Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

Riepilogo

Descriviamo un protocollo per misurare trasmigrazione dai monociti attraverso strati monomolecolari endoteliali umani e la loro successiva maturazione in cellule della gomma piuma. Questo fornisce un metodo versatile per valutare le proprietà atherogenic dei monociti isolati da persone con diverse patologie e per valutare i fattori nel sangue che possono migliorare questa propensione.

Abstract

Malattia coronarica (CAD) è delle cause principali di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Aterosclerosi, dei principali causa di CAD, è iniziata dalla trasmigrazione dei monociti immune innati a siti infiammatori del lipido depositato chiamato strisce grasse, che sono presenti nelle pareti arteriose del mezzo alle grandi arterie. La caratteristica fondamentale di patogena delle lesioni in questa fase iniziale di aterosclerosi è la maturazione dei monociti che migrano nelle arterie per formare cellule schiumose o macrofagi lipido-carichi. La considerevole prova sostiene l'ipotesi che il rischio di aterosclerosi è aumentato di condizioni infiammatorie croniche, malattie come l'artrite reumatoide e l'HIV, come pure l'invecchiamento generale di accompagnamento, e che questo rischio è previsto da monocito attivazione. Mentre modelli murini di fornire una buona piattaforma per studiare il ruolo dei monociti nel atherogenesis in vivo, richiedono alterazione genetica del metabolismo del colesterolo naturali e drastica alterazione delle diete normali del topo e hanno limitato l'idoneità per lo studio delle influenze atherogenic di malattie umane del comorbid. Questo ci ha motivato a sviluppare un modello umano in vitro per misurare il potenziale atherogenic di monociti isolati da individui con Stati di malattia definita. Attualmente, modelli umani in vitro sono limitanti in quanto valutano la formazione delle cellule di monocito trasmigrazione e schiuma in isolamento. Qui descriviamo un protocollo in cui monociti isolati da sangue del paziente trasmigrano in cellule endoteliali umane in una matrice di collagene di tipo 1, e viene misurata la loro propensione a maturare in cellule della gomma piuma in presenza o assenza di esogena del lipido. Il protocollo è stato convalidato per l'uso dei monociti umani purificati da individui con infezione da HIV e individui anziani non infetti da HIV. Questo modello è versatile e permette la formazione di monocito trasmigrazione e schiuma delle cellule deve essere valutata usando sia la microscopia o citometria a flusso, nonché a consentire la valutazione dei fattori atherogenic presenti nel siero o plasma.

Introduzione

Trasmigrazione del monocito è un passo cruciale nello sviluppo della placca aterosclerotica che può portare a trombosi, ictus e infarto miocardico. Le placche aterosclerotiche si sviluppano da strisce grasse, generalmente presente nei siti di flusso sanguigno oscillatorio basso in mezzo alle grandi arterie, dove depositato lipidica contribuisce all'attivazione endoteliale e localizzata infiammazione¹. I monociti sono reclutati alle cellule endoteliali in strisce grasse tramite proteine chemiotattica del monocito (ad esempio CCL2) e trasmigrano nei intima². A seguito di trasmigrazione, monociti possono formare i macrofagi atherogenic, lipido-carichi, chiamati cellule della schiuma in conseguenza l'assorbimento del lipido, sintesi del lipido, down-regulation di efflusso di colesterolo o una combinazione di fattori di cui sopra. I monociti possono anche accumulare lipidi nella circolazione e hanno un fenotipo 'schiumoso', possibilmente che predispongono le cellule per schiuma cellulare formazione^3,4. Cellule della gomma piuma sono la caratteristica distintiva delle strisce grasse e placche aterosclerotiche fase iniziale e la loro formazione è influenzata da mediatori infiammatori⁵e del lipido. In alternativa, i monociti hanno la capacità di invertire trasmigrano dall'arteria nella circolazione sanguigna⁶, eliminando dei lipidi dalla biancheria intima e di agire per mantenere la salute dell'arteria.

