La microscopia basato su metodi per la valutazione della migrazione delle cellule epiteliali durante In Vitro la guarigione arrotolata

Riepilogo

Questo manoscritto descrive come incisione-come le lesioni fatta su monostrati di cellule epiteliali in coltura convenientemente modello ferita curativa in vitro, che consente per l'imaging di confocal o microscopia di esame del laser, e che in grado di fornire alta qualità dati quantitativi e qualitativi per studiare il comportamento delle cellule sia i meccanismi coinvolti nella migrazione.

Abstract

Migrazione delle cellule è un aspetto obbligatorio per la guarigione della ferita. Creazione artificiale ferite su modelli animali di ricerca spesso risultati in costose e complicate procedure sperimentali, mentre potenzialmente manca di precisione. Coltura in vitro di linee cellulari epiteliali fornisce una piattaforma adatta per la ricerca il comportamento migratorio delle cellule nella guarigione delle ferite e l'impatto dei trattamenti su queste cellule. La fisiologia delle cellule epiteliali è spesso studiata in condizioni di non-confluenti; Tuttavia, questo approccio non analoghe condizioni di guarigione naturale. Compromettere l'integrità dell'epitelio con mezzi meccanici genera un modello realistico, ma può ostacolare l'applicazione delle tecniche molecolari. Di conseguenza, tecniche di microscopia di base sono ottimali per lo studio della migrazione delle cellule epiteliali in vitro. Qui dettagliamo due metodi specifici, il dosaggio di gratta e Vinci di ferita artificiale e analisi anteriore della migrazione artificiale, che può ottenere dati quantitativi e qualitativi, rispettivamente, sulle prestazioni migratoria delle cellule epiteliali.

Introduzione

Migrazione delle cellule è necessaria per la guarigione delle ferite, come è responsabile per la chiusura definitiva del divario epiteliale e restauro del perturbato superficie¹. L'esecuzione di ferite artificiali nei modelli animali consente per la replica di questo complesso processo in vicino a condizioni fisiologiche². Tuttavia, questo approccio comporta spesso costose e complicate procedure sperimentali, che potenzialmente mancano di precisione per lo studio di processi distinti, a causa della natura complessa del processo di guarigione.

Coltura in vitro di linee cellulari epiteliali fornisce un'utile alternativa ai modelli animali per la ricerca il ruolo che queste cellule svolgono nella guarigione della ferita e gli effetti del trattamento su comportamento migratore delle cellule. La fisiologia delle cellule epiteliali è spesso studiata mediante tecniche molecolari utilizzando colture non-confluenti^3,4,5,6; Tuttavia, la rottura dell'integrità dell'epitelio viene solitamente ottenuta da fini incisioni meccaniche. Nella coltura cellulare, questo implica che trascurabile numero di cellule può essere esposti al divario di ferita, e che rappresentano un campione troppo piccolo per tecniche di biologia molecolare. Tuttavia, queste lesioni possono essere studiate su scala microscopica, sfruttando le proprietà innate migratori di alcune linee cellulari epiteliali, come il visone epiteliali del polmone delle cellule (Mv1Lu) o la cella spontaneamente immortalizzate dei cheratinociti umani (HaCaT) linee.

Qui abbiamo descritto un metodo per microscopia che è adatto per ottenere dati quantitativi sulla migrazione delle cellule epiteliali nel contesto della cicatrizzazione^3,4,7,8. Inoltre, vi presentiamo ulteriori metodi che sono utili per studiare i cambiamenti qualitativamente morfologiche e molecolari che si verificano su monostrati epiteliali durante la migrazione. Nel complesso, questi metodi forniscono un quadro per studiare la dinamica e il cambiamenti morfologici coinvolti con il comportamento delle cellule epiteliali e la risposta ai trattamenti durante la guarigione della ferita.

Protocollo

1. artificiale ferita Scratch test per studi quantitativi

1. Preparazione dello strato monomolecolare delle cellule
   1. Lavorando in condizioni sterili, di semi e far crescere cellule epiteliali Mv1Lu o HaCaT in matracci di cultura utilizzando medium siero-completato. Aggiornamento media una volta ogni 24-48 h. Dopo le cellule raggiungono 80% confluenza, staccare le cellule utilizzando un metodo appropriato, cioè, trypsinization⁹.
      Nota: Mv1Lu e HaCaT linee cellulari epiteliali sono coltivate utilizzando il terreno di coltura EMEM e DEMEM, rispettivamente, completati con 2 mM L-Glutammina e incubate a 37 ° C con atmosfera controllata di 5% CO₂. Ogni linea cellulare deve essere accuratamente analizzato per determinare la concentrazione delle cellule e la tempistica necessaria per raggiungere confluency di completo. In genere per Mv1Lu le cellule HaCaT, 2-4 x 10⁴ o 4-6 x 10⁴ cellule/pozzetto, rispettivamente, sono seminati in un matraccio di cultura di 175 cm² , e all'80% confluenza rendimenti fino a 35 x 10⁶ Mv1Lu o 1 x 10⁷ cellule di HaCaT.
   2. In entrambi una piastra di coltura 12-pozzetti o 24 pozzetti, semi in ciascun pozzetto 2 mL di cellule. Aggiornare media una volta ogni 24-48 h. Assicurarsi che i numeri delle cellule sono abbastanza in alto per raggiungere la confluenza del 100% dopo 2 o 3 giorni.
   3. Dopo che le cellule raggiungono la confluenza, rimuovere il medium siero-completato e lavare due volte con medium privo di siero fresco. Mantenere le cellule in medium senza siero per 24 h prima il graffio.
      Nota: Le cellule Mv1Lu o HaCaT non hanno requisiti substrato speciale; Tuttavia, per linee cellulari sensibili allo scollegamento spontaneamente in circostanze senza siero, pre-rivestimento di superficie della piastra di coltura utilizzando una soluzione di poli-L-lisina dovrebbe essere considerato¹⁰.
2. Monostrato graffiare
   1. Lavora in un ambiente sterile, scratch il monostrato di cultura trascinando saldamente l'estremità sottile di un 20 µ l o suggerimento di micropipetta sterile µ l 200, a seconda della larghezza desiderata di gratta e Vinci. Tenere la punta perpendicolare alla superficie di cultura per massimizzare l'omogeneità di gap.
      1. Posizionare le piastre di coltura sopra una superficie scura per monitorare chiaramente strato monomolecolare della cellula. Se necessario, è possibile eseguire due graffi perpendicolare (a forma di croce) su ciascun pozzetto per studiare fino a 4 aree di migrazione.
   2. Lavare le cellule indipendente rimuovendo delicatamente il terreno di coltura e delicatamente aggiungendo medium privo di siero fresco. Ripetere due volte, o fino a quando non sono state rimosse la maggior parte delle cellule non collegate.
3. Raccolta di dati e procedura sperimentale
   1. Prendere fino a 4 immagini di riferimento pre-trattamento centrati sul divario gratta e Vinci da ogni pozzetto usando un microscopio a contrasto di fase invertita che incorpora una telecamera CCD. Selezionare le aree di interesse allineando il bordo del campo del microscopio fino all'incrocio adiacente di graffi.
      Nota: In genere, le immagini vengono acquisite utilizzando un ingrandimento di 10x e una dimensione di immagine di 1.280 x 1.024 pixel. Selezione di aree di interesse come descritto in precedenza aiuta per la facile localizzazione e convalida di fino a 4 misurazioni per pozzetto.
   2. Una volta che tutte le immagini sono acquisite, designare pozzi di trattamento; scambiare il mezzo nei pozzetti con medium fresco che contiene trattamenti selezionati.
      Nota: In alternativa, prodotti chimici o di composti che non disturbare omogeneità del terreno di coltura, trattamenti possono essere inoculati direttamente nel terreno di coltura.
   3. Incubare la piastra graffiata (37 ° C con atmosfera controllata che contiene 5% CO₂) fino a quando le condizioni di osservazione portata 90% divario gratta e Vinci di chiusura. Evitare la chiusura completa.
      Nota: Chiusura totale gap Annulla raccolta foto post-trattamento come aree di riferimento non sono rilevabili e non è possibile stabilire il riferimento temporale per la chiusura del divario. Nel caso di Mv1Lu le cellule HaCaT, 16-19 h sono necessari per raggiungere la confluenza del 90%.
   4. Interrompere la migrazione cellulare fissando le cellule; delicatamente e sostituire il terreno di coltura sperimentale con 1 mL di formalina 4% in PBS. Incubare per 15 minuti a TA.
   5. Lavare le cellule per rimuovere l'eccesso formalina; sostituire delicatamente la soluzione nei pozzetti con PBS fresco. Ripetere almeno due volte.
      Nota: In questa fase, dopo la sigillatura, piastre possono essere memorizzati a 4 ° C a tempo indeterminato.
   6. Prendere le immagini di riferimento post-trattamento dei pozzetti delle aree di riferimento originale catturato dopo graffiare. Utilizzare la stessa attrezzatura (microscopio a contrasto di fase ottico invertito che incorpora una telecamera CCD) e corrispondenti impostazioni immagine (ingrandimento e risoluzione digitale/densità).
      Nota: Per le cellule che migrano singolarmente e colmare il divario indipendentemente dalla formazione di un fronte coerente (ad es., cellule umane di cancro al seno MDA-MB-231), le immagini di corso di tempo possono permettere il calcolo della velocità di migrazione delle cellule individuali.
4. Analisi dell'immagine e la quantificazione delle migrazioni
   1. Utilizzando software (ad es., ImageJ) elaborazione delle immagini, definire i limiti del divario di gratta e Vinci e determinare la superficie di gap per fino a quattro misure in immagini di pre-trattamento. Registrare i dati come "superficie di pre-trattamento gap" (PREGAP). Ripetere la stessa procedura per le immagini di post-trattamento. Registrare i dati come "superficie di post-trattamento gap" (POSTGAP).
      1. Aprire l'immagine registrata usando ImageJ. Nel menu "immagine", impostare il tipo di immagine a 8 bit. Nel menu "processo", vai al sottomenu di "filtri" e applicare il filtro "varianza".
      2. Nel menu "immagine", immettere "regolare" sottomenu e soglia impostata in bianco e nero (B & W), assicurarsi che "Dark background" non è selezionata. Nel menu "processo", accedere al sottomenù "binario" e selezionare "riempire i buchi".
      3. Nel menu "analizzare", selezionare "set di misure" e attivare "area". Quindi disegnare l'area misurabile seguendo il profilo di bordo migrazione così che delimita il divario.
      4. Nel menu "analizzare", seleziona "analizza le particelle" e registrare valori di "superficie totale" per la superficie di area disegnata.
   2. Introdurre i valori di area totale PREGAP e POSTGAP in un foglio di calcolo per quantificare la migrazione assoluta per ogni set di campioni individuali come la differenza di misure superficie gap: PREGAP − POSTGAP [unità arbitrarie]. Inoltre, normalizzare i dati migrazione assoluta di ciascuna condizione di campioni di controllo: (campione / controllo) * 100 [%].
      Nota: Per le cellule che migrano singolarmente e colmare il divario indipendentemente dalla formazione di un fronte coerente, (ad es., cellule umane di cancro al seno MDA-MB-231), la migrazione assoluta può essere calcolata contando le cellule che invadono una centrale striscia sia in il controllo o i campioni trattati.
   3. Trama quantificazione uscite (Vedi Figura 1). Se necessario, effettuare analisi statistiche.

Quando si confrontano due condizioni o test di analisi della varianza per maggior numero di condizioni, prendere in considerazione test t di Student.

2. artificiale migrazione anteriore analisi per studi topografici

1. Preparazione dello strato monomolecolare delle cellule
   1. Posto di lavoro in condizioni sterili, uno strato di lamelle rotonde sterilizzate in piastre di coltura vuoto fino a coperta completamente la superficie della piastra.
      Nota: Fino a 12 e 33 coprioggetti montare su 5 cm e 10 cm Diametro piastre, rispettivamente.
   2. Sulla piastra di coltura, delicatamente seme un adeguato volume di cellule ad una concentrazione che consente il 100% confluenza dopo 2 o 3 giorni. Assicurarsi che nessun vetrino coprioggetti si sovrappone coprioggetti vicini e impedire che coprioggetti galleggianti applicando pressione delicata con una punta di una micropipetta sterile. Aggiornare il mezzo ogni 24-48 h.
      Nota: Ogni linea cellulare dovrà essere analizzato accuratamente per determinare la concentrazione delle cellule e la tempistica necessaria per raggiungere confluency di completo. In genere per Mv1Lu le cellule HaCaT, 2-3 x 10⁶ o 2.5-4 x 10 piastra⁶ cellule/10 cm di diametro, rispettivamente, sono seminati. Per piatti più piccoli, numeri di cellulare devono essere ridimensionati.
   3. Dopo che le cellule raggiungono la confluenza, rimuovere il medium siero-completato e sostituirli con medium privo di siero fresco. Mantenere le cellule in medium senza siero per 24 h prima che venga eseguita la ferita artificiale.
      Nota: Le cellule Mv1Lu o HaCaT non hanno requisiti substrato speciale; Tuttavia, per linee cellulari suscettibili di scollegamento spontaneamente in circostanze senza siero, pre-rivestimento della superficie cultura utilizzando una soluzione di poli-L-lisina dovrebbe essere considerato¹⁰.
2. Ferendo monostrato
   1. Con pinzette sterili, spostare delicatamente un vetrino coprioggetto un piatto pulito 10 cm contenente terreno privo di siero fresco. Evitare di danneggiare il monostrato tenendo il vetrino coprioggetto alla periferia con una pinzetta. Evitare una pressione eccessiva che potrebbe causarne la rottura del vetrino coprioggetti.
   2. Creare ferite artificiali trascinando una lama di rasoio sterilizzata in una linea trasversale sopra il centro di lamelle. Trascina avanti e indietro, 3-4 mm al fine di rimuovere completamente la striscia centrale dello strato monomolecolare. Assicurarsi che nessun detriti cellulari rimangono attaccata ai bordi feriti.
      Nota: su un diametro di 12 mm tondo vetrino coprioggetti, l'incisione è fatta presso la metà del coprivetrino. Assicurarsi di lasciare una striscia di cellule di fronte alla facciata principale abbastanza grande (almeno 2 mm di larghezza) per evitare il ribaltamento del coprivetrino nei passaggi seguenti.
   3. Trasferimento coprioggetti feriti con le cellule rivolto verso l'alto, per un pulito 6 pozzetti contenenti almeno 2 mL fresco medium senza siero. Montare fino a 4 lamelle/pozzetto feriti.
   4. Lavare delicatamente due volte utilizzando prodotti freschi medium senza siero per rimuovere le cellule indipendente.
3. Campionamento e procedura sperimentale
   1. Delicatamente e scambiare il mezzo nei pozzetti con medium fresco che contiene trattamenti selezionati.
      Nota: In alternativa, prodotti chimici o di composti che non disturbare omogeneità del terreno di coltura, trattamenti possono essere inoculati direttamente nel terreno di coltura. Procedere con cautela per evitare qualsiasi potenziale distacco cellulare.
   2. Tenere la piastra all'interno di un'incubatrice di cellulare (37 ° C, 5% CO₂) per l'intervallo di tempo desiderato sperimentale.
   3. Interrompere la migrazione cellulare fissando le cellule; delicatamente e sostituire il terreno di coltura sperimentale con 1 mL di formalina 4% in PBS. Incubare per 15 minuti a TA.
      Nota: Per ora corso esperimenti, rimuovere i campioni dalla piastra di coltura e fissarli in una piastra separata per evitare vapori di formalina che interessano le condizioni sperimentali di altre, in corso.
   4. Lavare le cellule per rimuovere l'eccesso formalina; sostituire delicatamente la soluzione nei pozzetti con PBS fresco. Ripetere almeno due volte.
      Nota: In questa fase, dopo la sigillatura, piastre possono essere memorizzati a 4 ° C a tempo indeterminato.
4. Immunofluorescenza (IF) e analisi topologica
   1. Eseguire se macchiatura e imaging su vetrini coprioggetti individuali come descritto altrove^3,4,11.
      1. Permeabilize per 10 min immergendo le lamelle in una soluzione di Triton X-100 0,3% in PBS.
      2. Blocco per 30 min, utilizzando la seguente soluzione bloccante: 0,3% albumina di siero bovino; 10% di siero fetale bovino; 5% di latte scremato; 0,3 soluzione di Triton X-100% in PBS.
         Nota: Soluzione senza latte di blocco può essere preparato in anticipo e conservato a-20 ° C.
      3. Incubare per 1 h a temperatura ambiente all'interno di una camera umida, con l'anticorpo primario diluito in latte-libera soluzione bloccante. Posizionare i vetrini coprioggetti capovolto, nel 15 µ l di soluzione di anticorpo per assicurare la corretta distribuzione.
         Nota: La diluizione di lavoro dell'anticorpo è variabile e dipende l'anticorpo in uso. Ad esempio, l'anticorpo di coniglio anti-c-Jun richiede una diluizione 1/100.
      4. Lavare tre volte immergendo i coprioggetti in una soluzione di Triton X-100 in 0,1% in PBS.
      5. Incubare i vetrini coprioggetti in anticorpo secondario diluito in tampone bloccante senza latte per 30 min.
         Nota: La diluizione di lavoro dell'anticorpo è variabile e dipende l'anticorpo in uso. Ad esempio, la capra-anti-Rabbit (488) richiede una diluizione di 1/400 per risoluzione ottimale. Altri reagenti d'etichettatura come falloidina e Hoechst 33258 possono essere aggiunti al buffer di incubazione in questa fase.
      6. Lavare tre volte immergendo i coprioggetti in soluzione di Triton X-100 0,1% in PBS.
      7. Montare i vetrini coprioggetti capovolto in un 10 µ l montaggio supporti goccia (ad es., Vectashield) posto su un vetrino da microscopio. Lasciare le diapositive al buio a temperatura ambiente durante la notte per l'indurimento di medie di montaggio. In seguito, di conservare a 4 ° C al buio a tempo indeterminato.
   2. Ottenere epifluorescenza o immagini di microscopia confocal di cambiamenti strutturali che si verificano al bordo anteriore la migrazione.
      Nota: Studi topologici possono essere eseguiti da affiancamento immagini dalla parte anteriore la migrazione per l'interno dello strato monomolecolare. Gli studi semi-quantitativi sono possibili mediante analisi di software basato sulle intensità di fluorescenza locale.

