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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo manoscritto presenta un metodo dettagliato per la generazione di X-cromosoma braccio sonde e performanti in situ ibridazione di fluorescenza (pesce) per esaminare lo stato della sorella coesione cromatidio in prometafase e metafase sono arrestato Drosofila ovociti. Questo protocollo è adatto a determinare se la coesione meiotica braccio è intatto o perturbato in differenti genotipi.

Abstract

Negli esseri umani, gli errori di segregazione del cromosoma in ovociti sono responsabili della maggior parte di aborti e malformazioni congenite. Inoltre, come le donne invecchiano, il loro rischio di concepire che un feto aneuploide aumenta notevolmente e questo fenomeno è noto come l'effetto dell'età materna. È un requisito per la segregazione del cromosoma accurata durante le divisioni meiotiche manutenzione della sorella coesione tra cromatidi fratelli durante il periodo di profase estesa esperienza di ovociti. Prova citologica in entrambi esseri umani e gli organismi modello suggerisce che coesione meiotica si deteriora durante il processo di invecchiamento. Inoltre, gli errori di segregazione in ovociti umani sono più prevalenti durante la meiosi I, coerente con la perdita prematura di coesione di braccio. L'uso di organismi modello è fondamentale per dipanare i meccanismi che sottendono la perdita età-dipendente di coesione. Drosophila melanogaster offre diversi vantaggi per studiare il regolamento di meiotic coesione negli ovociti. Tuttavia, fino a poco tempo, solo i test genetici erano disponibili test per la perdita di coesione del braccio in ovociti di genotipi diversi o in diverse condizioni sperimentali. Qui, un protocollo dettagliato è fornito per l'utilizzo di fluorescenza in situ ibridazione (pesce) per visualizzare direttamente difetti nella coesione del braccio in prometafase io e metafase sono arrestato ovociti di Drosophila . Generando una sonda di pesce che ibridizza con il braccio distale del cromosoma X e raccogliendo gli stack Z confocale, un ricercatore può visualizzare il numero di singoli segnali di pesce in tre dimensioni e determinare se sorella cromatidio braccia sono separati. La procedura descritta permette di quantificare i difetti di coesione braccio in centinaia di Drosophila ovociti. Come tale, questo metodo fornisce un importante strumento per indagare i meccanismi che contribuiscono alla coesione manutenzione, nonché i fattori che portano alla sua scomparsa durante il processo di invecchiamento.

Introduzione

Corretta segregazione dei cromosomi durante la mitosi e meiosi richiede che la sorella cromatidio coesione essere stabilito, mantenuto e rilasciato in un modo coordinato1,2. Coesione è stabilito durante la fase S ed è mediato dalla coesina complessa, che forma legami fisici che tengono la sorella cromatidi insieme. Nella meiosi, coesione distale di un crossover funziona anche per tenere insieme gli omologhi ricombinanti e questa associazione fisica contribuisce a garantire il corretto orientamento di bivalente su metafase mandrino (Figura 1)3,4, 5. Rilascio del braccio coesione a anafase permette l'omologhi segregare ai poli opposti del mandrino. Tuttavia, se la coesione del braccio è perso prematuramente, ricombinanti omologhi perderanno loro connessione fisica e segregare in modo casuale, che può provocare gameti aneuploid (Figura 1).

In ovociti umani, errori nella segregazione del cromosoma sono la principale causa di aborti e malformazioni alla nascita, come la sindrome di Down6, e la loro incidenza aumenta esponenzialmente con l'età materna7. Coesione di cromatidio della sorella è stabilito negli ovociti fetali e ricombinazione meiotic viene completata prima della nascita. Ovociti quindi arrestare in Mid-Profase I fino a quando l'ovulazione e durante questo periodo di arresto, l'associazione fisica costante degli omologhi ricombinanti si basa sulla sorella coesione tra cromatidi fratelli. Di conseguenza, accurata segregazione durante la meiosi e gli esiti di gravidanza normale richiedono che coesione rimangono intatti per fino a cinque decenni.

