Un approccio semplice per indurre la neurite Autoimmune Sperimentale in topi C57BL/6 per le valutazioni funzionali e Neuropathological

Riepilogo

Questo rapporto descrive un approccio semplice per indurre con successo la neurite autoimmune sperimentale (EAN) utilizzando la proteina della mielina zero (P0)_180-199 del peptide in combinazione con adiuvante completo di Freund e tossina della pertosse. Vi presentiamo un paradigma sofisticato in grado di valutare con precisione l'entità dei deficit funzionali e neuropatologia che si verificano in questo EAN.

Abstract

Neurite autoimmune sperimentale (EAN) è un modello sperimentale ben apprezzato delle malattie demielinizzanti periferiche autoimmuni. Malattia EAN è indotto immunizzando topi con peptidi neurogeni di dirigere un attacco infiammatorio verso componenti del sistema nervoso periferico (PNS). Gli avanzamenti recenti hanno permesso l'induzione di EAN nella linea di mouse C57BL/6 relativamente resistente usando la proteina del myelin zero (P0)_106-125 o peptidi_180-199 P0 consegnati in adiuvante combinato con l'iniezione di tossina della pertosse. La capacità di indurre EAN nel ceppo C57BL/6 consente l'utilizzo di numerosi strumenti genetici che esiste su questo sfondo del mouse e permette così sofisticato studio della patogenesi della malattia e interrogatorio dell'azione meccanicistico di approcci terapeutici in combinazione con approcci transgenici. In questo studio, dimostriamo un approccio semplice per indurre correttamente EAN utilizzando il peptide di_180-199 P0 in topi C57BL/6. Abbiamo anche delineare un protocollo per la valutazione dei deficit funzionali che si verificano in questo modello, accompagnato da una serie di caratteristiche neuropathological. Così, questo modello è un potente modello sperimentale per studiare la patogenesi delle neuropatie demielinizzanti periferiche umane e per determinare l'efficacia di potenziali terapie che mirano a promuovere la riparazione della mielina e proteggono da danno del nervo in autoimmune neurite.

Introduzione

Neuropatie periferiche possono essere di origine genetica o acquisita, con neuropatie acquisite avendo entrambi metabolica, ischemica, infiammatorie, o tossici precipitanti. Queste malattie sono anche utilmente classificate come assonale o demyelinative in origine. Il più comune acquisita demielinizzante neuropatie periferiche sono la polineuropatia Demyelinating infiammatoria acuta (AIDP, noto anche come sindrome di Guillain-Barré, GBS) e cronica infiammatoria demielinizzante polineuropatia (CIDP)^{1, 2 , 3 , 4}; entrambi sono patogeneticamente caratterizzati da una reazione autoimmune diretta contro la guaina di mielina, che causa demielinizzazione dei nervi periferici. In queste malattie, le cellule di T attivate attraversano la barriera del nervo e generano una reazione immune all'interno il PNS. Attivazione dei macrofagi all'interno del nervo quindi causa demielinizzazione o direttamente tramite attacco fagocitica, oppure indirettamente tramite secrete mediatori infiammatori, con conseguente disabilità clinica come paralisi e disfunzione sensitiva⁵. Mentre gli assoni demyelinated mantengono la capacità di essere remyelinated seguito demielinizzazione, remyelination è spesso ritardato o incompleta, con conseguente suscettibilità degli assoni nudi a danni irreversibili, che è la causa principale della clinica permanente disabilità. Attualmente, i trattamenti più efficaci sono immunomodulatori, ma nonostante la loro efficacia, in molti casi il recupero è spesso lento e ~ 25% pazienti avvertiranno i deficit funzionali residui che riducono significativamente la loro qualità di vita^{6, 7}.

EAN è un modello animale ampiamente usato di demielinizzanti neuropatia periferica che ha fornito le comprensioni importanti nella patogenesi e un mezzo per valutare nuovi agenti terapeutici⁴. Questo modello può essere indotta in specie diverse come i conigli, ratti, topi e porcellini d'India e viene indotta tramite immunizzazione con antigeni neurogeni. Tuttavia, l'induzione di EAN successo dipende in ultima analisi su una risposta immunitaria adeguata per la malattia si verifichi. In considerazione delle variazioni di specie (e inter-specie/ceppo) nella funzione immune, molteplici combinazioni di antigeni e adiuvanti sono stati sviluppati per indurre correttamente EAN. In termini di strumenti genetici murini, C57BL/6 è il più ampiamente usato; Tuttavia, il peptide di proteina P2 tradizionale 57-81 (P2_57-81) che provoca la malattia nel ceppo suscettibili SJL mouse⁸ è in grado di patogenesi illeciti portando a deficit funzionali nel ceppo C57BL/6. Fortunatamente, paradigmi di sensibilizzazione utilizzando il P0_106-125 o P0_180-199 peptidi, consegnato in adiuvante combinato con l'iniezione di pertosse tossina può superare questa barriera, abilitazione sofisticati strumenti genetici per essere utilizzato nella modello murino di EAN.

