Preparazione di idrogeli iniettabili a base di chitosano e la sua applicazione nella coltura cellulare 3D

Riepilogo

Qui descriviamo una facile preparazione di idrogeli iniettabili a base di chitosano usando immina dinamica chimica. Metodi per regolare la resistenza meccanica di idrogel e la sua applicazione nella coltura cellulare 3D sono presentati.

Abstract

Il protocollo presenta un metodo facile, efficiente e versatile per preparare idrogel a base di chitosano usando immina dinamica chimica. L'idrogel è preparata mescolando soluzioni di glicole chitosano con un gelator di polimeri sintetizzati benzaldeide terminato e idrogeli sono ottenuti in modo efficiente in diversi minuti a temperatura ambiente. Dai vari rapporti tra glicole chitosano, gelator di polimero e contenuto di acqua, idrogel versatile con tempi di gelificazione differenti e rigidità sono ottenuti. Quando danneggiato, l'idrogel può ritrovare apparenze e modulo elastico, dovuto la reversibilità delle obbligazioni immina dinamico come crosslinkages. Questa proprietà auto-sanabile consente l'idrogel di essere iniettabili, poiché esso può essere auto-guarito da pezzi spremuti da un idrogel di massa integrale dopo il processo di iniezione. L'idrogel è anche multi-sensible a reagire a molti stimoli di bio-attivi a causa di Stati di equilibrazione differenti delle obbligazioni immina dinamico. Questo idrogel è stata confermata come bio-compatibili e cellule di fibroblasti di topo L929 erano incorporate seguenti procedure standard e la proliferazione delle cellule è stata valutata facilmente tramite un processo di coltivazione di cella 3D. L'idrogelo in grado di offrire una piattaforma regolabile per diverse ricerche dove è profittato di un mimo fisiologico di un ambiente 3D per le cellule. Insieme alle sue proprietà multi-reattivo, self-sanabile e iniettabili, nel caso degli idrogeli potenzialmente può essere applicato come elementi portanti multipli per farmaci e cellule in future applicazioni bio-medicali.

Introduzione

Idrogeli sono materiali polimerici reticolati con grandi quantità di acqua e morbido proprietà meccaniche, e sono stati utilizzati in molte applicazioni bio-medicali^1,2. Idrogeli possono offrire un ambiente morbido e bagnato, che è molto simile all'ambiente fisiologico per cellule in vivo. Di conseguenza, idrogeli sono diventati uno dei più popolari impalcature per cella 3D cultura^3,4. Rispetto alla coltura delle cellule 2D di Petri, coltura cellulare 3D ha avanzato velocemente per offrire che una matrice extracellulare (ECM) ha imitato il microambiente per celle da contattare e montare per proliferazione e differenziazione di scopi⁵. Inoltre, idrogeli contenenti polimeri naturali potrebbero offrire ambienti bio-compatibili e promozione per le cellule di proliferare e differenziare³. Idrogeli derivati da polimeri sintetici sono preferibili per i loro componenti semplici e chiare, che escludono le influenze complesse come proteine di origine animale o virus. Tra tutti i candidati di idrogel per colture cellulari 3D, idrogeli che facilmente sono preparati e hanno una proprietà coerente sono sempre preferiti. La possibilità di regolare le proprietà di idrogel per soddisfare i requisiti di ricerca differenti è importante come ben⁶.

Qui vi presentiamo una facile preparazione di un idrogel a base di chitosano glicole usando immina dinamica chimica, che diventa una piattaforma versatile idrogel per cella 3D cultura⁷. In questo metodo, noto bio-compatibili glicole chitosano vengono utilizzati per stabilire cornici delle reti di idrogel. Suoi gruppi amminici sono ha reagiti con un glicole di polietilene benzaldeide terminato come il gelator di polimeri per formare legami immina dinamico come crosslinkages di idrogeli⁸. Immina dinamico obbligazioni possono formare e si decompongono reversibilmente e responsabilmente ai dintorni, dotando l'idrogel con reticolati regolabile meccanicamente reti^9,10,11. A causa del suo contenuto di acqua alta, materiali bio-compatibili e resistenze meccaniche regolabili, l'idrogel è applicato con successo come impalcatura per celle L929 in cella 3D cultura^12,13. Il protocollo qui i dettagli delle procedure, tra cui la sintesi del polimero gelator, idrogel preparazione, l'incorporamento delle cellule e coltura delle cellule 3D.