La perdita prematura di coesione durante l'arresto prolungato meiotic di ovociti umani è stata proposta per contribuire all'effetto dell'età materna e linee multiple di prova supportano questa ipotesi8,9. Tuttavia, date le sfide di studiare meiotica coesione in ovociti umani, gran parte della nostra comprensione di questo fenomeno si basa sull'uso di modello organismi5,10,11,12, 13,14,15.

Drosophila melanogaster ovociti offrono numerosi vantaggi per lo studio della coesione e cromosoma meiotic di segregazione. Una semplice analisi genetica permette di recuperare la progenie da gameti aneuploid e misurare la fedeltà di X-segregazione cromosomica su una larga scala11,16,17. Inoltre, si può anche determinare se gli errori di segregazione del cromosoma sorgono perché missegregate ricombinanti omologhi durante la meiosi I, un fenotipo che è coerenza con la perdita prematura di braccio coesione11,18, 19. diretta osservazione dello stato di coesione meiotica in ovociti di Drosophila è anche possibile mediante ibridazione in situ di fluorescenza (pesce). Anche se oligonucleotidi fluorescenti che ibridano a sequenze ripetitive satellite sono stati utilizzati per oltre un decennio per monitorare pericentromeric coesione maturo Drosophila ovociti4,20, analisi del braccio coesione è stato molto più difficile. Visualizzazione dello stato di coesione braccio richiede una sonda che si estende su una vasta regione di copia singola sequenze ed è abbastanza luminosa per provocare segnali visibili per singolo sorella cromatidi quando braccio coesione è assente. Inoltre, il condizioni di fissazione degli ovociti e le dimensioni delle autorità nazionali designate con etichettate deve facilitare la penetrazione21 nell'ovocita maturo grande di Drosophila (200 µm larga di 500 µm lungo). Recentemente, una sonda di braccio è stato correttamente utilizzato per prevedere i cromatidi oocita di Drosophila durante l'anafase io, ma gli autori ha dichiarato che potrebbe non rilevare un segnale in prometafase o metafase sono arrestato ovociti22. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la generazione di X-braccio del cromosoma FISH sonde e le condizioni di preparazione degli ovociti che ci hanno permesso di analizzare per la perdita prematura della sorella coesione cromatidio in prometafase io e metafase ho ovociti. Queste tecniche, che hanno permesso di identificare prodotti genici che sono necessari per il mantenimento della coesione meiotica, permetterà ad altri di dosaggio per sorella coesione cromatidio difetti in ovociti maturi di Drosophila di genotipi differenti.

Protocollo

1. preparati

  1. Preparare le soluzioni per ibridazione in situ di fluorescenza (pesce). Preparare tutte le soluzioni utilizzando acqua ultrapura.
    1. Preparare per volta Robb buffer 5x: acetato di potassio di 275 mM, 200 millimetri di acetato di sodio, saccarosio 500mm, glucosio di 50 mM, 6 mM di cloruro di magnesio, cloruro di calcio di 5 mM, 500 mM HEPES pH = 7,4. Portare il pH a 7.4 utilizzo 10 N NaOH. Filtro sterilizzare e conservare a-20 ° C. Scongelare e diluire a 1x come necessario e conservare 1 x aliquote a-20 ° C.
    2. Preparare 10 x tamponato fosfato salino (PBS) utilizzando 1,3 M di NaCl, 70mm Na2HPO4, 30mm NaH2PO4. Portare il pH a 7.0 utilizzando 10 N NaOH. Sterilizzare con la sterilizzazione in autoclave o filtro.
  2. Preparare vetrini coprioggetti poli-L-lisina un giorno prima necessario.
    1. Pipettare 70% etanolo contenente 1% di acido cloridrico sulla superficie di un vetrino coprioggetto 18 x 18 mm #1.5 e incubare 5 min aspirazione sottovuoto uso per rimuovere il liquido. Ripetere l'operazione con acqua ultrapura sterile. Coprire la superficie del vetrino coprioggetto con 0,1 mg/mL poli-L-lisina e incubare per 10 min.
    2. Aspirare per rimuovere il liquido e aria secca per 10 min. lato archivio vetrini coprioggetti poli-L-lisina fino in un contenitore di plastica con un coperchio a chiusura ermetica per evitare la polvere.
  3. Preparare tirato Pasteur pipette per rimuovere soluzioni liquide senza rimuovere gli ovociti. Sopra una fiamma di bruciatore di Bunsen, riscaldare il mezzo di un pipetta Pasteur di vetro lunghe tirando delicatamente su ciascuna estremità fino a quando il vetro si scioglie e tira a pezzi.