Determinare la propensione dei monociti ad trasmigrano attraverso endotelio arterioso e formare cellule di schiuma nel intima o invertire trasmigrano e trasportano lipidi fuori la placca, sono un requisito fondamentale per comprendere il ruolo dell'attivazione del monocito in aumento rischio aterosclerotico. Modelli murini di CADs quali aterosclerosi sono importanti nel delucidamento in tempo reale in vivo informazioni sullo sviluppo di fatty streak/aterosclerotica della placca. Tuttavia, questi modelli richiedono un'alterazione genetica del colesterolo naturale abilità di questi animali solitamente accoppiati con drastiche modifiche nella dieta (ad esempio il modello di dieta di ApoE-/-Western-tipo)^7,8, quindi, di elaborazione induzione non fisiologico accumulo di lipidi di circolazione livelli quali lo sviluppo della placca di unità. Questi modelli possono avere limitate rilevanza a condizioni umane infiammatorie croniche quali l'infezione da HIV che non sono associate con aumentato di circolazione colesterolo o livelli di lipoproteina a bassa densità (LDL). Inoltre, le differenze nella biologia del monocito tra esseri umani e topi fanno il test immunologico domande per quanto riguarda la pertinenza delle sottopopolazioni dei monociti (ad esempio intermedi monociti (CD14 +⁺CD16⁺))⁹ difficile. Questo è importante quando si studia i meccanismi che guidano la malattia cardiovascolare come intermedio del monocito conteggi predicono indipendente eventi cardiovascolari^10,11. Mentre le analisi esistono per misurare in modo sequenziale o formazione di cellule monocito trasmigrazione o schiuma in isolamento, nessun test in vitro è stato convalidato per quantificare sia gli aspetti di atherogenesis iniziale utilizzando le stesse cellule da coorti cliniche. Transwell modelli utilizzano un sistema a doppia camera Boyden modificato per cui le cellule vengono caricati in camera superiore e trasmigrano attraverso una barriera di plastica porosa o monostrato di cellule in un alloggiamento più basso che in genere contiene supporto con chemoattractant^{12 , 13}. mentre ampiamente usato per l'analisi di trasmigrazione leucocitaria, questi modelli non prevedono in genere un layer che rappresenta l'intima, con conseguente transmigrated cellule migrano in soluzione e non consentono la misurazione della cella di schiuma formazione o inversa trasmigrazione delle stesse cellule. Al contrario, modelli di formazione delle cellule della gomma piuma non conto di eventuali cambiamenti indotti da trasmigrazione di monociti o degli effetti dell'attivazione endoteliale che è conosciuto per contribuire a schiuma cellulare formazione¹⁴. Inoltre, questi sistemi inducono schiuma formazione delle cellule dai macrofagi aderito a piastre per colture cellulari con l'aggiunta di saturare le concentrazioni di esogeno lipoproteina a bassa densità ossidata (oxLDL)^15,16, un induttore chiave di formazione delle cellule della gomma piuma. LDL utilizzato in questi modelli è spesso ossidato da processi non fisiologicamente rilevanti come CuSO₄ trattamento¹⁷, quindi, mettere in discussione l'importanza fisiologica degli studi facendo uso di questi modelli.

Qui descriviamo un'analisi che quantifica la trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma delle stesse cellule che non richiede l'aggiunta di oxLDL esogeno, così meglio modellare il ruolo dei monociti nella formazione delle cellule della gomma piuma. Questo modello è stato originariamente sviluppato dal Professor William Muller (Northwestern University, Chicago)¹⁸ed è stata ulteriormente perfezionato nel nostro laboratorio per valutare ex vivo il atherogenicity dei monociti isolati sotto non attivazione condizioni da individui con patologie infiammatorie che accompagna malattie come HIV infezione¹⁹ così come invecchiamento²⁰, che sono associati con un rischio aumentato di aterosclerosi. Questo modello offre anche una piattaforma per rispondere alle domande biologiche di base per quanto riguarda la propensione dei sottoinsiemi diversi del monocito a forma schiuma cellule²⁰, l'influenza dell'attivazione endoteliale da citochine come TNF su formazione delle cellule della gomma piuma¹⁴ e le proprietà migratori dei monociti come la profondità e velocità di trasmigrazione in gel¹⁹. Inoltre, la formazione delle cellule di trasmigrazione e schiuma di monociti può essere quantificata utilizzando la microscopia standard, cella immagini dal vivo, flusso cytometry e imaging citometria a flusso, di conseguenza, fornendo un metodo versatile per valutare il ruolo dei monociti nel atherogenesis.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Nota: tutti gli esperimenti utilizzando campioni biologici umani sono stati eseguiti con approvazione etica dal comitato di etica umana Alfred Hospital, Melbourne. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in armadi di sicurezza biologica di classe II se non diversamente specificato. " Prewarmed " si riferisce ai reagenti riscaldati a 37 ° C in bagnomaria.

