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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo del presente protocollo è quello di consentire il rilevamento in vivo di uccisione di una cella di destinazione in un modello murino di antigene-specifiche.

Abstract

Metodologie attuali per l'uccisione di antigene-specifiche sono limitate per uso in vitro o utilizzati in modelli di malattie infettive. Tuttavia, c'è non un protocollo specificamente destinato a misurare antigene-specifiche uccisione senza un'infezione. Questo protocollo è stato progettato e descrive i metodi per superare queste limitazioni, consentendo per la rilevazione dell'antigene-specifiche uccidendo una cella obiettivo di CD8+ T cells in vivo. Ciò avviene mediante l'Unione di un modello di vaccinazione con un tradizionale CFSE-etichetta target uccidendo il dosaggio. Questa combinazione consente al ricercatore di valutare il potenziale CTL di antigene-specifiche direttamente e velocemente come il dosaggio non è dipendente della crescita del tumore o infezione. Inoltre, la lettura si basa sulla citometria a flusso e quindi dovrebbe essere facilmente accessibile alla maggior parte dei ricercatori. La limitazione principale dello studio consiste nell'identificare la timeline in vivo che è appropriato per l'ipotesi in fase di test. Variazioni nella forza di antigene e mutazioni nelle cellule T che possono derivare in funzione citolitica differenziale devono essere attentamente valutati per determinare il momento ottimale per la raccolta delle cellule e valutazione. La concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per hgp10025-33 e OVA257-264, ma occorrerebbero ulteriori convalida per altri peptidi che potrebbero essere più appropriati per un determinato studio. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.

Introduzione

Protocolli multipli esistono per valutare il potenziale citolitica (CTL) di un CD8+ o CD4+ T-cellula. Questa valutazione può essere facilmente fatto in vitro sotto condizioni controllate1,2,3. Inoltre, modelli di malattia infettiva, come LCMV, classicamente hanno esaminato la funzione CTL attraverso l'uso di differenzialmente CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) etichettati cellule bersaglio dove il CFSECiao-sono cellule con etichettate ha pulsato con un peptide e CFSElo-pulsati cellule rimangono contrassegnati dell'obiettivo. Le cellule sono poi iniettate con un rapporto 1:1 e valutate per la perdita della CFSECiao-etichettato pulsati obiettivi di flusso cytometry4. Modelli di vaccino e rifiuto hanno utilizzato anche strategie simili per valutazione di in vivo uccidendo entrambi CD8+ e CD4+ T cellule così come cellule NK5,6. Questo è un potente, ma richiede l'uso di agenti infettivi che innescano il sistema immunitario prima dell'iniezione di destinazione.

Questo protocollo, d'altra parte, non richiede nessuna infezione priore dell'host e invece utilizza una strategia di vaccinazione per primo il sistema immunitario prima dell'iniezione di destinazione. Questa vaccinazione è composto da una formulazione a base di acqua di vaccino del peptide che richiede la fornitura di un immunostimolante cocktail chiamato covax7, costituito da un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista (imiquimod crema), un anti-CD40 agonistico l'anticorpo e l'interleuchina 2 (il-2) che conduce alla combinazione sinergica di immunostimulatory agenti per l'ottenimento dei peptidi specifici adescamento e risposta immunitaria robusta. Come tale, questo test fornisce una rapida lettura della funzione CTL come il vaccino è somministrato insieme con le cellule per la valutazione della funzione solo tre giorni prima dell'iniezione delle cellule bersaglio. Inoltre, l'innesco di covax è abbastanza forte che si può vedere la capacità di uccisione della cellula T antigene-specifiche innescata tra 4 e 24 h dopo l'iniezione.

