Analisi di Imaging di complementazione di luciferase in foglie di Nicotiana benthamiana per transitoriamente determinare dinamiche di interazione proteina-proteina

Riepilogo

Questo manoscritto descrive una facile e rapida procedura sperimentale per la determinazione di interazioni proteina-proteina basate sulla misurazione dell'attività luciferasica.

Abstract

Interazioni proteina-proteina sono meccanismi fondamentali per l'inoltro della trasduzione del segnale nei processi più cellulari; Pertanto, identificazione delle coppie di interazione proteina-proteina novella e dinamiche di interazione della proteina di monitoraggio sono di particolare interesse per rivelare come le piante rispondono ai fattori ambientali e/o segnali inerente allo sviluppo. Una pletora di approcci sono stati sviluppati per esaminare le interazioni proteina-proteina, sia in vitro che in vivo. Tra questi, la complementazione di luciferase recentemente stabilito imaging (LCI) analisi è il metodo più semplice e veloce per la dimostrazione in vivo interazioni proteina-proteina. In questo test, proteina A o proteina B si fonde con la metà amino-terminale o carbossi-terminale della luciferasi, rispettivamente. Quando la proteina A interagisce con la proteina B, le due metà della luciferasi verrà ricostituita per formare un enzima luciferasi funzionale e attivo. L'attività luciferasica può essere registrato con un luminometro o la telecamera CCD. Rispetto ad altri approcci, il dosaggio LCI Mostra interazioni proteina-proteina sia qualitativamente che quantitativamente. L'infiltrazione di Agrobacterium in foglie di Nicotiana benthamiana è un sistema ampiamente utilizzato per l'espressione della proteina transitoria. Con la combinazione di LCI ed espressione transiente, questi approcci mostrano che l'interazione fisica tra COP1 e SPA1 è stata gradualmente ridotta dopo il trattamento jasmonato.

Introduzione

Al fine di coordinare la crescita con il suo ambiente, le piante hanno sviluppato eleganti vie di segnalazione per percepire, trasduce e rispondere ai segnali di segnalazione. Come i corridori in una gara a staffetta, le proteine sono necessari giocatori nella trasduzione del segnale di pianta. È stato ampiamente riconosciuto che l'interazione proteina-proteina (PPI) svolge un ruolo importante per la comunicazione cellulare. Degradazione, acetilazione e fosforilazione della proteina dipendono tutti dalla interazione fisica tra una proteina dell'obiettivo e suoi enzimi di modificazione. Ad esempio, proteine della famiglia di Jasmonate ZIM-dominio della proteina (JAZ) interagiscono con il fattore di trascrizione MYC2 e sopprimono la sua attività trascrizionale^1,2. Data l'importanza di PPI, su grande scala della proteina Interattomi nelle piante sono state recentemente esplorato^3,4,5. Questi risultati Interactoma ulteriormente rivelano la complessa rete di regolamentazione che coordina diverse funzioni cellulari.

Ci sono alcuni approcci stabiliti per il monitoraggio di PPI. Il dosaggio di lievito due ibridi (Y2H) è il metodo più utilizzato per il rilevamento di PPI. Y2H è facile da eseguire e adatto per un rapido test esaminare le interazioni della proteina. Y2H è anche ampiamente usato per lo screening di partners di interazione sconosciuto per la proteina di interesse specifico. Tuttavia, poiché Y2H è interamente realizzato in lievito, non può riflettere lo scenario reale in pianta cellule e porta alto tasso di falsi positivi. Un'altra strategia simile è il test di discesa. In generale, due proteine sono espresse e purificati da cellule di Escherichia coli e quindi misto e immobilizzati per rilevare le interazioni della proteina. Anche se questo metodo non è che richiede tempo, non è possibile ottenere in vivo risultati di interazione sia. Per scopi di interazione in vivo , co-immunoprecipitazione (co-IP) è il test più popolare, che richiede dell'anticorpo di alta qualità a immunoprecipitate la proteina di interesse e non può escludere la possibilità di PPIs indiretta. Inoltre, a causa di complicate procedure sperimentali in co-IP, i risultati variano solitamente con competenze individuali.

Saggi di ricostituzione reporter basato avanzano notevolmente il rilevamento di in vivo PPI. Questi metodi includono fluorescenza resonance energy transfer (FRET)⁶, fluorescenza bimolecolare complementazione (BiFC)⁷e la complementazione di firefly luciferase imaging (LCI) dosaggio⁸. Anche se questi tre approcci sono meglio di co-IP per riflettere il diretto in vivo PPI, FRET e BiFC bisogno specifici microscopi per rilevare segnali di fluorescenza e facilmente non può quantificare l'intensità di interazione. Al contrario, LCI si avvale della luciferasi firefly, che si illuminerà dopo reagendo con sua luciferina di substrato. Ancora più importante, intensità PPI può essere determinato dal valore dell'attività luciferasica. Così, LCI non solo indica se due proteine interagiscono o non, ma fornisce anche informazioni sulle dinamiche di interazione sul trattamento. Anche se ci sono alcuni metodi stabiliti per il monitoraggio di interazione dinamica (basata su turni di stabilità termica o risonanza plasmonica di superficie)^9,10, questi approcci richiedono strumenti delicati o etichettatura specifica. Al contrario, LCI è più facile da eseguire e rilevare.

