Controllo spaziale e temporale di attivazione delle cellule T utilizzando un agonista fuse

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.

Abstract

Linfociti T impegnano nella segnalazione rapida, polarizzati, che si verificano pochi minuti dopo l'attivazione del TCR. Ciò induce la formazione di sinapsi immunologica, una giunzione cellulare stereotipato che regola l'attivazione delle cellule T e direzionalmente gli obiettivi le risposte effettrici. Per studiare questi processi in modo efficace, è necessario un approccio imaging che è su misura per catturare le risposte veloci, polarizzate. Questo protocollo descrive tale sistema, che si basa su un fuse peptide-major istocompatibilità (pMHC) che è non-stimolatore fino a quando è esposto a luce ultravioletta. Decaging mirati di questo reagente durante gli esperimenti di videomicroscopia consente controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione di TCR e monitoraggio ad alta risoluzione delle successive risposte cellulari di riflessione interna totale (TIRF) imaging. Questo approccio è anche compatibile con le strategie di perturbazione genetici e farmacologici. In questo modo per il montaggio delle vie molecolari ben definite che collegano TCR segnalazione alla formazione delle strutture citoscheletriche polarizzate che sottendono la sinapsi immunologica.

Introduzione

Linfociti T (cellule T) gioca un ruolo centrale nell'immunità cellulare riconoscendo peptidi antigenici visualizzate nel contesto della superficie cellulare MHC. Riconoscimento dell'antigene, che è mediata dal TCR, spinge la differenziazione delle cellule T naive e promuove la consegna delle risposte citolitiche e comunicative di effettori. Impegno di TCR inoltre induce cambiamenti drammatici nell'architettura cellulare. In pochi minuti, le cellule T gloms sul lato della cella presentanti l'antigene (APC), formando un'interfaccia polarizzata, conosciuta come la sinapsi immunologica (IS)^1,2. L'IS rafforza le risposte delle cellule T effettrici abilitando il direzionale rilascio di citochine o, nel caso dei linfociti T citotossici (CTL), proteine litiche che distruggono l'APC.

Impegno di TCR di pMHC induce la fosforilazione rapida di più molecole di adattatore a valle, compreso il Linker per le celle di attivazione di T (LAT), che in definitiva promuove robusto rimodellamento del citoscheletro sinaptica². Corticale actina filamentosa (F-actina) unità delle cellule di T di diffusione sopra la superficie APC e poi si risolve in una struttura anulare caratterizzata da accumulo di F-actina alla periferia IS e svuotamento dal centro. Formazione di anello di F-actina è strettamente per il riorientamento del centro organizzatore dei microtubuli (MTOC, chiamato anche il centrosoma in cellule di T) ad una posizione appena sotto il centro dell'interfaccia. Entrambi gli eventi si verificano all'interno di minuti di riconoscimento iniziale dell'antigene e stabilire il contesto architettonico in cui gli eventi di attivazione successiva ed effettrici si ottiene una risposta.

Per studiare la formazione di IS, vari laboratori hanno sviluppato approcci in cui la APC è sostituito da una superficie di vetro che contiene immobilizzato TCR ligandi o supporta un bilayer del lipido che a sua volta contiene i ligandi^3,4. T cellule formano IS-come contatti su queste superfici che possono essere imaged di microscopio a fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) o microscopia confocale, permettendo studi ad alta risoluzione di attivazione delle cellule T iniziale e la formazione di IS.