La limitazione principale di questo protocollo è l'identificazione della timeline in vivo per la rilevazione dell'uccisione di destinazione che è opportuno sia l'antigene e l'ipotesi da testare. Attenta valutazione deve essere effettuata, come variazioni nella forza di antigene così come le alterazioni genetiche in cellule di T in fase di test potrebbe causare funzione differenziale di CTL che richiederebbe un rilevamento di tempi diversi di uccisione di destinazione. Inoltre, mentre la concentrazione appropriata del peptide per la vaccinazione è stata ottimizzata per melanoma umano antigene glicopeptide 100 (hgp10025-33) e ovoalbumina257-264 (OVA257-264)8,9 , uso di un altro modello di antigene che può essere più appropriato per un dato studio richiederebbe ulteriore convalida. A causa delle differenze attese nella capacità degli antigeni di un obiettivo di stimolare la CTL effettrici funzione in combinazione con il covax come adiuvante, ottimizzazione della frequenza di concentrazione e dose dose IL-2 può essere essenziale per raggiungere l'obiettivo desiderato. Nel complesso, questo protocollo permette una rapida valutazione di uccidere funzione in vivo e può essere adattato a qualsiasi antigene specifico.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Texas MD Anderson Cancer Center.

1. preparazione del Peptide per il vaccino

  1. Sciogliere il peptide liofilizzato con tampone fosfato salino (PBS) alla concentrazione appropriata e vortexare per 30 s.
    Nota: Per hgp10025–33, la concentrazione finale è 1 mg/mL e per OVA257–264, la concentrazione finale è di 0,5 mg/mL. Ricostituire il peptide prima dell'iniezione. Non conservare dopo la ricostituzione.

2. isolamento di Splenocytes dai topi transgenici

Nota: Isolamento delle cellule dalla milza deve essere eseguita in modo sterile.

  1. Eutanasia il topo transgenico di OT-1 utilizzando il metodo approvato di CO2 asfissia e rimuovere la milza.
    Nota: Mouse transgenico appropriato viene utilizzato in questo passaggio specifico per il peptide di scelta.
    1. Posare il mouse sul suo lato destro. Spruzzare il lato sinistro del mouse con 70% di etanolo (EtOH). Tirare la pelle usando il forcipe e tagliare la pelle utilizzando forbici chirurgiche; la milza sarà visibile all'interno della cavità peritoneale. Squartato delicatamente la cavità peritoneale per accedere la milza. Rimuovere la milza usando il forcipe.
  2. Disaggregare la milza inserendola in un filtro di 70 µm in una capsula di Petri con medium 2 mL A (PBS con 1% siero bovino fetale (FBS)) e fracassare la milza con l'estremità di un pistone.
    1. Raccogliere gli splenocytes dalla capsula di Petri e posto in una provetta conica da 50 mL. Lavare la capsula di Petri con 5 mL di terreno A due volte per raccogliere tutte le celle. Aggiungere il terreno A fino a 25 mL e centrifugare le cellule per 5 min a temperatura ambiente a 475 x g.
  3. Aspirare le cellule e risospendere in 1ml / al buffer di lisi di globuli rossi (RBC) della milza. Incubare a temperatura ambiente per 5 min, aggiungere 10 mL di medium A e centrifuga a temperatura ambiente a 475 x g. Risospendere il pellet in 10 mL di medium A e rimuovere detriti filtrando la sospensione cellulare attraverso un filtro di 70 µm in un pulito 50 mL conico.
  4. Contare le celle utilizzando trypan blu e un emocitometro. Risospendere le cellule in PBS a una concentrazione finale di 106 - 1006 cellule/mL. Per gli ovuli257–264 specifiche uccidendo, risospendere a 106 cellule/mL e per hgp10025–33 specifico uccidendo, risospendere a 1006 cellule/mL.
    1. Giro le celle rimanenti a temperatura ambiente per 5 min a 475 x g. aspirare il supernatante e risospendere in 15 mL di PBS freddo per lavare le cellule. Ripetere il passaggio di lavaggio una volta di più. Spin, le celle a temperatura ambiente per 5 min a 475 x g. aspirare il supernatante e risospendere in PBS freddo secondo il volume finale determinato al punto 2.4.
    2. Trasferire la sospensione unicellulare a un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL e tenere il ghiaccio fino a iniezione nel destinatario del topo C57/BL6.