1. preparazione di tipo I gel del collagene fibroso: giorno 1

1. preparare polimerizzato il gel del collagene in sequenza aggiungendo e miscelazione 35,7 mM NaOH, 0,71 x M199, acido acetico 4,58 mM e 1,71 mg/mL di collagene fibroso tipo I in un polistirolo da 5 mL tubo come da tabella 1.
   Nota: Assicurarsi che il collagene sia ben mescolato pipettando delicatamente su e giù per 5 volte al fine di evitare la formazione di collagene ' tasche ' nella miscela di gel. Preparare 4-6 gel per condizione di test per microscopia o 15 gel per condizione di test per citometria a flusso.
2. Bene una volta misto, aliquotare 50 µ l di miscela di gel di collagene in ciascun pozzetto di una piastra di coltura di tessuto 96 pozzetti a fondo piatto sterile. Non utilizzare le righe e le colonne esterne, ma riempire questi con 200 µ l di 1 x Dubecco ' tampone s fosfato (PBS) per proteggere i gel da dissecazione. Incubare le piastre a 37 °C/5% CO ₂ per 2 h consentire il collagene polimerizzare.
   Nota: Posizionare le piastre direttamente sul metallo pulito rack nell'incubatrice per garantire la distribuzione uniforme del calore.
3. a seguito di incubazione, sovrapporre i gel con 150 µ l di 1 x M199 completati (Vedi Tabella materiali) e incubare per 5 giorni fino a uso.

2. Espansione di Stored HUVEC: giorno 1

1. etichetta cappotto un diametro di 10 cm di Petri con 1 mL di 50 µ g/mL fibronectina diluiti in 1X PBS e incubare a temperatura ambiente per 10 min.
Cellule endoteliali (HUVEC, 1.0 x 10 ⁶ cellule) in 10 mL di M20 della vena
2. disgelo aliquote del cordone ombelicale umano primario crioconservati.
   Nota: HUVEC dovrebbe essere preparato come descritto in precedenza ²¹ e utilizzato in un numero di passaggio basso (< passaggio 4). HUVEC può essere sostituito con le cellule endoteliali umane dell'arteria coronaria qui.
3. Risospendere HUVEC in 10ml M20 e aggiungere al piatto rivestito fibronectina, aspirando fibronectin in eccesso prima dell'aggiunta delle cellule e la cultura di confluenza (circa 5 giorni), sostituendo i media il giorno 3.

3. Coltura di HUVEC monostrato sui gel di collagene: giorno 5

1. il giorno 5, staccare HUVEC aspirare il surnatante da di Petri cultura e lavando via contenenti siero media con 10 mL di siero M199.
2. Aggiungere 5 mL 0.05% tripsina/0.53 EDTA in M199 HUVEC e incubare per 1-2 min a temperatura ambiente, agitando delicatamente fino a quando le cellule staccano.
3. Una volta staccata, rapidamente sciacquare Petri con 5ml M20 e trasferire i file multimediali contenenti cellule in una provetta 10 mL.
4. Centrifugare i campioni a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 200 µ l di M20, contare le celle utilizzando un emocitometro.
5. Risospendere le cellule a 2,0 x 10 ⁵ cellule/mL in M20, aspirare il M199 sui gel dalla piastra a 96 pozzetti (punto 1.3) e aggiungere 100 µ l di sedimento HUVEC (2.0 x 10 ⁴ celle) per ogni gel di collagene preparato in precedenza (punto 1.2). Piastre della coltura per 3 giorni a 37 °C/5% CO ₂.
   Nota: L'integrità dello strato monomolecolare HUVEC può essere confermata dopo 3 giorni di nitrato d'argento che macchia ²² o immunohistochemistry per giunzione stretta proteine ²³ in questa fase. Ulteriori gel deve essere preparato per questo scopo.