Sebbene questi approcci hanno permesso per visualizzazione eccellente del è completamente assemblato, gran parte della legatura TCR:pMHC seguente segnalazione si verifica in pochi secondi, che complica gli sforzi per determinare la sequenza degli eventi che seguono l'attivazione TCR con precisione . Per ovviare a questo problema, è stato sviluppato un approccio di fotoattivazione, in cui fuse pMHC viene utilizzato per realizzare il controllo spazio-temporale di TCR attivazione^5,6,7. In questo sistema, le cellule T sono attaccate alle superfici di vetro contenente pMHC di fuse che è non-stimolatori per il TCR, fino a quando irradiato con luce ultravioletta (UV). Irradiazione UV di una regione di graduate micron della superficie sotto la cellula T rimuove il photocage creando una zona di stimolatorio che possa essere riconosciuta dalle cellule T. Eventi successivi di segnalazione e il rimodellamento del citoscheletro sono quindi monitorati utilizzando reporter fluorescenti geneticamente codificato. Due versioni di fuse di peptidi antigenici, lepidottero del citocromo c_88-103 (MCC) e ovoalbumina_257-264 (OVA), che vengono presentati nel contesto della classe II MHC-E^k e la classe I di MHC H2-K^b, rispettivamente, sono stati sviluppato (Figura 1). Questo permette l'analisi di entrambi CD4⁺ T cellule specifiche per MCC-I-E^k (esprimendo il 5 C. C7, 2B4, o AND TCR) e CD8⁺ T cellule specifiche per OVA-H2-K^b (che esprimono TCR OT1).

Nell'ultimo decennio, l'approccio di fotoattivazione e formazione immagine di TCR è stata utilizzata per stabilire la precisa cinetica di TCR primi passi di segnalazione e anche per identificare i meccanismi molecolari che regolano polarizzata in rimodellamento del citoscheletro^{5, 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. ad esempio, il dosaggio è stato strumentale nel determinare tale centrosoma riorientamento verso l'APC è mediato da una sfumatura localizzata del lipido secondo messaggero diacilglicerolo centrato presso l'IS. Si prevede che questa metodologia continuerà ad essere prezioso per applicazioni che richiedono analisi di imaging ad alta risoluzione della funzione delle cellule T.

