Protocollo sperimentale per il rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti esposti ai pesticidi organoclorina

Riepilogo

Comprendere l'influenza dei pesticidi organoclori ambientali (OC) sulla funzione mitocondriale negli epariti è importante per esplorare il meccanismo degli OC Che causano disturbi metabolici. Questo documento presenta metodi dettagliati per rilevare la funzione mitocondriale epatico.

Abstract

Questo documento presenta metodi dettagliati per rilevare la funzione mitocondriale epatico per comprendere meglio la causa dei disturbi metabolici causati dai pesticidi organoclori ambientali (OOC) negli epatociti. Le cellule di HepG2 sono state esposte β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) per 24 h ad una dose equivalente di esposizione interna nella popolazione generale. L'ultrastruttura negli eparociti è stata esaminata dalla microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per mostrare il danno dei mitocondri. La funzione mitocondriale è stata ulteriormente valutata dall'intensità della fluorescenza mitocondriale, dai livelli di adenosina 5'-triphosphate (ATP), dal tasso di consumo di ossigeno (OCR) e dal potenziale della membrana mitocondriale (MMP) nelle cellule HepG2 incubate con β-HCH. L'intensità della fluorescenza dei mitocondri dopo essere stata osservata con una microscopia a fluorescenza verde mitocondriale è stata osservata con una microscopia a fluorescenza. La reazione luciferina-luciferasi è stata utilizzata per determinare i livelli ATP. L'MMP è stato rilevato dal colorante cationico JC-1 e analizzato sotto la citometria di flusso. L'OCR è stato misurato con un analizzatore di flusso extracellulare. In sintesi, questi protocolli sono stati utilizzati nel rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti con per indagare sui danni dei mitocondri.

Introduzione

Gli effetti dei pesticidi organoclori (OC) sulla salute, ad esempio l'interferenza riproduttiva, la tossicità immunologica, i cambiamenti metabolici sono stati precedentemente^{studiati 1,2,3}. I metodi per rilevare il metabolismo cellulare e scoprire la disfunzione mitocondriale hanno permesso agli scienziati di comprendere il ruolo della funzionemitocondriale (cioè., livelli di STAT3 mitocondriale, lattato, piruvato, rapporto lattato-piruvate, coenzime Q10, perdita di protono mitocondriale, bioenergetica, biogenesi e dinamica) in aree come l'invecchiamento, l'obesità, il diabete, la funzione cardiovascolare, il cancro e la tossicità di sicurezza^4,5,6,7. In questo articolo, descriviamo i metodi per valutare la disfunzione mitocondriale causata da OCP.

Abbiamo esposto le cellule DiPG2 a β-esachlorocyclohexane (β-HCH), un OCP rappresentativo, per 24 h ad una dose equivalente all'esposizione interna dell'uomo. In primo luogo, TEM è stato applicato per osservare l'ultrastruttura degli epariti, come nuclei, mitocondri e endoplasmice reticulum⁸. Rispetto ai normali microscopi, TEM consente di esplorare l'ultrastruttura 2D e 3D di cellule e componenti cellulari (linee cellulari o tessuti), la morfologia, la composizione chimica, nonché la funzione di materiali naturali o artificiali che svolgono un ruolo fondamentale nella scienza e nella tecnologia moderne. La funzione mitocondriale è stata ulteriormente valutata dall'intensità della fluorescenza mitocondriale, dai livelli di adenosina 5'-triphosphate (ATP), dal tasso di consumo di ossigeno (OCR) e dal potenziale di membrana mitocondriale (MMP)nelle cellule HepG2 incubate con β-HCH. Mito-tracker green è una sonda fluorescente verde mitocondri che può essere utilizzata per la colorazione fluorescente specifica mitocondriale a cellule vive. I mitocondri negli eparociti sono stati macchiati da soluzione verde mito-tracker e intensità di fluorescenza mitocondriale, numero e modello sono stati osservati con una microscopia confocale⁹. La sonda fluorescente verde mitocondriale può essere utilizzata per macchiare le cellule vive. Rispetto alla rodamina 123 o JC-1, la sonda fluorescente verde mitocondriale non dipende dal potenziale di membrana mitocondriale per la colorazione mitocondriale. I livelli di ATP sono stati determinati da un kit luciferasi-luciferina e normalizzati dalla concentrazione di proteine. Kit di analisi ATP può essere utilizzato per rilevare i livelli di ATP in soluzioni comuni, cellule o tessuti. Questo kit si basa sulla luciferasi luccilice catalizzato dalla fluoresina per generare fluorescenza, quando l'ATP è necessario per fornire energia. Quando la luccilice luciferasi e la fluoresina sono eccessive, in un certo intervallo di concentrazione, la generazione di fluorescenza è proporzionale alla concentrazione di ATP. Inoltre, questo kit è stato appositamente progettato per ottimizzare la chemiluminescenza di ATP. L'ATP, come le molecole energetiche più importanti, svolge un ruolo importante nei vari processi fisiologici o patologici delle cellule. I cambiamenti nei livelli ATP possono riflettere i difetti nella funzione cellulare, in particolare la produzione di energia mitocondriale. Di solito sotto apoptosi, necrosi o in qualche stato tossico, i livelli di ATP cellulare ridotto ¹⁰. Il kit di analisi MMPs con JC-1 è un kit che utilizza JC-1 come sonda fluorescente per rilevare cellule, tessuti o MMP purificati in modo rapido e sensibile. Può essere utilizzato per la diagnosi precoce di apoptosi. Il colorante cationico JC-1 è una sonda fluorescente utilizzata per rilevare l'MMP che può essere analizzata sotto la citometria di flusso indicata dai cambiamenti del rapporto di fluorescenza verde e rossa. Quando l'MMP è alto, JC-1 viene aggregato nella matrice dei mitocondri per formare un polimero (J-aggregati), che produce fluorescenza rossa. Quando l'MMP è basso, JC-1 non può accumularsi e forma monomero che produce fluorescenza verde¹¹. Quindi il rapporto tra fluorescenza rossa e verde può riflettere il livello di MMP. L'OCR delle cellule è un indicatore cruciale della normale funzione cellulare¹². È considerato come un parametro per la ricerca della funzione mitocondriale. Cell mito stress test kit fornisce un metodo stabile per l'analisi dei parametri chiave della funzione mitocondriale. Il kit fornisce il controllo di qualità e reagenti predittivi, nonché un metodo standard per l'esecuzione di test di stress mitocondriale cellulare. Può essere utilizzato per rilevare tutti i tipi di cellule, comprese le cellule primarie, linee cellulari, cellule sospese, e anche per isolotti, nematodi, lieviti e mitocondri isolati.

La misurazione OCR può fornire preziose informazioni sullo stato fisiologico o sulle alterazioni delle cellule. È stato determinato con un analizzatore di flusso extracellulare per rilevare la linea di base respiratoria, la perdita di protoni, il massimo respiratorio, il turnover ATP e la capacità di riserva. In breve, dopo le misurazioni di base di OCR, OCR è stato rilevato dopo l'aggiunta sequenziale a oligomicina (ATP Coupler), FCCP (fosforilazione ossidativa mitocondriale) per pozzo.

Nel tentativo di facilitare lo sviluppo di un protocollo più specifico per rilevare la funzione mitocondriale negli eparociti in vitro, presentiamo qui esperimenti di TEM, microscopia confocale, luminometro, citometria di flusso e analizzatore di flusso extracellulare con futura applicazione nello studio dei danni ai mitocondri relativi agli esiti avversi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti e i protocolli dell'esperimento sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti e approvati dal Comitato Etico locale dell'Università di Medicina di Nanjing.

1. Ultrastruttura mitocondriale di TEM

1. Raccolta di celle HepG2
   1. Seme Cellule HepG2 in piatti da 100 mm. Conservare a 37 gradi centigradi e 5% CO₂.
   2. Digerire le cellule con 0,25% EDTA in tubo 1,5 mLEP.
   3. Centrifuga a 1000 x g per 3 min a temperatura ambiente (RT). Scarta il supernatant.
   4. Raccogli 4-6 x 10⁵ cellule HepG2.
2. Aggiungere 1 mL di glutaraldeide del 5% (Solvente: acqua doppia distillata) con pipette e incubare a 4oC per 2 h.
3. Aggiungere e lavare in 4 cambi di 1 mL di tampone fosfato (contenente Na₂HPO₄, KH₂PO₄, NaCl e KCl, pH 7.4), 15 min ciascuno. Succhiare tampone di fosfato con pipette.
4. Aggiungere 200 m di osmio dell'1% (Solvente: acqua doppia distillata) e incubare a 4 s per 2 h al campione nero.
   Attenzione: L'osmio è una sostanza altamente tossica e volatile. Dovrebbe essere operato con attenzione nell'armadietto della droga.
5. Aggiungere e lavare in 2 cambi di 1 mL di tampone di fosfato, 5 min ciascuno. Succhiare tampone di fosfato.
6. Macchia nella soluzione di acetato di uranil al 2% (Solvente: acqua doppia distillata e acido acetico) in tubo EP da 1,5 mL per 2 h.
7. Disidratare e immergere attraverso il 50% di acetone, 70% acetone, 90% di acetone (Solvente: doppia acqua distillata), 2 cambi di acetone assoluto, 15 min ciascuno.
8. Penetrare in 2 gocce di acetone (100%)/agente di incorporamento (1:1) per 1,5 h a RT. Epon812 agente di incorporamento, la ricetta è la seguente: A: Epon812, 62 mL e DDSA, 100 mL; B: Epon812, 100 mL e MNA 89 mL. A:B-2:8 (v:v, in inverno), A:B'1:9 (v:v, in estate). Incorporamento in stampi di incorporamento (piastra di plastica morbida con griglia a scacchi).
9. Incubare in sequenza a 37 gradi centigradi per 12 h, 45 gradi centigradi per 12 h, e poi 60 gradi per 48 h.
10. Preparare e osservare le sezioni ultrasossine (l'area più grande non può superare 0,5 mm e 0,3 mm) con la macchina delle sezioni ultrasossive e TEM (2 m e 500 nm).

2. Rilevamento dell'intensità della fluorescenza mitocondriale

1. Seme 2x 10⁴ Cellule HepG2 in piastre a 6 well. Aggiungere β-HCH per 24 h.
2. Aggiungere un DMSO anidrosio per formulare una concentrazione finale di sonda fluorescente verde mitocondriale da 1 mM.
3. Aggiungere la soluzione di sonda fluorescente verde mitocondriale 1 mL (concentrazione finale: 200 nM) ad ogni pozzo di piastre da 6 pozzetti, incubare a 37 gradi centigradi per 45 min.
4. Rimuovere la soluzione della sonda fluorescente verde mitocondriale e aggiungere il mezzo di coltura cellulare (DMEM) appena preparato a 37 gradi centigradi prima dell'imaging.
5. Osservare la fluorescenza verde mitocondriale con un microscopio a fluorescenza (10x). La lunghezza d'onda massima di eccitazione al rilevamento è di 490 nm e la lunghezza d'onda massima di emissione è di 516 nm.

3. Analisi dei livelli ATP cellulari

1. Seme Cellule HepG2 in piastre 6-pozzo. Aggiungere β-HCH per 24 h.
2. Aggiungere 200 tamponi di lysis dal kit di analisi ATP lucifera-luciferin ad ogni pozzo di piastre a 6 gradi. Centrifuga a 12.000 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, raccogliere il supernante con le pipette in nuovi tubi.
3. Diluire il reagente di rilevamento ATP con la diluizione ATP con un rapporto di 1: 5, come buffer di rilevamento ATP.
4. Preparare la determinazione della curva standard: diluire 0,5 mM della soluzione standard ATP a 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01 M dai buffer di lysi ATP.
5. Aggiungere 100 L di buffer di rilevamento ATP in una piastra da 96 pozzetti per 5 min a RT, e aggiungere 100 L di supernatant della cellula, rilevate da un luminometro (rilevatore di chemiluminescenza). Calcolare la concentrazione ATP (nmol/L) attraverso la curva standard.
6. Rileva la concentrazione proteica da un kit di analisi delle proteine BCA con lettore multimodo.
   1. Preparazione della determinazione della curva standard: diluire il 5 mg/mL della soluzione standard proteica a 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 e 0,5 mg/mL con acqua doppia distillata.
   2. Aggiungere 1 L di supernatant di cellule in una piastra da 96 po 'e aggiungere 19 L di acqua doppia distillata.
   3. Aggiungere 200 soluzioni di rilevamento BCA per ogni pozzo. Incubate a 37 gradi centigradi per 30 min. Rilevare il valore OD (densità ottica) da un lettore multimodo con 562 nm. Calcolare la concentrazione di proteine (mg/mL) attraverso la curva standard.
7. Correggere il contenuto ATP per concentrazione di proteina mg (unità: concentrazione ATP/concentrazione proteica, nmol/mg).

4. Valutazione del potenziale della membrana mitocondriale (MMP) da parte di JC-1

1. Raccogliere le cellule HepG2 semitesse in piastre di 6 pozzo. Digerire le cellule con 0,25% EDTA nel tubo EP da 1,5 mL, centrifugare a 1000 x g per 3 min, scartare il supernante e raccogliere le cellule.
2. Aggiungere 50 L di JC-1 (200X) a 8 mL di acqua distillata al vortice e mescolare. Aggiungere 2 mL di buffer di colorazione delle macchie JC-1 (5X) come soluzione di rilevamento JC-1.
3. Incubare le cellule con una miscela di 0,5 mL di coltura cellulare media e 0,5 mL di soluzione di rilevamento JC-1 per 20 min a 37 gradi centigradi.
4. Centrifuga a 600 x g per 3 min a 4 gradi centigradi. Scarta il supernatant.
5. Risciacquare in 2 cambi di 1 mL di tampone di tintura JC-1 (1X), centrifuga a 600 x g per 3 min a 4 gradi centigradi. E scartare il supernante.
6. Sospendere le cellule in 0,5 mL di buffer di tintura JC-1 (1X), analizzare tramite citometria di flusso per rilevare la fluorescenza verde e rossa. Quando viene rilevato il polimero JC-1, impostare la luce di eccitazione su 490 nm e la luce di emissione su 530 nm. Quando viene rilevato il polimero JC-1, impostare la luce di eccitazione su 525 nm e la luce di emissione su 590 nm.