Qui, un metodo semplice per l'induzione di EAN nei topi C57BL/6 è presentato. Inoltre, viene fornito un approccio globale e dettagliato da cui valutare i deficit funzionali e neuropathological associati alla malattia. Il peptide di P0_180–199 ⁹ è stato scelto preferenza l' alternativa¹⁰_57-81 di P0. Il modello di_{199 180–}P0 è stato descritto per produrre meno gravi segni clinici rispetto con l' alternativa¹⁰_57-81 di P0 e rischia pertanto di sostenere l'introduzione di potenzialmente perturbazioni genetiche deleterie, recuperare dalle procedure chirurgiche (ad esempio l'impianto pompa osmotica) ed è favorevole alla prova⁴funzione di andatura di tapis roulant. Tuttavia, i tapis roulant andatura funzione test e istologici protocolli descritti qui facilmente potrebbero essere applicati quando si studia la malattia in una variante di_57-81 indotto P0.

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Protocollo

tutte le procedure qui descritte sono state approvate dall'Istituto Florey di Neuroscienze e salute mentale (Melbourne cervello Centre) Comitato di etica degli animali e seguire la Australian codice di pratica per l'uso degli animali per scientifico Scopi.

1. induzione di EAN

Nota: EAN può essere indotta con successo nei topi C57BL/6 maschi di età compresa tra 6-8 settimane. Il protocollo di induzione dura 9 giorni in totale. Giorno 0 si riferisce al giorno della prima immunizzazione. Per questo protocollo, le iniezioni sono state condotte nell'ambito dell'anestesia (Vedi punto 1.1.2 qui sotto).

1. On Day -1:
   1. preparare la tossina della pertosse (Vedi Tabella materiali) soluzione di 1,6 µ g/mL utilizzando il fosfato del mouse-isotonica sterile di 0.1 M tampone (MT-PBS).
   2. Amputate con isoflurano:
      1. posizionare il mouse (C57BL/6, uomo, 6-8 settimane) in aula amputate e regolare il flusso di ossigeno a 1 L/min.
      2. Accendere il vaporizzatore isoflurano, regolarlo al 2,5% per amputate e monitor di respirazione e attesa per 2 min, o fino a quando i riflessi primari (arto cornea e posteriore) sono non più reattivo
   3. Rimuovere il mouse dalla camera amputate e amministrare 250 µ l della soluzione di tossina della pertosse sopra tramite un'iniezione intraperitoneale (i.p.) utilizzando una siringa da 0,5 mL con ago 30 ^1/2 G.
   4. Preparare l'inoculo iniettabile per immunizzazione:
      1. preparare soluzione A utilizzando 2 mg/mL soluzione del peptide _180-199 P0 (con > 98% di purezza, sequenza S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in soluzione fisiologica allo 0,9%.
      2. Preparare Soluzione B utilizzando 20 mg/mL soluzione della tubercolosi del micobatterio (Vedi Tabella materiali) in Freund ' adiuvante completo s (FCA, composto da: 15% mannide monoolate + 85% di olio di paraffina e 0,5 mg/mL di essiccata uccisi e secchi M Mycobacterium butyricum).
      3. Per rendere l'inoculo finale per via parenterale, combinare parti di uguale volume di soluzioni A e B in un battitore di perlina e mescolarli alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente.
         Nota: Le soluzioni A e B possono essere mantenute come magazzino e conservate a 4 ° C per un massimo di un mese ma l'inoculo finale combinato dovrà essere preparata il giorno dell'iniezione del mouse.
2. Il giorno 0, amministrare 50 µ l di inoculo (preparazione descritta in passaggio 1.1.4) in un mouse tramite un'iniezione sottocutanea con un ago di 23 G.
   Nota: L'iniezione può essere collocata tra le scapole, o tra le arti posteriori e la coda sopra il dorsum caudale.
3. Il giorno 1, rendono la soluzione di tossina della pertosse di 1,2 µ g/mL (in MT-PBS) e amministrare 250 µ l in un mouse via i.p. iniezione utilizzando una siringa da 0,5 mL con ago 30 ^1/2 G.
4. Il giorno 3, ripetere passo 1.3 qui sopra.
   Nota: Soluzioni Stock A e B possono essere composti e conservate a 4 ° c per un massimo di un mese. Tuttavia, l'inoculo finale iniettabile, prodotto dalla combinazione di soluzioni di riserva A e B, deve essere fatto il giorno dell'iniezione.
5. Il giorno 8, amministrare 50 µ l di inoculo (preparazione descritta in passaggio 1.1.4) in un mouse tramite un'iniezione sottocutanea (Vedi punto 1.2. su indicato), al sito di iniezione stesso come descritto al punto 1.2 (per ogni animale)