3. iniezione di Splenocytes dai topi transgenici

  1. Mouse di C57/BL6 destinatario posto in un dispositivo di ritenuta, dal lato dorsale. Area base coda di spruzzo iniezione con alcool isopropilico al 70%. Somministrare per via endovenosa 100 µ l di sospensione unicellulare (sezione 2) nella vena caudale utilizzando un ago da 27 G con il lato smussato rivolto verso l'alto.

4. Covax amministrazione

Nota: Se le cellule vengono iniettate nel pomeriggio, covax deve essere somministrata la mattina seguente all'interno 18 h dell'iniezione di cellule.

  1. Posizionare il mouse in una scatola chiara anestesia con isoflurano 1-3%. Dopo topi sono completamente anestetizzati, trasferire i topi per i coni di naso attaccati al collettore nella camera di anestesia. Tenere topi trattenuti con il lato dorsale fino.
    Nota: Amputate è confermata da un pizzico di breve punta per verificare che non è suscitata una risposta di ritiro. Legge federale limita isoflurano uso nell'ordine di un veterinario autorizzato.
  2. Area base coda di spruzzo iniezione con alcool isopropilico al 70%. Iniettare per via sottocutanea 100 µ l di soluzione di peptide (dalla sezione 1) utilizzando un ago da 27 G con la siringa penetrando 4-5 mm della regione base della coda, il lato di smussatura dell'ago rivolto verso l'alto.
    Nota: I topi sono vaccinati in un fianco con iniezione sottocutanea alla base della coda10.
  3. Iniettare 100 laterale di anticorpo (0,5 mg/mL di brodo) anti-CD40 µ l al sito di iniezione di vaccino.
  4. Applicare attentamente la crema del imiquimod 50 mg/mouse sui siti di vaccinazione. Strofinare la crema del imiquimod sulla superficie fino a quando la crema non è più visibile e viene completamente assorbita.
  5. Iniettare 100 µ l di proteina rhIL-2 100.000 IU/mL per via intraperitoneale (i.p.) alla regione addominale inferiore. Osservare, topi per 5 min dopo il loro recupero completamente dall'anestesia.
    Nota: Esperimento è in pausa a questo punto per 3 giorni.

5. isolamento degli Splenocytes Target per l'etichettatura con CFSE

Nota: Isolamento delle cellule dalla milza deve essere eseguita in modo sterile.

  1. Eutanasia i topi C57BL/6 secondo metodo approvato di asfissia2 CO. Rimuovere spleen(s) come descritto al punto 2.1.1. Disaggregare la milza e lavare gli splenocytes come nei passaggi 2.2.1 - 2.2.3. Lisare cellule di anima rosse come nei passaggi 2.3 - 2.3.2.
  2. Rimuovere le cellule per il conteggio utilizzando un emocitometro e calcolare per una concentrazione finale di cellule a 106 cellule/mL in soluzione CFSE-etichettatura (descritta nel passaggio 7). Spin rimanenti celle a temperatura per 5 min a 475 x aspirare il surnatante g..

6. peptide pulsare dei Target Splenocytes

Nota: Peptide pulsare deve essere eseguita in modo sterile.

  1. Risospendere le cellule a 106 cellule/mL in completa per i media (media di RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-Glutammina (L-Gln), 1% di penicillina/streptomicina (Pen/Strep)). Dividere le celle in 2 tubi (15ml coniche). Etichettare ogni provetta come pulsato o pulsati.
  2. Aggiungere peptide nella provetta etichettata pulsata. Per gli ovuli257–264 pulsare, aggiungere 1 µ g/mL e per hgp10025–33 pulsare, aggiungere 2 µ g/mL.
    Nota: Le cellule pulsate subiscono la stessa incubazione delle cellule pulsata solo senza l'aggiunta del peptide.
    1. Incubare le cellule + peptide a 37 ° C per 1 h.
  3. Aggiungere 10 mL di completa per i media (media di RPMI 1640 con 10% FBS, 1% L-Glutammina (L-Gln), 1% di penicillina/streptomicina (Pen/Strep)) in ogni provetta per lavare entrambi pulsata e pulsati cellule bersaglio. Spin rimanenti celle a temperatura per 5 min a 475 x aspirare il surnatante g..