4. Attivazione di HUVEC monostrato e isolamento/attivazione dei monociti per trasmigrazione: giorno 8

1. il giorno 8, attivare ciascun monostrato HUVEC prima dell'aggiunta dei monociti aspirando il M20 media sovrapponendo i gel e aggiungendo 100 µ l di 10 ng/mL TNFα umano in M20 per gel. Incubare a 37 °C/5% CO ₂ per 4 h.
   Nota: Condizioni Non attivato HUVEC possono anche essere incluse se necessario come controlli.
2. Durante il 4 h HUVEC attivazione passo, isolata monociti da PBMCs utilizzando magnetica del branello tecniche per selezionare negativamente per celle secondo il produttore ' s istruzioni. Un minimo di 6,5 x 10 ⁶ PBMCs dovrebbe essere usato in questa fase, al fine di ripristinare in modo affidabile 3.0 x 10 ⁵ monociti, necessari per una condizione, come monociti in genere rappresentano circa il 10-15% di PBMCs.
   Nota: Per valutare l'effetto dell'attivazione del monocito prima della formazione delle cellule del monocito della trasmigrazione e schiuma, monociti possono essere attivati in questa fase. Monociti possono essere isolati da PBMCs scongelati se necessario (cioè, campioni memorizzati). Sottoinsiemi di monociti isolati mediante FACS ordinamento possono essere preparati per l'aggiunta di gel (Figura 1).

5. Trasmigrazione dei monociti umani primari: giorno 8

1. per misurare la trasmigrazione del monocito, rimuovere i supporti contenenti TNFα e lavare gel due volte con 100 µ l M199 aggiungendo e rimuovendo i media. Dopo il lavaggio, aggiungere 2,0 x 10 ⁵ appena isolato o scongelati e lavato crioconservati PBMCs o 5.0 x 10 ⁴ appena isolato monociti o purificata sottoinsiemi del monocito di monostrati HUVEC in 100 µ l M20. Incubare per 1 h a 37 ° C e 5% di CO ₂ per consentire la trasmigrazione in avanti dei monociti nel gel. Si consiglia di lasciare 6 pozzetti per ogni condizione sperimentale esaminati.
   Nota: Per valutare l'effetto del siero autologo sulla formazione delle cellule della trasmigrazione e schiuma, incubare le cellule con M20 contenente la concentrazione di siero inattivato con calore donatore e confrontare le condizioni con un controllo di pool di siero umano. Leucociti diverso da monociti possono essere aggiunti in questa fase. Se studiando l'impatto di specifici lipidi lipidi specie (ad es., HDL, oxHDL), è possibile eseguire tutti i passaggi seguenti con supporto privo di siero contenente lipidi di 20-50 µ g/mL.
2. Dopo 1 h di trasmigrazione in avanti, raccogliere le cellule non-trasmigrato lavando gel due volte con 100 µ l di preriscaldati 1 mM EGTA in PBS 1X e una volta con 100 µ l M199 (stesso centrifugare condizioni), pool i surnatanti da ogni pozzetto dello stesso condizione sperimentale (solitamente 6 pozzi) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio. Centrifugare le cellule non-trasmigrate a 4 ° C, 300 x g per 5 min e risospendere in 30 µ l di PBS 1x 1.
3. Contare le cellule raccolte nel surnatante per determinare il numero di cellule transmigrated avanti.
4. La percentuale di cellule transmigrated avanti è determinato come segue:
   