Protocollo

1. preparazione delle superfici di vetro stimolatore

1. Coprioggetto cappotto otto pozzetti camerata con biotinilati poli-L-lisina (Bio-PLL) diluito 1: 500 in acqua distillata e deionizzata (ddH₂O). Incubare per 30 min a temperatura ambiente (TA).
2. Lavare con H₂O.
3. A secco per 2 h a RT.
4. Blocco di Bio-PLL rivestito superfici con tampone bloccante (tamponata HEPES salino [10 mM HEPES a pH 7.4, 150 mM NaCl], con 2% BSA) per 30 minuti a TA.
   1. Sciogliere 5 mg di poli-L-lisina hydrobromide in 1 mL di 10 mM NaPO₄, pH 8.5.
   2. Aggiungere 125 μmol (0,55 mg) di NHS-biotina (da uno stock di 100 mg/mL in DMSO) e controllare il pH della reazione. Se il pH è inferiore a 8,5, aggiungere 2 μL di 4 N NaOH per elevarlo a tra pH 8.5 e 9.5.
   3. Vortexare per 30 min.
   4. Placare la reazione con 50 µ l di 100 mM glicina disciolta in 20 millimetri Tris pH 8.0.
   5. Gira alla massima potenza per 10 min e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
      Nota: Qualità Bio-PLL è in genere rispetto al precedente preparazioni del rivestimento diluizioni seriali del materiale su una piastra a 96 pozzetti ELISA e quantificare il contenuto in biotina dopo incubazione con fosfatasi alcalina accoppiato streptavidina.
5. Rimuovere il tampone di bloccaggio. Non lasciare asciugare pozzetti. Aggiungere streptavidina (100 µ g/mL in tampone bloccante). Incubare per 1 h a 4 ° C.
6. Lavare HBS. Riempire e invertire pozzi diapositiva camera 4 - 5 volte, rimozione di HBS dai pozzi. Non lasciare asciugare pozzetti.
7. Aggiungere il biotinilati pMHC ligandi e molecole di adesione alla superficie.
   Nota: MCC e ovuli possono essere photocaged con l'aggiunta di ortho-nitrobenzyl basato su gruppi di protezione (ad es., nitrophenylethyl (NPE) o nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)) per il gruppo ε-amminico di Lisine chiave (K12 in MCC, K7 in ovuli). Photocaged MCC e ovuli possono essere ottenuti da produttori commerciali. Dopo la ricostituzione in tampone acquoso, essi sono ripiegati in batterico espressa-E^k e H2-K^b utilizzando gli approcci stabiliti^11,12.
8. Convalida del peptide MCC o ovuli fuse
   1. Decage peptidi NVOC protetto UV irradiando con una lampada UV portatile (Vedi Tabella materiali) per 20 minuti a TA.
   2. Torio impulso 1.0 x 10⁵ APC con 1 µM del peptide nonstimulatory (controllo negativo, ad esempio Hb), fuse peptide, peptide irradiati fuse e peptide agonista (controllo positivo, per esempio, MCC) per 1 h a durante la notte a 37 ° C.
   3. Per stimolare le cellule T che esprimono il 5C. C7/2B4/AND TCR, utilizzare celle CH12 o CH27 B. Per stimolare le cellule T OT1, utilizzare EL4 thymoma cellule o RMA-s.
   4. Mescolare le APCs pulsato con un numero uguale di cellule T nel 96 pozzetti tondo piastre inferiori ad un volume finale di 200 µ l. Incubare a 37 ° C per 12-24 h.
   5. Recuperare i surnatanti da ciascun pozzetto e analizzare il-2 da ELISA con rilevazione colorimetrica di streptavidina-rafano perossidasi.
      Nota: Conferma dello status ingabbiamento di tutti i peptidi mediante spettrometria di massa electrospray prima del ripiegamento in complessi MHC, è fortemente raccomandato.
9. Eseguire la piegatura e la purificazione di MHC in modo da minimizzare l'esposizione alla luce. Ad esempio, avvolgere pieghevole reazioni nella carta stagnola e svolgere cromatografia di gel filtrazione con la lampada UV.
   Nota: È stato trovato quel fuse MCC-I-E^k e OVA - H2-K^b indurre attivazione indipendente delle cellule di T UV ad alta densità, probabilmente a causa di ingabbiamento funzionale incompleta. Quindi, il pMHC di fuse è diluito in un eccesso di x di 10-30 di nonstimulatory pMHC (per esempio -E^k contenente il peptide di_64-76 di emoglobina (Hb)) durante la fase di immobilizzazione. Questo migliora il rapporto segnale-rumore del successivo esperimento di formazione immagine.
10. A photoactivate CD4⁺ T cellule, collettivamente utilizzare una miscela di biotinylated Hb-I-E^k (3 µ g/mL), biotinylated fuse MCC-I-E^k (0.1 µ g/mL) e anticorpi biotinilati contro la classe I di MHC H2-K^k (0,5 µ g / mL). incoraggia l'anticorpo anti-H2-K^k 5 C. C7/2B4/AND T cellule, che esprimono H2-K^k, di diffondere sulla superficie di vetro senza in fase di attivazione.
11. Per CD8⁺ T cellule, utilizzare una miscela di biotinylated H2-D^b recanti il peptide KAVYDFATL (1 µ g/mL), fuse biotinilati OVA-H2-K^b (0,1 µ g/mL) e il dominio extracellulare della molecola di adesione ICAM-1 (2 µ g/mL prodotto da cellule di insetto cultura¹³). L'ICAM-1 incoraggia stretto contatto formazione coinvolgendo l'integrina LFA1 sulla superficie delle cellule T.
12. Applicare tutte le miscele della proteina in tampone bloccante, seguita da incubazione per 1h a RT o almeno 2 ore a 4 ° C.
    Nota: La densità molecolare su superfici di questo tipo per essere ~ 8000 a µm² è stata determinata in precedenza⁶. Dato che fuse pMHC rappresenta ~1/30^th della proteina biotinilato sulla superficie, la sua densità sarà ~ 267 molecole al µm², prima del decaging.
13. Lavare come al punto 1.6 e lasciare in HBS fino all'uso.
14. Aggiungere 200.000 CD4⁺ o CD8⁺ T cellule che esprimono TCR appropriato in ogni pozzetto e permettono alle cellule di aderire a 37 ° C per 15 min. Una volta che le cellule hanno attaccato al e distribuire sulla superficie, sono pronti per fotoattivazione e imaging.
    Nota: Retroviral trasduzione di cellule T effettrici con imaging sonde fluorescenti è descritto in dettaglio altrove^6,7. Segnalazione del calcio possono essere studiate anche utilizzando cellule di T untransduced caricate con il colorante sensibile del calcio Fluo-4⁶. Il colorante raziometrici Fura-2 non è raccomandato perché richiede eccitazione nella gamma UV, che induce anche la decaging della pMHC di fuse.

