Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

Riepilogo

Questo protocollo descrive un'analisi di invasione verticale invertito che potrebbe essere utilizzata per quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule in un ambiente tridimensionale, preservando il microambiente cellulare. Questo test è adatto per le cellule rare e/o sensibili.

Abstract

Sebbene siano state sviluppate le analisi 3D invasione, la sfida rimane per studiare le cellule senza intaccare l'integrità del loro microambiente. 3D tradizionali dosaggi come la camera di Boyden richiedono che le cellule vengono spostate dalla posizione originale cultura e spostate in un nuovo ambiente. Non solo fa questo interferire con i processi cellulari che sono intrinsechi al microambiente, ma spesso risulta in una perdita di cellule. Questi problemi sono particolarmente impegnativi, quando si tratta di cellule che sono rari, o estremamente sensibili alla loro microambiente. Qui, descriviamo lo sviluppo di un saggio di invasione 3D che evita entrambi preoccupazioni. In questo saggio, cellule sono placcate bene all'interno di una piccola e una matrice di ECM contenente un chemoattractant è disposto in cima le cellule. Ciò non richiede alcun spostamento di cella e permette alle cellule di invadere verso l'alto nella matrice. In questa analisi, l'invasione delle cellule, come pure la morfologia delle cellule può essere valutata all'interno del gel di collagene. Usando questa analisi, ci caratterizzano la capacità invasiva delle cellule rare e sensibile; le cellule di ibrido risultante dalla fusione tra cellule di cancro al seno MCF7 e mesenchimali/multipotenti staminali/stroma cellule (MSCs).

Introduzione

Motilità cellulare è un processo fisiologico e dello sviluppo normale delle cellule. Tuttavia, i cambiamenti nel modello e la capacità delle cellule di migrare e invadere sono associati con patologie tra cui malattie infiammatorie e cancro metastasi^1,2,3. Metastasi è senza dubbio l'aspetto più mal capito nel cancro. Per riprodurrsi per metastasi, le cellule tumorali devono degradare la matrice extracellulare (ECM), invadere il tessuto locale e intravasate. Una volta in circolazione, le cellule tumorali si diffonderanno al sito distante, MPEG e formare tumori secondari. Di conseguenza, la capacità delle cellule di degradare la ECM, migrare e invadere è relativo al loro potenziale metastatico. Diversi approcci sono stati sviluppati per analizzare e quantificare le funzionalità di migrazione e invasione delle cellule. Gli approcci più utilizzati comprendono la cicatrizzazione di dosaggio, time-lapse microscopia e analisi dell'alloggiamento di Boyden. La ferita guarigione dosaggio⁴ e tempo lapse microscopia sono analisi semplice e conveniente che vi darà luce preliminare nella migrazione cellulare. Tuttavia, entrambi sono le analisi 2D che non riflettono l'ambiente 3D in cui le cellule si trovano in vivo. Gli studi hanno indicato che le cellule rispondono in modo diverso in un ambiente 3D rispetto ad un 2D si^5,6. Inoltre, saggi di guarigione della ferita sono difficili da riprodurre e a produrre risultati quantitativi^7,8,9. Analisi della zona di esclusione di cella, che è una modifica 3D della ferita guarigione saggio, è un test più fisiologicamente rilevanti, ma non è adatto per le celle in basse in numero, ad esempio cellule ibride derivanti dalla cella fusione eventi^10,11 .