5. coprire il lavato gel contenenti cellule transmigrated con 100 µ l M20 e incubare per un ulteriore 48 h.
6. Dopo 48 h, raccogliere il surnatante e lavare le cellule non-trasmigrato due volte con 100 µ l preriscaldata 1 mM EGTA/PBS, raccolta e messa in comune il surnatante da ogni condizione come descritto al punto 5.2.
   Nota: Il fenotipo delle cellule di transmigrated inversione può essere testato su queste cellule fcitometria a flusso standard di OPO che macchia i protocolli.
7. Centrifugare le cellule a 4 ° C, 300 x g per 5 min e risospendere le cellule in 30 µ l 1X PBS. Contare le celle e determinare la fattibilità tramite colorazione blu di trypan.
8. Determinare la percentuale di cellule transmigrated inversione utilizzando la seguente equazione:
   
   Nota: contabilità per il numero totale di cellule transmigrated avanti dà un'indicazione più precisa della trasmigrazione inversa come è improbabile trasmigrazione in avanti sarà 100%.
9. Per analisi di microscopia, i gel di fix aggiungendo 100 µ l 2% formaldeide (concentrazione finale) in ciascun pozzetto, coprire le piastre in alluminio della stagnola e conservare a 4 ° C fino all'analisi. Per citometria a flusso, non fissare le cellule in questa fase. Vedi i protocolli sotto per microscopia (sezione 6) o l'analisi di flusso cytometry (sezione 7).
   Attenzione: La formaldeide è tossica e corrosiva; utilizzare dispositivi di protezione individuale (PPE). Cura dovrebbe essere presa quando l'aggiunta di formaldeide, tuttavia, questo passaggio non deve necessariamente essere eseguita in una cappa a causa della bassa concentrazione usata.

6. Quantificazione delle cellule della gomma piuma e macrofagi di microscopia (macchia di olio-rosso O)

1. rimuovere la formaldeide e lavare i gel con 100 µ l di metanolo al 50% (v/v) per 5 min e poi 100 µ l 78% (v/v) metanolo per 15 min.
   Nota: La procedura di colorazione può essere eseguita sul banco di laboratorio e non in un armadietto di Biohazard di classe II.
2. Macchia per le goccioline del lipido aggiungendo 100 µ l di preparati 0,2% (w/v) O olio-rosso (per dettagli, vedere Tabella materiali) per 1 h a temperatura ambiente.
3. Rimuovi macchie in eccesso lavando i gel 4 volte con 100 µ l del 78% (v/v) metanolo, aspirare e scartare il supernatante dopo ogni wash.
4. Colorante di contrasto per 15 min a temperatura ambiente con 100 µ l di Giemsa, diluito 01:10 in acqua distillata.
5. Aspirare la colorazione di Giemsa e lavare gel una volta con acqua.
6. Per rimuovere il gel dalla piastra, cerchio pozzi usando un ago 21G, con lo smusso rivolto verso l'esterno, intorno al bordo del gel.
7. Per montare il gel su un vetrino da microscopio, perforare due fori (diametro 6,35 mm) in una striscia di 2,54 cm x 1,5 cm di nastro biadesivo. Difficoltà il nastro a un lato di microscopio standard e rimuovere il rivestimento protettivo dall'alto.
   1. Aggiungi una goccia d'acqua nei buchi il nastro utilizzando una pipetta di trasferimento. Delicatamente con una pinzetta, trasferire gel nei buchi il nastro e coprire con un vetrino coprioggetto di dimensioni vetro 1,5. Premere delicatamente il vetrino coprioggetti per aderire al nastro.
8. Esaminare con microscopia di campo chiaro contrasto differenziale di interferenza con obiettivo 40x su un microscopio invertito.
   1. Portare il monostrato HUVEC a fuoco alle 40 X ingrandimento e scorrimento ' in ' il gel, contando le cellule macrofagi/schiuma per tutta la profondità del gel. Ripetere per tre distinti campi di vista situato a simili distanze dal bordo del gel al fine di ridurre al minimo i possibili effetti di bordo. In tal modo gel profondità è coerente tra regioni di conteggio.
      Nota: Punteggio ottenuto cellule nel gel sia come cellule della gomma piuma (definito come cellule contenenti > 1/3 del loro citoplasma come olio-rosso O macchiato le goccioline del lipido) o i macrofagi all'interno di 2 h di montaggio su diapositive ( Figura 2). Formazione di schiuma delle cellule è espresso come la percentuale di cellule della schiuma rispetto al numero totale di cellule migrate e viene espresso come conteggi mediani in 3 campi di vista esaminato per 6 gel per condizione, pertanto una mediana di 18 misurazioni per ogni condizione. Nella tabella 2 è riportato un esempio dell'emocromo crudo da un tipico esperimento.
      Nota: Classificare una cella come un macrofago di vs cella di schiuma da microscopia è soggettivo e di conseguenza può essere investigatore-dipendente. Negli studi clinici, dove gli esperimenti vengono eseguiti per un periodo prolungato di tempo, è importante per il conteggio di tutti deve essere eseguita accecato da un singolo ricercatore. Vengono forniti esempi di cellule della gomma piuma e macrofagi in gel nella Figura 2.

7. Analisi delle cellule di Transmigrated dal flusso Cytometry

1. a fenotipico caratterizzano le cellule della gomma piuma e macrofagi dopo migrazione transendoteliale, digerire i gel aggiungendo 100 µ l di collagenasi di 37 ° C preriscaldato 1 mg/mL diluito in M199 a D ciascun pozzetto ed incubare per 20 min a 37 °C/5% CO ₂.
   Nota: Posizionare le piastre da 96 pozzetti direttamente su scaffali di metallo pulito nell'incubatrice per garantire la distribuzione uniforme del calore.
2. a seguito di incubazione, macerare il gel utilizzando una punta di pipetta 200 µ l e incubare per un ulteriore 20 min a 37 °C/5% CO ₂.
3. Una volta completamente digerito, i gel di replicare digeriti attraverso 35 µm in nylon mesh provette FACS con tappi posti su ghiaccio, filtro e piscina e lavata una volta con FACS lavare (Vedi tabella materiali) a 4 ° C, 300 x g. Risospendere le cellule in 100 µ l di FACS nello stato di Washington
4. Incubare le cellule risultanti con anticorpi coniugati fluorophore specifici per CD45, un indicatore delle cellule vive/morte e superficie/intracellulare marcatori fenotipici o funzionali di interesse utilizzando protocolli di cytometry di flusso standard.
   Nota: Preparare controllo tubi per compensazione utilizzando l'appropriato fluorofori e Ig compensazione perline. Estratti di cellule possono anche essere raccolte su vetrini per microscopia di immunofluorescenza di cytospinning. In alternativa, abbiamo raccolto con successo cellule usando questo protocollo per la valutazione tramite imaging citometria a flusso.
5. Acquisire celle utilizzando un citometro a flusso ed eseguire la compensazione come richiesto.
   Nota: Come le cellule della gomma piuma/macrofagi non possono formare singole popolazioni utilizzando le proprietà di dispersione della luce e possono differire notevolmente in dimensioni e forma, impostare liberale forward scatter (FSC) e cancelli laterali scatter (SSC) al fine di catturare tutte le cellule migrate come illustrato < forte classe = "xfig" > figura 3A.
6. a seguito di acquisizione, eseguire l'analisi di dati utilizzando il software di citometria a flusso. Per identificare cellule migrate, prima selezionare le celle come negativo per il marcatore di live/dead come mostrato nella Figura 3B. Successivamente, eseguire una cella singola discriminazione creando un cancello stretto intorno alle cellule mostrato su un terreno di vs SSC-altezza SSC-area.
7. Selezionare CD45 ⁺ cellule e cancello la popolazione maggiore di cellule migrate presente in un plot FSC/SSC come queste sono le cellule macrofagi/schiuma.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Quantificare la trasmigrazione del monocito

