Analisi Neuroanatomical retrogrado dei motoneuroni frenico in topi

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per l'identificazione dei motoneuroni frenici in topi dopo intrapleural consegna del fluoroforo coniugati beta unità secondaria di colera tossina. Due tecniche vengono confrontati per iniettare la cavità pleurica: transdiaphragmatic versus approcci transtoracico.

Abstract

Frenici motoneuroni sono motoneuroni cervicali provenienti da C3 a C6 livelli in specie di mammiferi più. Proiezioni axonal convergono in nervo frenico che innerva il diaframma respiratorio. A fettine di midollo spinale, frenici motoneuroni non può essere identificati da altri neuroni di motore su criteri morfologici o biochimici. Forniamo la descrizione delle procedure per la visualizzazione di corpi cellulari del neurone di motore frenico in topi, seguente intrapleural iniezioni di colera tossina subunità beta (CTB) coniugata con un fluoroforo. Questo tracciante fluorescente neuroanatomical ha la capacità di essere presi alla giunzione neuromuscolare diaframma, essere retrogradely trasportato lungo gli assoni frenici e raggiungere i corpi cellulari frenici. Vengono confrontati due approcci metodologici di consegna CTB intrapleural: transdiaphragmatic versus transtoracica iniezioni. Entrambi gli approcci sono successo e risultare in numero simile di CTB-labeled frenici motoneuroni. In conclusione, queste tecniche possono essere applicate per visualizzare o quantificare i motoneuroni frenici in vari studi sperimentali come quelli focalizzati sulla circuitazione diaframma-frenico.

Introduzione

Lo scopo dello studio è quello di presentare un metodo affidabile per identificare frenici motoneuroni (PhMN) su sezioni di midollo spinale di topo. L'iniezione di un tracciante fluorescente neuroanatomical nella cavità pleurica è stato scelto come metodo di consegna per raggiungere le proiezioni neuromuscolare frenica sulla membrana del e utilizzare trasporto retrogrado lungo gli assoni frenici per etichettare frenici corpi cellulari. Vengono descritte due tecniche di consegna intrapleural: transdiaphragmatic versus transtoracica.

Frenici motoneuroni sono cellule spinali relè cui assoni convergono in nervi frenici, che in definitiva innervano il diaframma. Si tratta di neuroni motori inferiori beneficiano l'unità inspiratorio i centri respiratori bulbari e l'inoltro alle giunzioni neuro-muscolari del diaframma (NMJ). PhMN sono strutturati in due colonne motore, uno per ogni hemicord, che corre lungo la spina dorsale di metà di-cervicali. Nella maggior parte delle specie di mammiferi compreso gli esseri umani, le colonne motore frenica si è diffusa da livelli C3 C6^1,2,3. Noi ed altri abbiamo confermato che PhMN concentrata in livelli C3-C5 in ratti e topi del midollo spinale^4,5,6,7,8. La distribuzione topografica delle cellule frenica non è a caso; motoneuroni che innervano la parte sternale del diaframma sono distribuiti più densamente nella parte craniale della piscina motore frenica (C3), mentre i motoneuroni che innervano la parte crurale sono più caudale (C5)⁹. Inoltre, PhMN sono raggruppati variamente nella materia grigia corno ventrale. A livello di C3, i mazzi delle cellule frenico si trovano lateralmente, poi spostare in senso ventrolateral e ventromedially si trovano presso la più caudale di livelli^10,11.

Dato il loro ruolo vitale durante l'inspirazione, è della massima importanza per identificare con precisione PhMN nel midollo spinale sano, ma anche seguire il loro destino durante condizioni patologiche, come le malattie degenerative o lesioni traumatiche del midollo spinale. Poiché PhMN non differiscono morfologicamente da altri motoneuroni cervicali, identificazione di PhMN si basa sulla somministrazione mirata di traccianti neuroanatomici sia a livello dei centri respiratori primario⁸, o presso il diaframma NMJ⁷ o in il nervo frenico⁴. Il tracciante è ripreso da fibre nervose e trasportato fino ai corpi cellulari frenici del rachide cervicale, dove possono essere visualizzato utilizzando sistemi di rilevazione diretta o indiretta. Retrograda o anterograda traccianti sono commercialmente disponibili con una vasta gamma di coniugati. Degno di nota, ogni elemento tracciante è dotato di no, bassa o alta capacità per la trans sinaptica traccia.