5. Misure dei tassi di consumo di ossigeno (OCR)

1. Seme cellule HepG2 in microplacchi di coltura cellulare di 96-pozzo ad una densità di 4500 cellule / 100 L per pozzo. Assicurarsi che le cellule siano coperte con ogni pozzo dopo 24 h.
2. Aggiungere il volume appropriato dei reagenti preparati nella porta di iniezione appropriata, secondo la precedente letteratura¹³. Porta A: 25 L 1 M di oligomicina (ATP Coupler); Porta B: 25 L 0,75 M di FCCP (Controllo elettronico della limitazione, etc acceleratore); Porta C: 25 L 0,5 di antimicina A/rotenone (inibitore mitocondriale A e inibitore mitocondriale B).
3. Conservare la cartuccia in un'incubatrice a 37 gradi centigradi senza CO_{2 fino} a quando non è pronta per l'uso.
4. Apportare una modifica media della piastra cellulare rimuovendo il supporto di corsa da ogni pozzo e aggiungendo al nuovo DMEM. Il volume finale per ogni pozzo è di 180 L.
5. Conservare la piastra cellulare in un'incubatrice di 37 gradi centigradi senza CO₂ per 1 h prima del saggio.
6. Registrare automaticamente l'OCR tramite software.
   1. Aprire il software OCR.
   2. Scegliere Cell Mito Stress Test Kit nel menu a discesa App.
   3. Fare clic sul pulsante Avvia app.
   4. Fare clic sul pulsante Esegui test di stress. Viene visualizzata la schermata Impostazione test stress cella.
   5. Effettuare le seguenti operazioni:
      1. Immettere il numero di celle di cui viene il seeding per pozzo nella casella Semina cella.
      2. Immettere l'OCR medio nella casella OCR basale medio.
      3. Immettere la concentrazione di lavoro finale per ogni reagente e iniettare i reagenti.
         NOTA: il valore OCR basale medio per la cella avrebbe dovuto essere rilevato prima di eseguire il test di ottimizzazione durante l'ottimizzazione per la concentrazione di seeding delle celle.
      4. Fare clic sul pulsante Avanti. Viene visualizzata la schermata delle informazioni di gruppo.
      5. Assegnare un gruppo ai pozzetti non assegnati scegliendo un colore e assegnando un nome, quindi facendo clic sui pozzetti appropriati.
         NOTA: I diversi gruppi sono definiti come diversi trattamenti prima dell'esecuzione del Test di Stress Mito Cellulare. Tutti i pozzi di microplaline ottengono le stesse iniezioni di reagente quando viene eseguito il test di stress.
      6. Fare clic sul pulsante Avanti. Viene visualizzata la schermata Layout iniezione test di stress.
      7. Fare clic su Start. Il test di stress viene ora eseguito sull'analizzatore. Quando la corsa è finita, seguire il punto s nel software, rimuovere e scartare la cartuccia e la piastra cellulare.

Risultati

I mitocondri di cellule HepG2 esposte a β-HCH sono stati notevolmente danneggiati. I mitocondri sparsi erano leggermente espansi, di forma irregolare, e la cresta mitocondriale scomparve con un'architettura mitocondriale relativamente anormale (Figura 1).

Intensità media di fluorescenza verde mitocondriale, che rappresenta i mitocondri, diminuita nelle cellule HepG2 esposte a β-HCH (

Discussione

Fondamentale per il successo del protocollo di rilevamento è l'uso di una varietà di metodi sperimentali che sono stati trattati lo studio dal fenotipo al meccanismo. In questo studio, le cellule Dicale sono state colturate in DMEM con penicillina e streptomicina e siero bovino fetale al 10%. Quando le cellule hanno raggiunto il 40-50% di confluenza, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) sono stati aggiunti e incubati per 24 h. In primo luogo abbiamo usato TEM che ha mostrato i cambiamenti ultrastrutturali nell'eparitocita causati...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transmission electron microscope	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining.
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	700B	The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to  produce a perfect 3-dimensional specimen image.
Enhanced ATP Assay Kit	Beyotime	S0027	Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes.
Luminometer	Berthold	Centro LB 960	Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence.
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations.
Multimode reader	TECAN	InfiniteM200	Multimode reader be used to detect protein consentration.