2. Scoring clinico

1. eseguire segnando clinica quotidiana a partire il giorno 0.
2. Dare ogni mouse un punteggio pari a 0, 1, 2, 3 o 4 secondo i criteri pubblicati ⁴. Vedere la tabella 1 per il punteggio clinico EAN.
   Nota: Per coerenza, uno sforzo dovrebbe essere fatto per segnare i topi allo stesso tempo ogni giorno dal ricercatore stesso.

3. Valutazione di funzione a motore

Nota: le prestazioni del motore sono valutata in parallelo con il punteggio clinico per la stessa coorte degli animali. L'apparato di valutazione della funzione motoria deve essere collegato a un computer che dispone di un sistema di imaging funzione andatura (Vedi Tabella materiali) installato. Si raccomanda inoltre che tutti i topi da valutarsi dovrebbero essere abituati all'attività in esecuzione prima di induzione di EAN. Per effettuare questa operazione, esecuzioni di pratica (2 esecuzioni di test per topo) vengono eseguite tre giorni prima di induzione di malattia (giorno -3).

1. Accendere la funzione motoria valutazione apparato ed il commutatore sul pulsante luce.
2. Scruff il mouse saldamente e suoi piedi di inchiostro abbassando esso su un contenitore riempito con inchiostro rosso mentre si tiene la sua coda.
   Nota: Questo passaggio è obbligatorio per il ceppo C57BL/6, ma può essere ignorato se viene utilizzato un ceppo del mouse con un colore del mantello bianco.
3. Posizionare il mouse nel vano piedi e impostare la velocità di tapis roulant a 15 cm/s.
4. Accendere il tapis roulant e cliccare il " record " pulsante per catturare il movimento in esecuzione del mouse utilizzando la funzione di andatura sistema di imaging (Vedi Tabella materiali).
5. Utilizzare un timer e misurare ogni corsa per 36 s. Dopo 36 s, interrompere la registrazione e stop il tapis roulant.
   Nota: I topi che non è in grado di completare con successo l'attività in esecuzione per questo intervallo s 36 sono considerati di avere fallito.
6. Salvare il file video nella cartella designata.
7. Ripetere i passaggi precedenti per ogni mouse per essere valutato. Testare i topi con la stessa attività in esecuzione ogni 3 giorni.
8. Analizzare i file video modificati utilizzando il software per i parametri di funzione di andatura (Vedi Tabella materiali).
   Nota: I dettagli di come analizzare diversi parametri del motore variano tra software così consultare il produttore ' istruzione di s prima dell'analisi. Per ottenere l'evidenza istologica di axonal e danni di mielina tramite immunoistochimica o microscopia elettronica, tessuti possono essere assunto in qualsiasi fase post funzione motoria valutazione a seconda degli obiettivi specifici della ricerca animale.

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Risultati

Peptide_180-199 P0 indotto EAN nei cavi di topi C57BL/6 per una malattia monofase con punteggio clinico inizio dal post di 6 giorni prima immunizzazione (dpi) e massimo punteggio gravità è osservata da 25 dpi seguita da alcuni punteggio clinico miglioramento da 40 dpi durata (Figura 1)^4,9. In termini di funzione di andatura, topi cominciano a fallire in una semplice attività in esecuzione...

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Discussione

Questo rapporto descrive un metodo semplice per indurre EAN utilizzando il peptide di_180-199 P0 in topi C57BL/6, consentendo la quantificazione dei principali deficit neuropathological e funzionale in topi indotti con EAN. Distinto per il protocollo di induzione di EAN descritto qui è l'uso dell'anestesia durante l'esecuzione le iniezioni di immunizzazione. L'uso dell'anestesia isoflurano migliora notevolmente la capacità di garantire che il volume totale dell'inoculo viene iniettato per via sottocutanea nel...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)			Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Normal donkey serum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700	Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies	Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA	Various	Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution	Dako (Agilent), CA, USA	#S3023	Each laboratory will have their own preference.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles	BD	#326105
23 g needles	BD	#305143
Red ink pad			Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch			Any timer may be used.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope	Zeiss		Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments			Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber			Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene	GeneTex (USA)		Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope	Zeis LSM780		Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J	National Institues of Health		Available from www.fiji.sc