Nello studio corrente, abbiamo scelto la subunità beta della tossina colerica (CTB) funzionalizzata con Alexa Fluor 555 (d'ora in poi denominato CTB-fluoroforo) come un'etichetta fluorescente, che permette una visualizzazione diretta del PhMN sulle sezioni congelate del midollo spinale. CTB è solitamente descritto come un tracciante monosinaptica, anche se i dati sperimentali tendono a mostrare un transneuronal passaggio¹². CTB ha la capacità di legare il ganglioside GM1 alla membrana del plasma della terminazione nervosa. CTB è interiorizzato via clathrin-dipendente o - indipendente meccanismi e traffici attraverso la rete trans-Golgi nel reticolo endoplasmico in un modo retrogrado^13,14. L'interiorizzazione e trasporto retrogrado sembrano essere legate il citoscheletro di actina^15,16 , nonché sulla rete dei microtubuli¹⁷.

Per dimostrare l'utilità di CTB come tracciante retrogrado neuroanatomical diaframma-PhMN circuiti di etichettatura, CTB-fluoroforo è stato consegnato intrapleurally. CTB è stata amministrata usando due tecniche: quella prima comprendeva una laparotomia e iniezioni multiple di transdiaphragmatic; il secondo, meno invasivo, utilizzato un'iniezione unica transtoracica. Quattro giorni più tardi, con etichetta fluorescente PhMNs sono stati quantificati nel midollo spinale cervicale da entrambi da sano e da animali (C4) livello spinale-danneggiati.

Protocollo

Il protocollo sperimentale è stato condotto nel rispetto delle direttive del Consiglio delle Comunità europee per l'esperimento animale (2010/63/UE, 86/609/CEE e 87-848/CEE) ed è stato approvato da animale etica Comitato dell'Università di Namur (etica progetto n ° 17-284 ). Figura 1 raffigura i due rispettivi approcci: transdiaphragmatic o transtoracica iniezioni. Utilizzare i topi C57bl/6J maschii (n = 18), all'età da 3 a 4 mesi nello studio.

1. preparazione della soluzione CTB

1. Per le iniezioni di transdiaphragmatic:
   1. Sciogliere il potere CTB in acqua sterile alla concentrazione di 0,2% (w/v).
   2. Caricare 7,5 µ l di soluzione CTB (0,2% w/v) in un 10-µ l-microsiringa sterile con un ago attaccato 33-calibro (smusso smussato o breve) per ogni mouse.
2. Iniettabile transtoracica:
   1. Sciogliere il potere CTB in acqua sterile, alla concentrazione dello 0,1% (p/v).
   2. Carico 20 µ l di soluzione CTB (0,1% p/v) in una siringa sterile 500-µ l-insulina con un ago calibro 27 smussato per ogni mouse.
      Nota: Assicurarsi di utilizzare acqua distillata e sterile e correttamente sciogliere la polvere CTB. La soluzione può essere conservata a 4 ° C per un mese (non congelare). Dopo pochi giorni potrebbe formare un precipitato. Portare la soluzione a temperatura ambiente e mescolare bene usando una pipetta prima dell'uso.