7. preparazione di CFSE per etichettare gli Splenocytes Target

  1. Preparare la soluzione di etichettatura CFSE durante la cella di lavaggio nel passaggio 6.3; le cellule pulsate saranno etichettate come CFSECiao e i pulsati CFSElo. Preparare 1 mL di soluzione di CFSE-etichettatura per 106 cellule.
    Nota: CFSE è sensibile alla luce e deve essere protetto dalla luce a tutte le ore.
    1. Preparare CFSECiao -etichettatura media aggiungendo 1 uL/mL CFSE (soluzione 5 mM) per una concentrazione finale di 5 µM/mL in media RPMI 1640 con 2% FBS.
    2. Preparare CFSElo -etichettatura media aggiungendo 1 uL/mL CFSE (soluzione 0,5 mM) per una concentrazione finale di diluitore da 0,5 µM/mL RPMI 1640 con 2% FBS.

8. etichettatura degli Splenocytes Target con CFSE

Nota: CFSE etichettatura deve essere eseguita in modo sterile.

  1. Risospendere le cellule bersaglio pulsata e pulsati (dal punto 6.3) presso CFSE-etichettatura media di 106 cellule/mL. Risospendere le cellule pulsate con preparati CFSECiao-etichettatura media e le cellule pulsate con preparati CFSElo-etichettatura media.
  2. Cellule di mix e CFSE-etichettatura media da inversione leggera o vorticoso. Non mescolare nel Vortex. Incubare le cellule e CFSE-Etichettatura supporti a 37 ° C per 15 min. Remix le cellule ogni 5 min.
  3. Aggiungere 10 mL di multimediale completo di ogni cellule tumorali sospensione e spin a temperatura ambiente per 5 min a 475 x g.
  4. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule in 10 mL di PBS freddo. Girare le cellule a 4 ° C per 5 min a 475 x g.
  5. Ripetere il punto 8.4.
  6. Contare le celle e mix peptide-pulsato, CFSECiao-etichettati con pulsati, CFSElo-etichettati cellule con un rapporto di 1:1 per iniezione in topi destinatari. Mantenere un'aliquota di 1 x 106 miscelati di cellule da utilizzare per una valutazione di cytometry di flusso basale (sezione 11).
    Nota: Il volume finale per iniezione è 100 µ l per topo. Il conteggio finale delle cellule è 10e6 cellule. Perdita di volume nella siringa e l'ago deve essere presa in considerazione e deve essere stimato a 500 µ l.

9. l'iniezione di cellule bersaglio

Nota: Tenere CFSE-labeled celle protette dalla luce prima e durante l'iniezione per quanto possibile.

  1. Inserire destinatari topi C57BL/6 in un dispositivo di ritenuta con il dorso verso l'alto. Area base coda di spruzzo iniezione con alcool isopropilico al 70%. Somministrare per via endovenosa 100 µ l di sospensione unicellulare nella vena caudale con il lato smussato rivolto verso l'alto.

10. re-isolamento delle cellule bersaglio

Nota: I tempi di questo passaggio sono fondamentale e dipende la citotossicità CTL e la forza dell'antigene per la stimolazione. Per la valutazione di uccidere un bersaglio di OVA257–264 pulsato, le cellule hanno bisogno di essere raccolto 4-6 h dopo l'iniezione. Poiché le cellule CFSE-labeled sono luce milze sensibili, processo al buio.

  1. Eutanasia i destinatari topi C57BL/6 secondo il metodo approvato di CO2 asfissia.
  2. Rimuovere spleen(s) come descritto al punto 2.1.1. Disaggregare la milza e lavare gli splenocytes come nei passaggi 2.2.1 - 2.2.3. Lisare cellule di anima rosse come nei passaggi 2.3 - 2.3.2.
  3. Risospendere le cellule in cellule attivate la fluorescenza 1ml ordinamento buffer (FACs) (1% BSA + PBS) per la valutazione tramite flusso cytometry.

11. gating logica per determinare l'attività di CTL tramite flusso Cytometry

  1. Effettuare la valutazione dell'attività CTL utilizzando un protocollo di citometria a flusso standard. Acquisire le celle utilizzando il canale FITC su un citometro a flusso con un laser di 488 nm per eccitazione11.
    1. Cancello sui linfociti dal vivo utilizzando i parametri di forward scatter (FSC) vs side scatter (SSC). Subgate all'interno il cancello dal vivo del linfocita per la popolazione totale di CFSE-positivi.
      Nota: Le cellule iniettate con etichetta CFSE comporranno un piccolo sottoinsieme dei linfociti totali presenti nella milza. Le celle CSFE-positivo dovrebbero apparire come due popolazioni distinte sulla scala logaritmica.
    2. Utilizzare un formato di istogramma per determinare la percentuale dei pulsati (sinistra, CFSElo) con pulsato (destra picco, CFSECiao) popolazioni. Perdita di CFSECiao cellule indica l'attività di CTL antigene-specifiche.

Risultati

Prima dell'iniezione delle cellule bersaglio CFSE-etichetta, la miscela di 1:1 cella viene eseguita su un citometro a flusso per determinare le frequenze di base il CFSECiao sia CFSElo destinazione delle cellule. Figura 1 A Mostra la strategia di gating per rilevare i cambiamenti nelle popolazioni CFSE, un cancello iniziale viene effettuato utilizzando parametri FSC e SSC. Le cellule di CFSE-positive totale sono quindi s...

Discussione

Mentre questo protocollo è molto semplice, ci sono pochi passaggi critici che devono essere eseguite con cautela. L'innesco di covax dopo l'iniezione della cellula-T antigene-specifiche in fase di test è necessario vedere qualsiasi uccisione degli obiettivi pulsati. Mentre è possibile che la vaccinazione di base acqua covax crea uno stato infiammatorio acuto, per la fase infiammatoria cronica, sostituendo la formulazione a base di acqua di breve durata con un approccio basato su olio di antigene lento rilascio può pr...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è supportato da ricerche di NIH (A1R03AI120027 (RN) e 1R21AI20012 (RN)), Grant di ricerca istituzionali (RN), Start-up concedere (RN) e seme di MD Anderson CIC concedere (RN).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice Charles River027C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice Jackson Labs003831
hgp10025–33 CPCScientific834139KVPRNQDWL
OVA 257–264 CPCScientificMISC-012SIINFEKL
Imiquimod cream 5% Fougera51672-4145-6Aldara Cream
CD40-specific mAb BioXcellBE0016-2clone FGK4.5
rhIL-2 protein Hoffman LaRoche Inc136Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep KendallS-17474
PBSLife Technologies10010-023Phosphate Buffered Saline
FBSLife Technologies26140-079fetal bovine serum
RBC lysis buffer Life TechnologiesA10492-01red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
L-Glutamine Life Technologies25030081
Pen/StrepLife Technologies15140122penicillin/streptomycin
CFSELife TechnologiesC345545-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA)Sigma A4503
1.5 mL MCT graduated natural Fisher05-408-129microcentrifuge tube
70% ethanolFisherBP8201500EtOH
Trypan blue solution, 0.4%  Life Technologies15250-061
HemocytometerFisher267110
27 gauge needleBD305109
1 mL syringeBD309659

Riferimenti

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
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  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

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