Risultati

Il dosaggio zero ferita artificiale per studi quantitativi: valutazione del fattore di crescita epidermico (EGF) Promozione della migrazione:

L'EGF è un ben noto induttore della proliferazione di cellule epiteliali e migrazione e così un controllo positivo per quantificare la promozione di migrazione. Monostrati di cellule umane Mv1Lu e HaCaT sono stati utilizzati nelle analisi gratta e Vinci della ferita e immagini di pre-tratta...

Discussione

Alla pelle o rottura della membrana mucosa, la funzione della barriera viene ripristinata dalle azioni di numerosi tipi di cellule, tra cui fibroblasti o cellule epiteliali ed immuni. Congiuntamente, queste cellule subiscono un complesso processo che coinvolge l'apoptosi, proliferazione, differenziazione e soprattutto, dei fibroblasti ed epiteliale delle cellule migrazione, che è il meccanismo ultimo responsabile per il restauro del tessuto perturbato e la chiusura del divario epiteliale superficiale^1<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, France	L0102-500	Optional 10 % FBS supplement
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	Optional 10 % FBS supplement
L-Glutamine	Lonza	BE17-605E	Use at 2 mM
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA	DE17603A
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T4049	Dilute as appropriate
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	P9155
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)	Gibco by Life Technologies	14200-067	Dilute to 1x
24-well culture plates	BD FALCON//SARSTED	734-0020
6-well culture plates	SARSTEDT	83-3920
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	E9644	Used 10 ng/mL
Round cover glass	MENZEL-GLÄSER	MENZCB00120RA020	SHORT DEPTH OF FIELD
Reinforced razor blade no. 743	Martor (through VWR)	MARO743.50
200 µl sterile aerosol pipet tips	VWR	732-0541
20 µl sterile aerosol pipet tips	VWR	732-0528
Digital camera coupled phase contrast microscope	Motic Spain	Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Confocal microscope	ZEISS Microimaging, Germany	LSM 510 META
10 cm Culture dish	BD FALCON	353003
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	Used 1:100
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488	Invitrogen	A11008	Used 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	Used 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)	Invitrogen	A12381	Used 1:100
Bovine Serum Albumin	Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
Skim milk	BD DIFCO	232100
ImageJ	National Institutes of Health, USA	Release 1.50i
Zen LSM 510 image processing software	ZEISS Microimaging, Germany	Release 5.0 SP 1.1