Il principio per LCI è che le metà amino-terminale e carbossi-terminale della luciferasi (denominato N-Luc o C-Luc, rispettivamente) sono stati fusi con proteina A e B e questi due fusione proteine contemporaneamente sono state espresse nelle cellule vegetali. Se la proteina A interagisce con la proteina B, quindi le due metà della luciferasi verrà ricostituita per essere un enzima luciferasi attivo. L'attività luciferasica può essere rilevato con un luminometro o la telecamera CCD. Non è necessario ottenere trasformanti stabili per LCI; l'espressione transitoria è sufficiente per ottenere un risultato di alta qualità di interazione.

ANELLO-tipo E3 ubiquitina ligasi costitutiva fotomorfogeniche 1 (COP1) interagisce con una miriade di fattori di trascrizione e promuove la loro degradazione attraverso il proteasoma 26S¹¹. Alcuni di questi fattori di trascrizione COP1-mirati sono regolatori positivi per fotomorfogenesi. Nel buio, COP1 interagisce con soppressore di Fitocromo A-105 1 (SPA1), che esalta la COP1 E3 attività⁸. Dopo la percezione della luce, fotorecettori si abolisce l'interazione COP1-SPA1 per inibire l'attività COP1 e quindi stabilizzare COP1 substrati^12,13,14. Questo esempio illustra il significato biologico di studiare PPI e determinare dinamiche PPI.

Protocollo

1. preparazione delle piante (8 settimane)

1. Mettere 50 semi di Nicotiana benthamiana in una microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di 5% NaClO e soluzione 0,1% Triton X-100 (V/V) e lasciare agire per 5 min sterilizzare i semi.
2. Sciacquare i semi con acqua sterile 5 volte e sospendere semi in 200 µ l di acqua sterile.
3. Accuratamente posto semi individuali sulla superficie del terreno di MS-agar (1 l.: 1 x sali di Murashige e Skoog, 10 g di saccarosio, pH 5,8 (KOH), 1% agar) con estremità sottili e piastre di terreno di negozio a 4 ° C per 3 giorni sincronizzare la germinazione.
   Nota: Per evitare la contaminazione di microbo, eseguire questo passaggio su un banco pulito. Non è necessario agitare il tubo durante la sterilizzazione.
4. Posizionare le piastre di terreno in condizioni di crescita normali (22 ° C, intensità luminosa di 80-90 µmolm^-2s^-1 bianco) per 10 giorni e quindi trasferire le piantine germinate nel terreno.
   Nota: Assicurarsi di inserire le radici della piantina nel terreno e non danneggiare le radici. Coprire il vassoio con un coperchio in plastica trasparente durante la notte per mantenere l'umidità.
5. Crescere le piante in una stanza di crescita controllata su un 16 h/8 h chiaro/scuro ciclo e 70% di umidità. 7-settimana-vecchio N. benthamiana piante sono pronte per l'infiltrazione Agrobacteriumtumefaciens (Figura 1A).
   Nota: Innaffiare le piante e controllare i parassiti come necessario per mantenere le piante sane.

2. transitoria espressione nelle foglie N. Benthamiana (7-10 giorni)

1. Consegnare 150 ng di plasmidi (plasmide pEGAD-HA-LUC controllo, vettore vuoto e plasmide costruito per LCI dosaggio, in questo caso abbiamo usato pCAMBIA1300-Nluc e pCAMBIA1300-Cluc per costruzione del plasmide) in cellule competenti di a. tumefaciens ceppo GV3101 con un Metodo standard elettroporazione.
2. Cultura a. tumefaciens Luria-Bertani (LB) agar medium (1 l: 10 g NaCl, Estratto di lievito 5 g, 10 g triptone, 1,5% agar) contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 50 µ g/mL di rifampicina a 28 ° C per 4 giorni.
   Nota: La scelta degli antibiotici dipende il vettore e il ceppo di a. tumefaciens usato.
3. Inoculare una singola colonia di a. tumefaciens da ogni piatto in 3 mL di terreno liquido LB contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 50 µ g/mL di rifampicina e agitare a 220 giri/min a 28 ° C per 24 h propagare la coltura delle cellule.
4. Trasferimento 75 µ l di coltura in terreno liquido del LB fresco 15 mL contenente 50 µ g/mL di kanamicina e 50 µ g/mL di rifampicina, diluirla con un fattore di 200. Cultura, i batteri a 220 giri/min a 30 ° C per circa 8 ore, fino a quando OD₆₀₀ è tra 0,5 e 1,0.
5. Trasferire la coltura liquida di a. tumefaciens in provette per centrifuga da 15 mL e centrifugare a 4.000 x g e a 4 ° C per 15 min. scartare il sopranatante e sospendere il pellet in 15 mL di soluzione di trasformazione per lavare il pellet.
6. Girare il tubo a 4.000 x g e a 4 ° C per 15 min e scartare il surnatante. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio.
7. Risospendere il pellet in 5 mL di soluzione di trasformazione e mantenere per 2 h a temperatura ambiente. Regolare la densità delle cellule di pellet a. tumefaciens con soluzione di trasformazione fino a quando la concentrazione finale di OD₆₀₀ è 0,5, o mix due campioni con volume uguale per test interazioni proteina accoppiati.
8. Le cellule si infiltrano in sospeso in 4^th a 7^th lascia con una siringa senza ago da 1 mL (Figura 1B-C). Dopo l'infiltrazione, coprire immediatamente le piante con una copertura di plastica nera e posizionare il vassoio nel buio per 12 h. Dopo di che, crescono piante come al solito per 2 a 4 giorni prima rilevazione attività LUC.
   Nota: Scegliere sane foglie di dimensioni simili. L'infiltrazione di quattro diverse zone in una foglia va bene.

3. rilevare l'attività luciferasica (un giorno)

Nota: Ci sono due modi per monitorare l'attività luciferasica. Uno si basa sull'imaging e l'altro è quello di misurare quantitativamente l'attività luciferasica.

1. Metodo di formazione immagine
   1. Staccare una foglia di infiltrati e mettere l'intero opuscolo su MS-agar.
   2. Buffer di lavoro luciferina spray sulla superficie adassiale foglia con un flacone spray da 50 mL. Conservare il materiale al buio per 5 min placare la auto-fluorescenza della clorofilla.
   3. Utilizzare un CCD raffreddata di basso-luce imaging apparato (raffreddato a-30 ° C) per catturare le immagini (Figura 2). Il tempo di esposizione di luce-archiviato è 50 ms, e tempo di rilevamento di luminescenza è 1 min.
      Nota: Regolare i parametri secondo il manuale della macchina. Temperature più basse migliorerà il rapporto segnale-rumore per migliorare la qualità dell'immagine.
2. In alternativa, misurare luminescenza direttamente con un luminometro commerciale.
   1. Accuratamente tagliare frammenti di foglia (circa 0,25 cm²) dalla zona di infiltrazione delle foglie N. benthamiana e immergere il disco di foglia in 100 µ l di acqua deionizzata in un piatto bianco 96 pozzetti (Figura 3).
   2. Aggiungere 10 µ l di buffer di lavoro luciferina e lasciare per 5 min. Quindi eseguire trattamenti specifici per lo studio della dinamica di interazione della proteina.
      Nota: Rilevare la luminescenza con un luminometro intervalli di tempo diversi per ottenere la dinamica attività di luciferasi, che rappresentano la cinetica delle interazioni proteina-proteina sotto determinato trattamento. Questo metodo presenta vantaggi per il test di un gran numero di coppie di proteine contemporaneamente. Per quelli senza un luminometro commerciale, esaminare le abbondanze di proteina luciferasi mediante western blot, pertanto consultare la quantità di attività LUC. Se la luce non è necessariamente richiesta, basta tenere la piastra sul luminometro e misurare luminescenza in diversi momenti. In caso contrario, spostare la piastra in una camera di crescita durante il gap di rilevamento. Per ottenere risultati statisticamente significativi, è necessario utilizzare almeno tre replicati biologici. Sebbene LUC attività dalle zone di infiltrazione differenti variano, cambiamenti dei loro modelli sono coerenti dopo la normalizzazione.

Risultati

Tre passaggi principali possono essere individuati in questo protocollo di complementazione di luciferase per lo studio delle proteine interazioni in vivo, tra cui la crescita delle piante, l'infiltrazione di tabacco e l'analisi di luciferase. Il passaggio più importante in questo protocollo è infiltrazione del liquido a. tumefaciens in N. benthamiana foglie (Figura 1).

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Discussione

Il protocollo descritto qui è semplice e riproducibile per studiare in vivo interazioni proteina-proteina e particolarmente adatto per la rilevazione di dinamiche di interazione della proteina sotto trattamento esogeno. Il passo fondamentale in questa analisi è N. benthamiana infiltrazione. Per garantire il successo di infiltrazione, le piante devono essere molto sani. Un altro fattore critico è quando controllare l'attività luciferasica dopo infiltrazione. Non c'è nessuna risposta corretta a quest...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transformation solution
10 mM Morpholineethanesulfonic acid	VETEC	V900336
27.8 mM Glucose	VETEC	V900392
10 mM MgCl2×6H2O	VETEC	V900020
150 μM Acetosyringone	ALDRICH	D134406
pH 5.7
Luciferin working buffer
5 mM Luciferin potassium salt	GOLD BIOTECHNOLOGY	LUCK-100
0.025% Triton X-100	VETEC	V900502
H2O to 10 ml