2. preparazione prima del Intrapleural iniezioni

1. Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico, utilizzando sterilizzatore autoclave o perle di vetro. Preparare un cappotto di banco pulito per fare un intervento chirurgico e di disporre gli strumenti chirurgici.
   Nota: Qualsiasi materiale utilizzato durante la procedura chirurgica deve essere sterile. Strumenti che non possono essere sterilizzati come la microsiringa dovrebbe essere spazzato via giù con un disinfettante (clorexidina) o deve essere esclusivamente monouso. Il chirurgo dovrebbe lavare le sue mani con un disinfettante (clorexidina macchia) prima dell'inizio dell'intervento chirurgico. Il chirurgo deve indossare guanti sterili, una maschera facciale e un abito pulito.
2. Pesare l'animale e amministrare una dose adeguata di anestesia: l'iniezione intraperitoneale di anestetico cocktail (ad es. ketamina 100 mg/kg e xilazina 5 mg/kg).
3. Pizzicare la punta e/o verifica per la perdita del riflesso palpebrale per determinare se il mouse è adeguatamente anestetizzato. Applicare una pomata di IFP per proteggere la cornea.
4. Shave accuratamente la pelle ventrale (per la procedura di transdiaphragmatic) o la destra-parteggiata toracica pelle (per procedura transtoracica), utilizzando il tagliacapelli elettrico. Radersi bene e larghe abbastanza per evitare di entrare nel campo della chirurgia di capelli.
5. Garantire condizioni asettiche dall'applicazione topica di soluzione di iodio 10% sulla zona rasata. Strofinare il sito chirurgico con la soluzione di iodio, facendo attenzione a strofinare dal centro del sito verso la periferia.
6. Utilizzare un tampone omeotermi in tutta la chirurgia per mantenere la temperatura corporea dell'animale.

3. Intrapleural iniezioni con approccio Transdiaphragmatic

1. Fissare il mouse anestetizzato in posizione supina su una piastra elettrica. Posizionare una garza arrotolata sotto il collo dell'animale. Per un topo adulto, è necessario utilizzare un tampone di garza arrotolata di 0,5 pollici di spessore. Questo pad alla scheda di chirurgia per evitare movimenti se qualsiasi del nastro.
2. Usando un bisturi, incise la pelle ventrale lungo la linea mediana: fare un'incisione dal processo xifoideo nella regione ombelicale mentre si estende la pelle lateralmente con l'altra mano per rendere la pelle tesa. Non applicare troppa pressione sulla lama per evitare di danneggiare organi sottostanti.
3. Utilizzando le forbici piccole, attentamente staccare la pelle da muscoli addominali attorno all'incisione. Questa procedura aiuterà alle cuciture i muscoli e la pelle apart alla fine dell'intervento chirurgico.
4. Eseguire la laparotomia utilizzando piccole forbici. Aprire la cavità addominale eseguendo un'incisione di asola al livello dell'ombelico. Incidere i muscoli addominali lungo la linea bianca ("linea alba") fino al processo xifoideo.
5. Al fine di visualizzare la superficie addominale del diaframma, retrarre i muscoli addominali utilizzando divaricatori commerciale o fatti in casa.
   Nota: Questi divaricatori possono essere fatto da midi-formato clip di carta a forma di in L-gancio¹⁹.
6. Si estendono su entrambi i lati della laparotomia e nastro verso il basso i divaricatori per il cappotto di panca. Ottimizzare l'illuminazione del campo di vista in modo che la superficie addominale del diaframma non è più in penombra. Il più potente dispositivo di illuminazione per questo scopo è una lampada a LED con un fascio di luce orientabile.
7. Utilizzando pinzette morbide in una mano, sollevare l'appendice xyphoid e tirare giù i lobi laterali del fegato (Figura 2A). Utilizzando piccole forbici in altra mano, accuratamente tagliata il legamento sospensore, senza danneggiare la colecisti o il diaframma (Figura 2B).
8. Utilizzando pinzette morbide in una mano, sollevare l'appendice xyphoid. Afferrare la siringa Hamilton in altra mano. Tre siti di iniezione nel giusto hemidiaphragm a coprire rispettivamente sternale, mediale e le regioni crurale (Figura 3A, inserto in Figura 3B) di destinazione.
9. Come lo spessore del diaframma è di circa 0,37 mm in topi⁷, inserire l'ago non più di 1 o 2 mm oltre il foglio di diaframma per prevenire danni ai polmoni durante la respirazione. Fornire 2,5 µ l di soluzione CTB (0,2% w/v) attraverso il diaframma giusto in ogni sito (Figura 4B). Stabilizzazione del diaframma non è necessaria.
10. Ripetere questa procedura per i tre siti ipsilateral dell'iniezione (Figura 1A) e controlaterale per un'etichettatura bilaterale della piscina PhMN.
11. Per chiudere il sito di laparotomia, suturare i muscoli addominali con resorbable sutura 4-0. Uso interrotti punti distanziati di 3 mm. pelle fiocco chiuso con clip di 9,0 mm ferita. Serrare staples per impedire che animali tirando fuori staples. Spazio staples distanti circa 5 mm. Non serrare eccessivamente le clip di ferita, come questo può portare a guarigione alterata.
12. Pulire micro siringa con acqua distillata per evitare intasamenti. Lentamente, elaborare ed espellere 2 - 3 volte. Non aspirare aria nella siringa.