L'idrogel Mostra anche diverse altre caratteristiche grazie alla sua dinamica immina crosslinkages, tra cui il multi-sensible a reagire ai vari bio-stimoli (acido/pH, piradossale derivato di vitamina B6, papaina proteine, ecc.), che indica che potrebbe essere l'idrogel indotto a decomporsi sotto condizioni fisiologiche⁸. L'idrogel è anche self-sanabile e iniettabili, che significa l'idrogel potrebbe essere amministrato per mezzo di un metodo di iniezione invasiva minimale e ottenere un vantaggio in droga e cella consegne^14,15. Con l'aggiunta di additivi funzionali o gelators polimero specifico predefiniti, l'idrogel è compatibile per ottenere proprietà specifiche come magnetico, temperatura, pH sensibile, ecc.^16,17, che potrebbe compiere un vasta gamma di esigenze di ricerca. Tali proprietà rivelano la capacità potenziale di idrogel per essere un iniettabile più vettori per farmaci e cellule sia in vitro che in vivo ricerca bio-medica e applicazioni.

Protocollo

Attenzione: si prega di consultare tutte le schede di dati di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Si prega di utilizzare pratiche adeguate di sicurezza durante gli esperimenti di chimica, compreso l'uso di una cappa aspirante e dispositivi di protezione individuale (occhiali protettivi, guanti protettivi, camice da laboratorio, ecc.). Il protocollo richiede cella standard gestione tecniche (sterilizzazione, recupero delle cellule, cellule passaggio, congelamento delle cellule, macchiatura delle cellule, ecc.).

1. preparazione di idrogeli

1. sintesi della benzaldeide terminato funzionalizzati di polietilene glicole (spina DF)
   1. pre-essiccazione di PEG polimero
      1. pesare 4,00 g PEG (4.000 MW, 1.00 mmol), trasferirla in un pallone a fondo tondo (250 mL) e aggiungere toluene (100 mL).
         Nota: Altre pioli con diversi pesi molecolari può lavorare per la formazione di idrogel ma porterà a diversa rigidezza.
      2. Riscaldare la soluzione da una pistola di calore (o un piatto caldo intorno ai 40 ° C) leggermente per aiutare a sciogliere tutti i polimeri. Dopo tutti i polimeri si dissolvono, è possibile utilizzare un evaporatore per rimuovere tutti i solventi. Ripetere questo processo secco e sciogliere due volte per rendere il PEG secche polimeri.
         Attenzione: Questa operazione deve essere eseguita in una cappa con estrema cura. Il toluene è infiammabile.
   2. Reazione di terminazione di benzaldeide di PEG
      1. aggiungere un agitatore magnetico e tetraidrofurano (THF, 100 mL) al pallone e sciogliere PEG con un agitatore. Aggiungere 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6,0 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (0,07 g, 0,6 mmol) in sequenza per le soluzioni di sciogliere tutti i solidi completamente.
      2. Aggiungi N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6,0 mmol) alla soluzione e aggiungere un tubo di essiccazione che viene riempito con anidro CaCl ₂ al pallone. Mantenere la reazione sotto agitazione a temperatura ambiente (~ 20 ° C) per circa 12 h.
   3. Processo di post-reazione
      1. filtrare i solidi bianchi generati nella soluzione di vuoto dopo la reazione è completa. Versare la soluzione nel freddo etere dietilico (500 mL) sotto agitazione per precipitare i solidi bianchi. Raccogliere tutti i solidi bianchi dal filtro e la sostanza secca in una cappa aspirante.
      2. Dissolversi ancora i solidi bianchi in THF, filtrare qualsiasi solidi bianchi insolubili, versare la soluzione nel fresco freddo etere etilico per precipitare i solidi bianchi e asciugarlo. Ripetere questo processo due o tre volte e quindi posizionare i solidi bianchi in un forno di essiccazione sotto vuoto (20 ° C, 0,1 mbar) per asciugarle completamente. Raccogliere la polvere bianca come il prodotto finale: benzaldeide terminato DF PEG.
2. Preparazione di idrogeli
   1. pesare quantità diverse di DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol; 0,22 g, 0.055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) in un tubo (10 mL), aggiungere acqua deionizzata (5,0 mL) e utilizzare un vortice o agitatore magnetico per aiutare sciogliere il polimero.
   2. Sciogliere glicole chitosano (0,495 g, 6,18 x 10 ^-3 mmol) in acqua deionizzata (15,0 mL) in un tubo (50 mL) e utilizzare un vortice per pochi minuti per omogeneizzare la soluzione di chitosano (3% in peso).
   3. Aggiungere la soluzione di chitosano di glicole (0,2 mL, 3% in peso) e soluzioni di PEG DF (0,2 mL) in sequenza in un tubo (2,0 mL). Utilizzare un vortice per mescolare le soluzioni in modo omogeneo a forma idrogel in alcuni minuti. Seguire i rapporti nella tabella 1 per rendere idrogeli di resistenze meccaniche differenti.
      Nota: Utilizzare il metodo invertente tubo per determinare se l'idrogel è già formato.
3. Analisi di reologia
   1. effettuare analisi di reologia su un reometro rotazionale con una piastra di acciaio parallela (diametro: 20 mm). Per la prova di gelificazione, pubblicizza chitosano glicolata (0,2 mL, 3% in peso) su una piastra inferiore. Aggiungere soluzioni acquose DF PEG (0,2 mL, 2% in peso) uniformemente goccia a goccia sulla superficie della soluzione del chitosano, quindi mescolare rapidamente con una pipetta. Più basso giù la piastra superiore e cominciano a test.
   2. Per idrogel ' prova di rigidezza s, tagliare un idrogel in un cerchio (diametro: 20 mm) e misurare il modulo elastico (G ') valori contro analisi di frequenza al 1% di deformazione. Tipico G ' valori a 6,3 rad s ^{− 1} sono elencati nella tabella 1.
      Nota: Effettuare le analisi di reologia di idrogel 0,5 h dopo la formazione di idrogel per garantire la stabilizzazione dinamica legame dell'idrogel.
   3. Per l'idrogel ' s self-sanabile proprietà testare, tagliare un idrogel a pezzi e raccogliere i pezzi insieme a Self-Heal a un pezzo integrale. Quindi tagliare il pezzo di idrogel per fare un cerchio (diametro: 20 mm) e metterlo sul reometro per eseguire l'analisi di reologia.

2. colture cellulari 3D in idrogel

1. preparazione delle soluzioni di gelificazione di idrogel
   1. pesare DF PEG (0,44 g, 0,11 mmol) in una provetta sterile (4,0 mL), aggiungere in terreni di coltura delle cellule (RPMI-1640, 2.0 mL) e utilizzare un vortice o agitatore per aiutare a sciogliere il polimero per ottenere la soluzione di polimero (20% in peso). Caricare la soluzione in una siringa (10,0 mL) e poi sterilizzarlo facendolo passare attraverso un filtro batteri ritentiva micron (0,22 µm).
   2. Pesare il chitosano di glicole (0,165 g, 2.06 x 10 ^-3 mmol) in una provetta sterile (15,0 mL), aggiungere in terreni di coltura delle cellule (RPMI-1640, 4,0 mL) e vortex per aiutare a sciogliere il polimero per ottenere la soluzione di glicole chitosano (4,0% in peso). Caricare la soluzione in una siringa (10,0 mL) e filtrare con un filtro di batteri a rimanenza da 0,22 µm.
2. Colture cellulari in idrogel
   Attenzione: eseguire tutto cella procedure correlate in una cappa di coltura del tessuto. Conoscenza di base della tecnica sterile è previsto.
   1. Preparazione della sospensione di cellule
      1. cultura L929 cellule in RPMI-1640 supplementato con 10% FBS, 5% penicillina (10 mL) in un Petri dish (diametro 10 cm) e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂. Modificare il mezzo ogni giorno prima dell'uso.
      2. Raccogliere le celle L929 con PBS contenente tripsina (0,025% w/v) ed EDTA (0,01% w/v), poi centrifugare (5 min a 70 x g) e risospendere le cellule nel medium RPMI-1640 (1,0 mL). Eseguire la conta cellulare utilizzando standard di funzionamento del Consiglio di sangue-conteggio. Risospendere le cellule per regolare la concentrazione cellulare di ~ 3,75 × 10 ⁶ cellule/mL.
   2. Incapsulamento di cellule in idrogel
      1. mescolare le sospensioni di cellula L929 (0,4 mL, 3.75 x 10 ⁶ cellule mL ^-1) con chitosano glicolata (0,4 mL) in un tubo (4,0 mL) Vortex. Dispensare la soluzione di chitosano L929/glicole (0,8 mL) in al centro di un piatto di Petri confocale (diametro 2,0 cm). Pipettare le soluzioni DF PEG (0,2 mL) nello stesso piatto e pipettare delicatamente per mescolare la soluzione e inducono la formazione di idrogel.
         Nota: Valutare la formazione di idrogel inclinando il piatto petri.
      2. Per la coltura cellulare diretto, aggiungere ulteriori quantità di terreni di coltura RPMI-1640 (1,0 mL) in cima l'idrogel. Mettere l'idrogel di cella incorporato (1,0 mL, 1.5 wt % glicole chitosano, 4,0 wt % DF PEG, 1,5 × 10 ⁶ cellule mL ^-1) in un incubatore (37 ° C, 5% CO ₂) e cambiare il mezzo ogni giorno. Preparare per l'imaging delle cellule il giorno 1, 3, 5 e 7 dopo incapsulamento cella.
   3. Della cultura post-cella 3D in idrogel dopo l'iniezione, preparare cella caricata idrogel (1,0 mL, vedi punto 2.2.2) in una siringa (10,0 mL, ago 48 G). Dopo le forme di idrogel, iniettare lentamente l'idrogel in una capsula Petri per imaging confocale. Aggiungere un importo supplementare di terreni di coltura (1,0 mL) in cima l'idrogel e cambiare ogni giorno. Mettere la capsula di Petri in un incubatore (37 ° C, 5% CO ₂) e preparare per l'imaging in seguito.
      Attenzione: Si prega di controllare e seguire il protocollo di funzionamento di sicurezza di una siringa.
3. Analisi di attuabilità delle cellule
   1. confocale osservazione
      1. Sciacquare l'idrogel con PBS (1,0 mL) per due volte. Macchia nel caso degli idrogeli con diacetato di fluoresceina (FDA, 0,5 mL, 0,05 mg/mL) e soluzioni di propidio ioduro (PI, 0,5 mL, 0,08 mg/mL) per 15 min. Dopo la colorazione, rimuovere tutti i solventi.
      2. Osservare nel caso degli idrogeli utilizzando un microscopio confocale in lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm e 543 nm di visualizzare dal vivo e morto cellule, rispettivamente. Prendere z-stack attraverso ogni profondità di 2 µm di idrogeli per convalidare una distribuzione uniforme delle cellule in tutto.
         Nota: FDA macchie cellule vive mentre le cellule morte di macchie PI.
   2. Degradare l'idrogel (1,0 mL) con acido acetico (HAc, 3% v, 1,0 mL) per 5 min e pipettare in una provetta (4,0 mL). Raccogliere le cellule di centrifuga (70 x g, 5 min) e risospendere le cellule in terreno di coltura cellulare di RPMI-1640 (1,0 mL). Eseguire la conta cellulare utilizzando un sangue conteggio pensione.

Risultati

Una presentazione schematica di questo protocollo su idrogel preparazione e il suo uso come coltura cellulare 3D è offerto nella Figura 1. Informazioni di idrogel Sommario e rapporti preparati con diversi punti di forza meccaniche sono riassunta nella tabella 1. L'idrogel di self-sanabile e proprietà di reologia presenta rigidità di idrogel di modulo elastico contro frequenza test nella Figura 2. Le immagini confocal cellulare e numeri di cel...

Discussione

L'idrogel presentato in questo protocollo (Figura 1) ha due componenti principali: il chitosano di glicole di polimero naturale e un sintetico benzaldeide terminato gelator polimero DF PEG, che sono entrambi materiali biocompatibili. Sintesi di DF PEG sono presentata utilizzando una reazione di modificazione di uno stadio. PEG del peso molecolare 4.000 fu scelto nel presente protocollo per preoccupazioni di solubilità, efficienza di modificazione, come pure la rigidità di idrogel. Una seri...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycol chitosan	Wako Pure Chemical Industries	39280-86-9	90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	619-66-9	99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	538-75-0	99%
Calcium chloride anhydrous	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	10043-52-4	96%
4-dimethylamiopryidine	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	1122-58	99%
Polyethyleneglycol	Sino-pharm Chemical Reagent	5254-43-7	99%
Tetrahydrofuran	Sino-pharm Chemical Reagent	109-99-9	99%
Toluene	Sino-pharm Chemical Reagent	108-88-3	99%
Ethyl ether	Sino-pharm Chemical Reagent	60-29-7	99%
Acetic acid	Sino-pharm Chemical Reagent	64-19-7	99%
Anhydrous CaCl2	Sino-pharm Chemical Reagent	10043-52-4	99%
Fluorescein diacetate	Sigma	596-09-8	99%
Propidium iodide	Sigma	25535-16-4	94%
RPMI-1640 culture media	Gibco
Fetal bovine serum	Gibco
Trypsin-EDTA	Gibco		0.25%
PBS	Solarbio		0.01 M
Penicillin streptomycin solution	Hyclone		10,000 U/mL
Rheometer	TA Instrument		AR-G2
Confocal microscope	Zeiss		710-3channel
L929 Cells	ATCC		NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator	EYELA		N-1100
48 guage needle	ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD		48-guage
Microscope	Leica		DM3000 B
Microscope software	Imaris
Heat gun	Confu		KF-5843
Petri dish	NEST