L'analisi della camera di Boyden è un dosaggio di 3-dimensionale che fornisce microambienti rilevanti per gli studi cellulari. Tuttavia, esso richiede le cellule per essere rimosso dal loro microambiente originale e ad essere depositati nella camera superiore del sistema di dosaggio Boyden di migrare e invadere verso il basso verso il chemoattractant contenente il mezzo. Questo approccio 3D non è appropriato nell'analizzare la capacità di migrazione e l'invasione delle cellule vulnerabili a loro microambiente e/o limitata nel numero^10,11,12. Un approccio più recente per analizzare l'invasione e la migrazione cellulare è la microfluidica gradiente camera dosaggio¹³. Anche se adatto e affidabile negli studi di migrazione e invasione, questo dosaggio è più costoso e potrebbe essere tecnicamente difficile per un tipico laboratorio. Descriviamo qui un saggio di semplice invasione verticale invertito che è compatibile con molti tipi di cellule tra cui cellule sensibili alla loro microambiente e/o ristretta nel numero. Questo test è stato adattato dal protocollo proposto da Hooper et al. ¹⁴. in questa analisi, le cellule rimangono nella loro microambiente originale e loro migrazione e invasione è monitorato mentre si muovono verso l'alto nel gel collagene contenente un chemoattractant¹¹. Questo test è riproducibile ed è stato ottimizzato e convalidato nella piastra di coltura di 35 mm. Esso potrebbe essere adattato a diverse metodiche tra cui formati di cella diversa cultura, diverse matrici o forza di adesione e chemiotattici differenti. Questo test potrebbe fungere da piattaforma in vitro per lo screening iniziale nel processo di scoperta di farmaci.

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Protocollo

Nota: Il presente protocollo è descritto in McArdle et al. ¹¹. un diario è fornito nella Figura 1.

1. preparazione della piastra di coltura

1. Lavare il piatto 35mm cultura che contiene un fondo di vetro 10 mm con 1 mL di 1 M di acido cloridrico (HCl) per 15 min abbassare l'idrofobicità del fondo di vetro.
2. Lavare la piastra di coltura due volte con 1 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) per sbarazzarsi di tutti l'HCl.
3. Lavare la piastra di coltura due volte con 1 mL di etanolo al 70%.
4. Sciacquare la piastra di coltura con 1 mL di terreno di coltura specifico delle cellule (qui, uso α-MEM completati con 10% calore inattivato FBS e 1% non essenziali aminoacidi).
   Nota: La piastra di coltura trattata contenente il terreno di coltura possa essere memorizzata nell'incubatore CO₂ con un umidificatore a 37 ° C fino al giorno successivo.
5. Crescere le cellule (MSCs e MCF-7 co-cultura) nel fondo di vetro trattato bene di piastra di coltura 35mm al confluency di 100%. Co-coltura 35.000 cellule MSC e 75.000 delle cellule MCF7 per 24 h.

2. preparazione del gel collagene

1. Conservare le punte di una micropipetta utilizzate per pipettaggio il gel di collagene nel congelatore per prevenire la polimerizzazione del collagene al contatto.
   Nota: Questo è il punto più critico.
2. Determinare un volume collagene coda di ratto io per essere utilizzato sulla base della concentrazione dello stock del collagene. Preparare 100 µ l di gel di collagene per questo test.
   Nota: Alta concentrazione di collagene di coda di ratto che Stock funziona meglio. Determinare il volume di 10 x supporto per volta Eagle di Dulbecco da utilizzare per diluire il collagene conseguenza.
3. Combinare il collagene della coda del ratto ghiaccio I (3,8 µ g/mL di brodo), la media per volta Eagle di 10 x Dulbecco e 1 mezzo di coltura cellulare x completati con 2% di siero bovino fetale e il chemoattractant appropriato a una concentrazione finale di collagene di 2,4 mg/mL.
4. Aggiungere il miscela 4,5% di soluzione di bicarbonato di sodio per neutralizzare il gel di collagene.
   Nota: Il volume di soluzione di bicarbonato di sodio aggiunto varia in base al pH esatto di altri reagenti. Si consiglia di testare la miscela con strisce di pH per assicurare la soluzione neutra, o utilizzare un indicatore di pH nel terreno di coltura.
5. Laici 80 µ l di miscela di collagene sopra le cellule all'interno il fondo di vetro ben della piastra di coltura.
6. Lasciare che il gel di collagene polimerizzare per 30 min in un incubatore a CO₂ con un umidificatore a 37 ° C.
7. Coprire il gel di collagene con 2 mL di medium di cellulare con riduttori del siero (2%) e incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore a CO₂ con un umidificatore per 24, 48 o 72 ore.
   Attenzione: La piastra deve essere maneggiata con cura per evitare che il gel di collagene da distaccarsi dal fondo di vetro.

3. esempio di preparazione di collagene gel utilizzando uno stock di collagene coda di ratto di 3,8 µ g/ml

1. Su ghiaccio, combinare 114,5 µ l collagene coda di ratto, 16,6 µ l di 10 x DMEM e 33.1 µ l di terreno di coltura contenente il chemoattractant.
2. Neutralizzare la miscela di collagene con 14.0 µ l di bicarbonato di sodio.
3. Continuare come al punto 2.5.

4. imaging delle cellule

1. Rimuovere delicatamente il supporto del piatto.
2. Sciacquare delicatamente il gel con 1 mL di PBS.
3. Fissare le cellule con 1 mL di paraformaldeide al 4% per 15 min.
4. Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS.
5. Macchia le celle con soluzione DAPI (100 ng/mL) per 20 minuti a temperatura ambiente.
6. Immagine delle celle utilizzando un microscopio confocale in luoghi diversi e prendere 400 µm dello stack z immagini di ogni posizione di 16 µm. Il microscopio utilizzato ha un unità che permette l'imaging confocale utilizzando una luce bianca, la sorgente di eccitazione di arco di scansione del disco. Utilizzare una lente X 20 utilizzata con apertura numerica di 0,75.
7. Ricostituire le immagini.
   1. Aprire le immagini per un determinato gel (circa 25 immagini) e creare una serie di immagini facendo clic su immagine → pile → immagini di stack. La prima immagine corrispondeva alla parte inferiore del gel (z = 0 µm), la seconda immagine corrispondeva al primo passo nella direzione z (z = 16 µm), la terza immagine corrispondeva al secondo passaggio nella direzione z (z = 32 µm). Valutare ogni nucleo ad ogni profondità di immagine e designare la profondità alla quale il nucleo era a fuoco più nitida come la profondità di invasione per quella determinata cella.

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Risultati

Abbiamo usato una piastra di coltura di 35mm con un vetro inferiore e ratto coda collagene I a sviluppare e ottimizzare un'invasione in vitro 3D analisi di protocollo. Usando questa analisi, abbiamo ha mostrato quel seno cancro cellule MCF7 e MSC cellule potrebbero invadere in gel di collagene per una distanza media di 0,04 ± 1,8 µm e 41,3 ± 76,0 µm rispettivamente dopo 48 h quando IGF1 (18,6 ng/mL) è stato usato come chemoattractant (Figura 2)....

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Discussione

Qui, descriviamo un'analisi semplice di invasione verticale invertito che è conveniente per una varietà di tipi di cellule, compreso le cellule che sono rare e/o dipendente da loro microambiente. In questa analisi 3D di invasione, le cellule rimangono nel loro microambiente originale e sono coperti dal gel di collagene che contiene un fattore chemiotattico. Le cellule quindi migrano e invadono nel collagene. In questa analisi, le cellule possono essere macchiate e facilmente monitorate all'interno il gel. La semplicit?...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MatTek P35G-1.5-10C	MatTek Corporation, Ashland, MA	P35G-1.5-10-C	mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I	Corning, Corning, NY, USA	354236	Collagen gel
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	H1758	HCl
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	10010023	PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	D2429	10X DMEM
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	S5761	NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope	Olympus America, Center Valley, PA, USA	Olympus IX81	Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA	SH30070.03	FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope	Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA	40x NA 0.8 objective	MPLSM
Imaris software	Bitplane Inc. Zurich, CH	Imaris 7.5.2	Imaris software
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	D9542	DAPI
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	50980487	PFA
α-minimum essential medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	M0894
MDA-MB-231	ATCC; Manassas, VA, USA	HBT-22
MSC	Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO	Olympus America, Center Valley, PA, USA	36-064	Olympus UPLSAPO 20X Objective