4. Intrapleural iniezione usando metodo Transthoracic

Nota: Questo metodo è ispirato alla procedura designata in ratti⁴ ed è stato adattato al mouse.

1. Fissare il mouse anestetizzato a sinistra posizione decubitus laterale, su un rilievo di riscaldamento (Figura 4A).
2. Identificare le costole di sesta e settima sotto alla piega del gomito tramite la palpazione manuale (Figura 4B).
3. Mentre un assistente si estende giusti ribalta - e -arti posteriori (Figura 5A), inserire la siringa cranialmente orientata e tangenzialmente sotto la sesta o settima costola, 3 mm di profondità della pelle, con lo smusso verso il basso (Figura 1B e figura 5B).
4. Elevare l'ago delicatamente per confermare, sollevando le costole, che è ben posizionato nella cavità toracica (Figura 5, inserti in Figura 1B).
5. Stabilizzare i movimenti del torace di respirazione di esercitando una leggera pressione con due dita sulla parete di cassa.
6. Tenendo la siringa in altra mano, consegnare 20 µ l di soluzione CTB (0,1% p/v) in una singola iniezione.

5. post-operatorio

1. Immediatamente dopo la procedura, posare il mouse nella posizione decubitus laterale di destra su un pad omeotermi per il recupero. Questo assicura il tracciante per diffondere sul lato destro della cavità pleurica e permette di monitorare la respirazione dell'animale.
2. Somministrare per via sottocutanea 1 mL di soluzione salina sterile i.p.. Se l'animale appare disidratata e/o svogliata, fornire iniezioni di follow-up.
3. Somministrare per via sottocutanea 0,1 mg/kg della buprenorfina, due volte al giorno durante il primo post-ambulatorio due giorni, per ridurre al minimo qualsiasi potenziale dolore.
   Nota: Molte istituzioni consiglierei analgesia multimodale per procedure invasive, come la laparotomia qui raffigurati. Questo potrebbe includere l'uso di un non-steroidei anti-infiammatori (FANS) e/o un agente anestetico locale al sito di incisione. Questi farmaci vengono solitamente consegnati prima della prima incisione per ridurre al minimo dolore Wind-up.
4. Monitorare gli animali al giorno fino a eutanasia.

Risultati

I topi C57bl/6J maschii (n = 18), età da 3 a 4 mesi sono stati inclusi nello studio. Al giorno 0 dell'esperimento, 8 topi ha subito una contusione C4 unilaterale, destra-parteggiata, secondo protocollo pubblicato^7,18. Come procedura sham, 10 topi ha subito un laminectomy sopra C4 senza contusione. Al giorno 3, topi sono stati preparati per le iniezioni di intrapleurica di CTB-fluoroforo secondo le due diverse procedure sopra desc...

Discussione

Il protocollo descritto nel presente documento può essere applicato a qualsiasi ceppo di topi adulti o a qualsiasi paradigma sperimentale in cui l'integrità della circuiteria diaframma-PhMN dovrebbe essere valutato. Per esempio, sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e lesioni del midollo spinale cervicale (cSCI) sono condizioni associate alla perdita di PhMN, anterograda degenerazione degli assoni frenici e successivo compromesso respiratorio. Modelli animali di ALS o cSCI imitano istopatologico e funzionale respiratorio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm