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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo studio, descriviamo l'approccio del canale semicircolare posteriore come un metodo affidabile per la consegna del gene dell'orecchio interno in topi neonatali. Indichiamo che consegna del gene attraverso il canale semicircolare posteriore è in grado di irrorare l'intero orecchio interno.

Abstract

Terapia genica dell'orecchio interno offre grande promessa come un potenziale trattamento per la perdita dell'udito e vertigini. Uno dei fattori critici del successo della terapia genica dell'orecchio interno è quello di trovare un metodo di consegna che si traduce in efficienza di trasduzione coerente di tipi cellulari mirate, riducendo al minimo la perdita dell'udito. In questo studio, descriviamo l'approccio del canale semicircolare posteriore come un metodo praticabile per la consegna del gene dell'orecchio interno in topi neonatali. Indichiamo che consegna del gene attraverso il canale semicircolare posteriore è in grado di irrorare l'intero orecchio interno. La facile individuazione anatomica del canale semicircolare posteriore, così come manipolazione minima dell'osso temporale richiesto, rendono questo chirurgico approccio un'opzione attraente per consegna del gene dell'orecchio interno.

Introduzione

Terapia genica dell'orecchio interno è un settore in rapida evoluzione dell'indagine. È stato applicato in vari modelli animali di combattimento ototossicità, il trauma di rumore e di perdita dell'udito ereditario1. Parecchi studi recenti hanno dimostrato il recupero funzionale dell'udito e funzioni della bilancia in topi mutanti dopo orecchio interno gene terapia consegna2,3,4,5,6, 7. uno dei principali fattori nel determinare il successo della terapia genica dell'orecchio interno è il metodo chirurgico utilizzato per accedere l'orecchio interno. Idealmente, l'approccio chirurgico sarebbe facile da eseguire, i limiti anatomici sarebbe coerente e facile da identificare, e la trasduzione risultante di tipi cellulari mirata sarebbe elevata.

In un recente studio, abbiamo dimostrato che quando la terapia genica virale è stata iniettata attraverso il canale semicircolare posteriore del mouse mutante whirler (un modello di perdita dell'udito e disfunzione vestibolare), trasduzione efficiente di cellule ciliate sensoriali è stato visto nella vestibolare organi, così come la coclea5. L'alta efficienza di trasduzione sensoriale della cellula ciliata ha provocato il miglioramento delle funzioni uditive e vestibolari in questi topi mutanti.

In questo articolo, descriviamo in dettaglio l'approccio del canale semicircolare posteriore per accedere l'orecchio interno neonatale del mouse.

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Protocollo

Tutte le procedure di animali sono state approvate dal comitato di utilizzo presso il National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (NIDCD ASP1378-15) e cura degli animali.

1. procedura installazione e preparazione

  1. Sterilizzare tutti gli strumenti di ossido di etilene all'inizio dell'esperimento. Tra gli animali, pulire gli strumenti utilizzando la sterilizzazione della perla.
  2. Caricare la soluzione contenente la terapia genica virale in una micropipetta su micro-iniettore. Il vettore virale utilizzato in questo studio è stato AAV2/8-whirlin (1 x 1013 genoma copie per millilitro, vedere la tabella dei materiali).
    Nota: In genere, il volume totale di 1,1 µ l viene caricato nella micropipetta.

2. anestesia

Nota: Il ceppo del mouse utilizzato in questo studio è il mouse whirler. Entrambi omozigoti mutanti (Whrnwi/wi) e littermates eterozigoti (Whrn+ wi) sono stati usati.

  1. Posto la madre in una gabbia separata (separata dalla lettiera).
  2. Posto dalla gabbia contenente la lettiera (P0 - P5 cuccioli) su un pad termico a ricircolo (insieme a 37,5 ° C) per mantenere caldi i topi.
  3. Tagliare la parte di pollice di un guanto di lattice e inserire un cucciolo in esso.
  4. Collocare il cucciolo nel guanto di lattice pollice in un secchio di ghiaccio per ~ 2 min.
  5. Posizionare il pup anestetizzato su una confezione di grande gelata di plastica quadrato commerciale con una garza 4 "x 4" tra il cucciolo e superficie del pack.
  6. Riempire un guanto di lattice per impieghi gravosi con ghiaccio tritato e il guanto di ghiaccio intorno il pup.
  7. Controllare per vedere se il cucciolo è adeguatamente anestetizzato dalla completa mancanza di qualsiasi risposta a vari stimoli (tra cui un pizzico di punta costante). Lasciare il cucciolo sull'impacco di ghiaccio per tutta la durata dell'intervento chirurgico (circa 5-10 min).
    Nota: Si consiglia di lasciare i cuccioli sull'impacco di ghiaccio per non più di 15 min durante l'intervento chirurgico.

3. chirurgico approccio (Figura 1)

  1. Una volta che l'animale è anestetizzato, pulire la pelle dietro l'orecchio con un batuffolo imbevuto di iodio e un batuffolo imbevuto di alcool.
  2. Fare un'incisione postauricular ~ 2 mm dietro l'orecchio utilizzando micro-forbici e dividere il muscolo sternocleidomastoid con micro-forbici.
  3. Identificare il nervo facciale e la bulla. La bulla è cartilaginoso e semi-trasparente a questa età e si trova mediale al nervo facciale. L'arteria stapediali può essere visto attraverso la bulla a questa età, che è un utile punto di riferimento.
  4. Seguire il nervo facciale superiormente e posteriormente per individuare il canale semicircolare posteriore (PSCC). Rimuovere le fibre muscolari e del tessuto molle che ricopre il canale semicircolare posteriore utilizzando micro-forbici.
    Nota: Il PSCC è cartilaginoso a questa età.
  5. Penetrare il PSCC utilizzando una micropipetta di vetro (~ 10 μm di diametro) su micro-iniettore.
  6. Iniettare la terapia genica virale nell'orecchio interno.
    Nota: In genere, un totale di 20 iniezioni di 49 nL della terapia genica sono consegnati nel canale semicircolare posteriore oltre 40 ~ s (volume totale ~ 1 µ l). Il titolo virale utilizzato era 1 x 1013 genoma copie / mL.
  7. Chiudere l'incisione della pelle utilizzando una sutura in polyglactin 5-0.

4. postoperatoria

  1. Posto il cucciolo su un tappetino riscaldante per ripristinare una normale temperatura corporea durante il recupero dall'anestesia con costante manuale stimolazione/rolling con le dita guantate umane.
  2. Una volta che il cucciolo è sveglio, posizionarlo nella sua gabbia a casa.
  3. Accarezzano ogni cucciolo con un tampone di cotone che è stato esposto per la biancheria da letto di gabbia a casa.
    Nota: Lo scopo di questo è di avere i topi odore come hanno fatto prima dell'intervento, che aumenta la probabilità della madre ri-accettando la sua post-chirurgia cucciolata. Se possibile, urina dalla madre possa essere raccolti e strofinato sui cuccioli con un batuffolo di cotone per ridurre ulteriormente il rischio di rigetto.
  4. Applicare olio minerale al naso della madre per desensibilizzare la sua8e reintrodurre la madre dalla gabbia.

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Risultati

Iniezione di AAV8-whirlin terapia genica nei topi whirler neonatale attraverso il canale semicircolare posteriore ha provocato whirlin espressione (verde) in cellule ciliate utricular (Figura 2), con l'efficienza di infezione generale di 53,1% (SD 38,1, n = 28)5 . Cellule trasdotte capelli aveva allungato stereocilia (rosso) rispetto alle cellule ciliate dalle orecchie non iniettato controlaterale (5,35 µm ± 2.11 vs 3.20 ± 0.34 µm,...

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Discussione

Diversi approcci chirurgici sono stati descritti per accedere roditore orecchi interni. Cochleostomy e finestra rotonda approcci sono più comunemente utilizzati per accedere alla coclea, mentre il canale semicircolare posteriore e il sacco endolinfatico approcci vengono in genere utilizzati per accedere gli organi vestibolari1. In uno studio recente, abbiamo mostrato quel canale semicircolare posteriore iniezioni di terapia genica virale ha provocate ad alta efficienza di trasduzione delle cellul...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nessun pertinenti informazioni integrative per fare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal NIDCD divisione di intramurale ricerca /NIH (DC000082-02 al W.W.C.), così come DC000081 al nucleo di imaging avanzata. Siamo grati per il personale della struttura animale NIDCD per la cura per i nostri animali.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Operating microscopeZeissOPMI Pico ENT microscope. Other dissection microscopes would also work.
Micro-forceptsFine Science Tools11251-10, 11295-51#5 and #55 Dumont
Micro-scissorsFine Science Tools15002-08
Nanoliter2000 microinjectorWorld Precision Instruments
Heating padMastexModel 500/600
5-0 vicryl suturesEthicon
AAV8-whirlinVector Biolabs
Glass pipetteSutter InstrumentsB100-75-10Borosilicate glass

Riferimenti

  1. Chien, W. W., Monzack, E. L., McDougald, D. S., Cunningham, L. L. Gene therapy for sensorineural hearing loss. Ear Hear. 36, 1-7 (2015).
  2. Askew, C., et al. Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 7, 295(2015).
  3. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75, 283-293 (2012).
  4. Pan, B., et al. Gene therapy restores auditory and vestibular function in a mouse model of Usher syndrome type 1c. Nat Biotechnol. 35, 264-272 (2017).
  5. Isgrig, K., et al. Gene Therapy Restores Balance and Auditory Functions in a Mouse Model of Usher Syndrome. Mol Ther. 25, 780-791 (2017).
  6. Lentz, J. J., et al. Rescue of hearing and vestibular function by antisense oligonucleotides in a mouse model of human deafness. Nat Med. 19, 345-350 (2013).
  7. Shibata, S. B., et al. RNA Interference Prevents Autosomal-Dominant Hearing Loss. Am J Hum Genet. 98, 1101-1113 (2016).
  8. Van Sluyters, R. C., Obernier, J. A. Guidelines for the care and use of mammals in neuroscience and behavioral research. Contemp Top Lab Anim. 43, 48(2004).
  9. Chien, W. W., et al. Gene Therapy Restores Hair Cell Stereocilia Morphology in Inner Ears of Deaf Whirler Mice. Mol Ther. 24, 17-25 (2016).
  10. Hirose, K., Hartsock, J. J., Johnson, S., Santi, P., Salt, A. N. Systemic lipopolysaccharide compromises the blood-labyrinth barrier and increases entry of serum fluorescein into the perilymph. J Assoc Res Otolaryngol. 15, 707-719 (2014).
  11. Okada, H., et al. Gene transfer targeting mouse vestibule using adenovirus and adeno-associated virus vectors. Otol Neurotol. 33, 655-659 (2012).
  12. Suzuki, J., Hashimoto, K., Xiao, R., Vandenberghe, L. H., Liberman, M. C. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 7, 45524(2017).

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