2. acquisizione immagini

1. Usare un microscopio rovesciato di TIRF provvisti di un UV compatibile 150 X obiettivo obiettivo per acquisizione di immagini. UV irradiare regioni definite dall'utente utilizzando un sistema a membrana digitale collegato ad una lampada a mercurio 100 W (HBO). Diretta UV luce da questa lampada sul campione utilizzando un mirror di passaggio lungo 400 nm.
2. Utilizzare software di analisi di immagine per fotoattivazione localizzata e l'acquisizione di time-lapse. Nella maggior parte degli esperimenti, monitorare le sonde in entrambi i canali, verde e rossi, utilizzando 488 nm e laser di eccitazione 561 nm, rispettivamente. Luce laser è diretto sul campione utilizzando uno specchio dicroico dual-banda passante che trasmette anche nella gamma UV (per abilitare decaging). Per ulteriori informazioni sulla configurazione del microscopio, vedere la Tabella dei materiali e la Figura 6 .
3. Dopo aver montato la diapositiva di camera che contiene le cellule di T, regolare le impostazioni per ottenere illuminazione TIRF o epifluorescenza, come necessario. In modalità live, selezionare un campo di cellule che esprimono il sonde fluorescenti di interesse. Stabilire regioni di micron-scala per fotoattivazione sotto singole celle utilizzando software di controllo.
4. Iniziare l'acquisizione di time-lapse. In genere, 80 punti temporali vengono acquisiti, con un intervallo di 5 s tra ogni punto del tempo. Questo lascia più di abbastanza tempo per sequenziale 488 nm e 563 nm esposizioni, nel caso di esperimenti di doppio colore.
5. Dopo 10 punti temporali, photoactivate le regioni selezionate aprendo il diaframma digitale dell'otturatore per 1-1,5 s.
6. Dopo aver completato il lasso di tempo, selezionare un nuovo campo di cellule e ripetere il processo.

3. analisi dei dati

Nota: Localizzata fotoattivazione di ligandi immobilizzati crea una regione ben definita, stazionaria stimolatore che può essere utilizzata per l'analisi quantitativa di segnalazione eventi rimodellamento del citoscheletro e risposte. Analisi protocolli tipicamente coinvolgono o quantificare l'intensità di fluorescenza all'interno della regione irradiata o utilizzando la regione irradiata come endpoint posizionale per misurazioni della distanza (ad es. per la valutazione della polarizzazione del centrosoma per la irradiati regione). Entrambi i protocolli di analisi sono descritti di seguito. Vari programmi di analisi di immagine interattiva consente di rendere intensità e misurazioni della distanza, che possono poi essere uscita per ulteriore elaborazione e analisi.

1. Intensità di fluorescenza
   1. Determinare l'intensità di fluorescenza (FI) di una regione di sfondo all'esterno della cella (FI_b). Verrà utilizzato per la correzione di fondo.
      1. Disegnare un'area quadrata micron imprese fuori della cellula e fare una maschera. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori.
         Nota: Dettagli procedurali (ad es. 3.1.1.1) fare riferimento al software Slidebook (Vedi Tabella materiali). Attuazione del presente protocollo utilizzando altri pacchetti software (ad es., FIJI) sarà leggermente diverso.
   2. Determinare il FI all'interno della regione di fotoattivazione per ciascun punto di tempo.
      1. Selezionare maschera per evidenziare la regione che era fotoattivazione. Per determinare l'intensità di fluorescenza, fare clic su Analyze | Mascherare le statistiche. Selezionare Media intensità di fluorescenza ed esportare i valori.
   3. Sottrarre lo sfondo FI dai valori misurati FI all'interno della regione. Quindi, normalizzare le misure FI corrette dividendo per la media, sfondo corretto FI dei primi 9 fotogrammi prima di fotoattivazione. ΔF/F = ((FI-FI_b)/mean(FI_1-9)-FI_b)).
      Nota: Il grafico ΔF/F in funzione del tempo.
2. Distanza
   1. Ottenere la x e y le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.
      1. Per determinare gli assi x e y le coordinate del centro della regione fotoattivazione, selezionare maschera per evidenziare la regione che era fotoattivazione. Una volta evidenziata la regione di fotoattivazione, selezionare Analyze | Mascherare le statistiche | Centro della zona ed esportare i valori.
   2. Determinare gli assi x e y coordinate per la sonda fluorescente di interesse per ogni punto di tempo. Questo è tipicamente realizzato attraverso manuali o automatizzate delle particelle di rilevamento.
      1. Per determinare gli assi x e y coordinate della sonda fluorescente di interesse, selezionare Manuale Particle Tracking e cliccare sulla sonda fluorescente di interesse nel corso del tempo. Una volta che sono stati monitorati tutti i punti di tempo, selezionare Analyze | Mascherare le statistiche | Centro della zona ed esportare i valori.
   3. Calcolare la distanza tra la proteina fluorescente di interesse e il centro della regione di fotoattivazione per ciascun punto di tempo usando l'equazione: distanza = √ ((x₂x -₁)²+ (y₂y -₁)²), in cui x₂ e y₂ sono le coordinate della proteina fluorescente di interesse e x₁ e₁ di y sono le coordinate del centro della regione di fotoattivazione.
   4. Grafico della distanza in funzione del tempo.

Risultati

L'approccio di fotoattivazione e imaging consente per l'osservazione e facile quantificazione delle risposte di segnalazione rapide, polarizzate. Per illustrare le sue capacità, riprodotta qui è un esperimento esaminando la spatiotemporal correlazione tra accumulo di TCR-indotta DAG e centrosoma riorientamento. 5 C. Gli scoppi di cella C7 T retrovirally sono state trasdotte con due reporter fluorescenti: un biosensore DAG contenente i domini di C1 tandem da chinasi di proteina C-θ coll...

Discussione

Negli ultimi anni, la luce è emerso come un ottimo strumento per l'attivazione spatiotemporally controllata dei processi cellulari. Sono state sviluppate varie metodologie, ciascuno con associati vantaggi e svantaggi. Il sistema descritto qui, che è basato su decaging di ligandi extracellulari, immobilizzati, è ideale per l'analisi delle risposte di segnalazione rapide, subcellulare, polarizzate. Questo approccio è stato applicato per esaminare è formazione in cellule di T, come descritto in precedenza. Inoltre, son...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermofischer Scientific	155361
Poly-L-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P2636	Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
EZ-Link NHS-Biotin	Thermofischer Scientific	20217	Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine
Streptavidin	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit	Avidity	BirA500	Will be used to biotinylate proteins
Biotinylated Hb I-EK			For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit
Biotinylated NPE-MCC I-EK	Anaspec		Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated αH2-Kk antibody	BD Biosciences	553591
Biotinylated NPE-OVA H2-Kb	Anaspec		Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec
Biotinylated KAVY H2-Db	Anaspec		Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec
Biotinylated ICAM1			For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit
Hand held UV lamp	UVP	UVGL-25	Lamp is held < 1 cm from the sample.  30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging.
Olympus IX-81 OMAC TIRF system.	Olympus		Additional information about the imaging system can be found in Figure 6
Mosaic digital diaphragm	Andor
Slidebook software	Intelligent Imaging Innovations