Monociti vengono aggiunti al modello come descritto in Figura 1, e sei gel sono preparati per ogni condizione. Monociti per 6 gel per donatore (cioè, 5,0 x 10⁴ monociti al gel gel 6 = 3.0 x 10⁵ monociti per donatore) sono risospese ad un volume finale di 600 µ l di M199 supporti contenenti il lipido richies...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Il protocollo descritto qui offre un metodo versatile e fisiologicamente rilevante per valutare il atherogenicity dei monociti da coorti cliniche umane, combinando sia trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma. Questo modello offre vantaggi rispetto ai metodi alternativi di formazione delle cellule della gomma piuma in quanto prende in considerazione l'effetto della trasmigrazione del monocito su formazione delle cellule della gomma piuma e consente la misurazione di trasmigrazione inversa<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gel preparation reagents
NaOH	Sigma-Aldrich	221465-500G	0.1 M NaOH diluted in H20
10x M199	Sigma-Aldrich	M0650
AcCOOH	Sigma-Aldrich	695092-100ML	20 mM Acetic acid diluted in H20
Cultrex Bovine Collagen I	R&D Systems	3442-050-01	Type I Fibrous Collagen
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
M199	Life Technologies	11150-059	M199 media containing Earle's salts, L-glutamine and 2.2 g/L Sodium Bicarbonate. Media supplemented with 100 µg/mL L-glutamine  and 100 U/mL penicillin/streptomycin
M20			Supplemented M199 containing 20% heat-inactivated pooled or donor serum. Individual lipid species such as LDL can be added to M199.
HUVEC			Primary human umbilical cord endothelial cells (HUVEC) can be isolated from umbilical cords donated with informed consent and ethics approval. Isolated HUVEC may also be purchased commercially.
Human coronary artery endothelial cells			Primary human coronary artery endothelial cells can be isolated from arteries donated with informed consent and ethics approval. Isolated cells may also be purchased commercially.
EDTA	BDH Merck	10093.5V	Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) - 0.5 M, pH 8.0
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889-500G	Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) - 1 mM, pH 8.0
0.05% trypsin EDTA	Gibco	25300-054	0.05% trypsin/0.53 EDTA (1X)
L-glutamine	Gibco	25030-081	L-glutamine (200 mM)
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122	Penicillin/streptomycin (10,000 units/mL Penicillin and 10,000 µg/mL Streptomycin)
New born calf serum	Gibco	16010-142	New born calf serum: New Zealand origin
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1056-1MG	Fibronectin - 50 µg/mL aliquots prepared and stored
PBS (1x)	Gibco	14200-075	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (10x): Dilute to 1x with sterile H20
0.1% TNF	Gibco	PHC3015	Recombinant human TNF - Reconstituted in H20 and stored in 10 µg/mL aliquots
Low-density lipoprotein	Merck Millipore	LP2-2MG	Low-density lipoprotein (LDL)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopy
1 or 2% formaldehyde	Polysciences	4018	1 or 2% formaldehyde diluted with sterile H20
50% and 78% methanol	Ajax Finechem	318-2.5L GL	50% or 78% v/v methanol, diluted with H20
Oil Red O stain	Sigma-Aldrich	O0625-25G	Dilute to 2 mg/mL in 22% 1M NaOH and 78% (v/v) methanol
Microscope slides	Mikro-Glass	S41104AMK	Twin frosted 45 degree ground edge microscope slides (25 X 76 mm)
Cover slips	Menzel-Gläser	MENCS224015GP	22 x 40 mm #1.5 size glass cover slips
Double-sided tape	3M Scotch	4011	Super strength exterior mounting tape (25.4 mm x 1.51 m)
Giemsa stain	Merck Millipore	1.09204.0500	Giemsa's azur eosin methylene blue solution (dilute stock 1:10 in H20)
Hole punch			Hand-held single hole punch (6.35 mm punch)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Flow cytometry
Collagenase D	Roche Diagnostics	11088858001	Collagenase D diluted in M199 media to 1 mg/mL
35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes	BD Biosciences	352235	35 µm nylon mesh capped polystyrene FACS tubes
Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain	Life Technologies	L34959	Live/Dead Fixable Yellow Dead Cell stain
FACS wash			Prepare by mixing 1 X PBS-, 2 mM EDTA and 1% New born calf serum
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
96 well plate	Nunclon	167008	Delta surface flat-bottomed 96 well plate
10 cm Petri Dish	TPP	93100	Sterile 10 cm Petri dish
1.5 mL Eppendorf tubes	Eppendorf	0030 125.150	Eppendorf tubes
Transfer pipette	Samco Scientific	222-20S	Sterile transfer pipette (1 mL, large bulb)