^{13 , 14 , 15}).
    2. mettere la cella di interesse al centro del campo visivo.
    3. Uso il " live " funzione del software (per microscopi Leica e Zeiss) per identificare la cella sullo schermo e scegliere un'area di interesse, ad esempio, una parte della cella che contiene diversi processi primari o i foderi di myelin o un singolo processo o fodero di myelin.
       Nota: Per essere in grado di immagine come gran parte delle guaine/processi possibili, scegliere aree contenenti i processi che si trovava relativamente piano in direzione x-y.
    4. Ingrandire il campo di interesse (in genere producendo un'immagine con dimensione dei pixel di 0,14 - 0,30 µm).
    5. Usando il " regioni " strumento, disegnare un rettangolo intorno all'area e scegliere l'opzione di scansione solo l'area selezionata. Scansione di tempo e quindi l'esposizione laser, è ridotto da solo la scansione della regione selezionata.
       Nota: Aree rettangolari orizzontali verranno analizzate più veloce di regioni verticali a causa del numero più corto di linee di scansione necessarie. Se una regione di rettangolo verticale viene analizzata, il tempo di scansione può essere ridotto il campo di scansione rotante di 90 gradi (utilizzando lo strumento di rotazione).
11. Regolare potenza laser e guadagno per ottenere una buona vista sui mitocondri.
    Nota: Utilizzare la potenza del laser minima necessaria. Se possibile, alzare il guadagno piuttosto che il crescente potere del laser. Oltre a causare tossicità cellulare, troppo ad alta potenza laser sarà candeggina gli oggetti acquisiti nel tempo, richiedendo così un ulteriore aumento della potenza del laser o di guadagno durante la scansione. La potenza del laser richiesto e il guadagno dipenderà il livello di espressione e il microscopio. Con un microscopio confocale LSM700, usiamo un 555 nm laser con una potenza di 20-40 µW a immagine dsred o tdtomato e 488 nm laser viene utilizzato in 20-30 µW per immagine GFP (potenza laser misurata presso l'apertura posteriore dell'obiettivo). Guadagno è impostato alta per l'imaging in vivo, solitamente nella gamma di 700-800 per GFP e 850-980 per dsred e tdtomato. L'alto guadagno potrebbe causare qualche altro rumore di fondo, che viene rimosso aumentando il digitale offset (offset valori laici in genere tra 0 e 15). Nella nostra esperienza, utilizzando MBP_mito_GFP dà un migliore segnale-rumore di MBP_mito_dsred.
Velocità di scansione
12. select.
    Nota: Ridurre al minimo il tempo di scansione utilizzando una velocità di scansione veloce e disegnando una piccola regione di scansione (vedere punto 4.10.5 qui sotto). È anche possibile salvare il tempo di scansione eseguendo una scansione bidirezionale. Tuttavia, questo non è consigliato a causa di qualità di immagine inferiore.
13. Set di frequenza e la durata di registrazione time-lapse, ad esempio catturare immagini ogni 2 secondi per un totale di 20 minuti per l'imaging mitocondriale negli oligodendrociti.
    Nota: La frequenza e la durata deve essere impostati secondo la mobilità degli oggetti di interesse. Una maggiore frequenza esporrà l'esemplare più luce di laser, ma oggetti in veloce movimento richiedono anche una durata totale di time-lapse video (ad es. mitocondri nei neuroni, che si muovono più frequentemente e a una velocità molto superiore a mitocondri in oligodendrociti, sono in genere imaged ogni secondo per un totale di 2 minuti ¹⁶).
14. Avviare la registrazione time-lapse.
    Nota: I mitocondri possono spostare fuori fuoco o deriva dalla regione imaged durante la registrazione. Per ridurre al minimo le vibrazioni e il movimento, regolare in - e prese del bagno e ridurre la velocità della pompa se necessario. Piccole modifiche a fuoco solitamente ancora verificarsi. Così, il monitoraggio continuo dello schermo durante la formazione immagine è richiesto, con piccole regolazioni della messa a fuoco durante la registrazione.
15. Catturare uno z-stack di tutta la cella per la futura identificazione della cella ed imaged processo.
    Nota: Per una migliore risoluzione, il foro stenopeico deve essere reimpostato su 1 unità arioso per lo stack di z.
16. Optional: visualizzare mielina non macchia.
    Nota: Negli oligodendrociti trasformati con GFP (citoplasmatica), i foderi di myelin può essere identificati solitamente come linee rette del citoplasma (le creste citoplasmatiche) collegati ad un processo primario (Vedi Figura 2 A e B). Tuttavia, se espressione di GFP è troppo debole o un marcatore citoplasmatico non viene utilizzato, è possibile visualizzare la guaina mielinica da microscopia confocal di riflessione (CoRe), come spiegato qui.
    1. Impostare un nuovo percorso di luce nel software con eccitazione laser a 488 nm e cattura emesso luce intorno alla stessa lunghezza d'onda, ad es. 470-500 nm.
    2. Regolazione potenza del laser e guadagnare fino a quando la mielina è visibile (vedere esempio in < forte classe = "Xfig "> figura 3). Utilizzando un microscopio di LSM 510 Meta, generalmente utilizziamo un laser potente di 7-12 µW (misurata l'apertura posteriore dell'obiettivo).
17. Optional: preparazione delle fette per immunostaining.
    1. Se la cella imaged deve essere identificata dopo che immunostaining, acquisire un'immagine di basso ingrandimento (10x) della cella e indicare la sua posizione nell'immagine disegnando una freccia o simili. Per facilitare il rilevamento della cella, è consigliabile anche disegnare una mappa manuale della fetta intera, che indica la posizione della cella.
    2. Fix affettare in paraformaldeide al 4% (PFA) agitatore per 1 ora a temperatura ambiente.
       Attenzione: PFA è nocivo. Utilizzare indumenti e solo in un cappuccio ventilato.
    3. Diluire il fissativo 01:10 in PBS e lasciare a 4 ° C fino a partire immunohistochemistry come descritto altrove ¹⁷.
       Nota: Sebbene fette possono essere lasciati in fissativo diluito per diverse settimane, fluorescenza può sbiadire. Esecuzione di immunohistochemistry entro 10 giorni della fissazione è raccomandato.

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Risultati

Fettine di cervello organotipiche che sono state coltivate e trasdotte come sopra descritto ha mostrato una distribuzione sparsa di oligodendrociti corticali esprimendo mito_dsred e GFP. Immunostaining con gli anticorpi contro Olig2 e MBP ha confermato che l'espressione era specifico per gli oligodendrociti (Figura 1).

Per l'imaging in vivo, gli oligodendrociti trasdotte sono stati riconosciuti dall...

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Discussione

Il protocollo per la fabbricazione di colture organotipiche descritti qui è una versione modificata¹⁸ del protocollo descritto da De Simoni e Yu (2006)⁵. Le modifiche più importanti sono state delineate di seguito. Tampone Tris è aggiunto al terreno di coltura, che migliora la sopravvivenza delle fette quando di fuori dell'incubatore durante la trasduzione virale e dalla sostituzione della medium delle cellule. La procedura di sterilizzazione per confetti è anche cambia...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma	A9539
BD Microlance 19G	BD	301500	Needles used for in- and outlet of bath
Bioxide gas	AGA	105701
Brand pipette bulbs	Sigma-Aldrich	Z615927	Pipette bulbs
Bunsen burner (Liquid propane burner)	VWR	89038-530
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	64-0106	Temperature controller - thermometer part
CaCl2	Fluka	21100
CO2	AGA	100309	CO2 for incubator
Cover glass, square Corning	Thermo  Fischer Scientific	13206778	To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021
Delicate forceps	Finescience	11063-07	For dissection
Diamond scriber pen	Ted Pella Inc.	54463
Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm	VWR	612-1702	Glass pipettes
Double edge stainless steel razor blade	Electron Microscopy Sciences	#7200	Razor blade for vibratome
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)	Gibco-Invitrogen	24010-043
Filter paper circles	Schleicher & Schuell	300,220	Filter paper used for filtration of PFA
Fun tack	Loctite	1270884	Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath
Hand towel C-Fold 2	Katrin	344388
Harp, Flat for RC-41 Chamber,	Warner Instruments	64-1418	Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15
HEPES, FW: 260.3	Sigma	H-7006
Holten LaminAir, Model 1.2	Heto-Holten	96004000M	Laminar flow hood
Horse serum, heat inactivated	Gibco-Invitrogen	26050-088
KCl	Sigma	P9541
LCR Membrane, PTFE,	Millipore	FHLC0130	Confetti
Leica VT1200	Leica	14048142065	Vibratome
MEM-Glutamax with HEPES	Thermo  Fischer Scientific	42360024
MgCl2	R.P. Normapur	25 108.295
Micro Spoon Heyman Type B	Electron Microscopy Sciences	62411-B	Small, rounded spatula with sharpened end for dissection
Millex-GP filter unit	Millipore	SLGPM33RA	Syringe filter unit
Millicell cell culture insert, 30 mm	Millipore	PICM03050	Cell culture inserts
Minipuls 3 Speed Control Module	GILSON	F155001	Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NaHCO3	Fluka	71628
Nunclon Delta Surface	Thermo  Fischer Scientific	140675	Culture plate
Nystatin Suspension	Sigma-Aldrich	N1638
Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC	Zeiss	441452-9900-000	Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR
Parafilm	VWR	291-1211
Paraformaldehyde, granular	Electron Microscopy Sciences	#19208
PC-R perfusion chamber	SiSkiYou	15280000E	Bath for live imaging
Penicillin-Streptomycin, liquid	Invitrogen	15070-063
Petri dish 140 mm	Heger	1075	Large Petri dish
Petri dish 92x16 mm	Sarstedt	82.1473	Medium Petri dish
Petridish 55x14,2 mm	VWR	391-0868	Small Petri dish
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P4417	PBS tablets
R2 Two Channel Head	GILSON	F117800	Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)
Round/Flat Spatulas, Stainless Steel	VWR	82027-528	Large spatula for dissection
Sand paper	VWR	MMMA63119	Optional, for smoothing broken glass pipettes
Scissors,  17,5 cm	Finescience	14130-17	Large scissors for dissection
Scissors, 8,5	Finescience	14084-08	Small, sharp scissors for  dissection
Single edge, gem blade	Electron Microscopy Sciences	#71972	Single edge razor blade
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	Temperature controller - heater part
Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm	Millipore	SCGPT05RE	Filter to sterilize solutions
Super glue precision	Loctite	1577386
Surgical scalpel blade no. 22	Swann Morton Ltd.	209	Rounded scalpel blade
Temperature controller TC324B	Warner Instruments	64-0100	Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)
Trizma base	Sigma	T1503
Trizma HCl	Sigma	T3253
Water jacketed incubator series II	Forma Scientific	78653-2882	Incubator