2. generazione della sonda di braccio per pesce

Nota: Tutte le fasi di centrifuga vengono eseguite a ~ 16.000-21.000 x g (velocità massima sulla maggior parte dei piano tavolo Microcentrifughe). Giri di centrifuga breve, indicare la filatura per Vortex s. 5-15 indica nel Vortex per ~ 15 s a max velocità se non specificato diversamente.

Nota: BACs per braccio sonde possono essere ottenute dalle BAC PAC risorse. Due sonde di euchromatic del braccio del cromosoma di X sono state usate con successo con questo metodo. Una sonda di braccio è stata composta di sei cloni BAC corrispondente a citologico bande 6E-7B (BACR17C09, BACR06J12, BACR35J16, BACR20K01, BACR35A18, BACR26L11). L'altra sonda braccio ha consistito di sei cloni BAC corrispondente a bande citologico 2F - 3C (BACR13K19, BACR21G11, BACR09H13, BACR30B01, BACR34O03, BACR03D13). BACs per altro cromosoma di Drosophila regioni possono essere sfogliate a: http://www.fruitfly.org/sequence/X1-11-assembly.html. Due sonde di pericentric che riconoscono la ripetizione di satellitare bp 359 del cromosoma X sono stati usati con successo con questo metodo. Una sonda del 22 nucleotide è stato ampiamente utilizzata e funziona bene (5'-Cy3-AGGGATCGTTAGCACTCGTAAT)19,23. Una sonda 28 del nucleotide è stato recentemente testata e ha anche lavorato bene (5'-Cy3-GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC)24. HPLC purificato oligonucleotidi 5' etichettati con un fluoroforo specifico sono state ordinate da una fonte commerciale (ad es., Integrated DNA Technologies).

  1. Preparazione del DNA di clone BAC seguendo le istruzioni del kit come specificato nella Tabella materiali. Risospendere il pellet di DNA ottenuto da 100 mL di coltura in 200 µ l di TE; la concentrazione di DNA finale deve essere compreso tra 5-40 ng / µ l a seconda il clone BAC.
  2. Eseguire l'amplificazione del DNA per ogni BAC utilizzando il kit di amplificazione, come specificato nella tabella dei materiali e il seguente protocollo. Processo del DNA di BAC per ogni clone individualmente. Utilizzare enzimi e buffer fornito con il kit in passaggi 2.2.1 attraverso 2.2.3.
    1. La frammentazione casuale del DNA di BAC: per ogni BAC, usare TE per preparare 10 µ l di una soluzione di DNA 1 ng / µ l in un tubo PCR di 200 µ l. Aggiungere 1 µ l di tampone di frammentazione X 10. Posizionare il tubo in una macchina PCR a 95 ° C per esattamente 4 min immediatamente raffreddare il campione in acqua con ghiaccio e centrifugare brevemente. L'incubazione è ora sensibile e qualsiasi deviazione può alterare i risultati.
    2. Preparazione di biblioteca
      Nota: Questo metodo utilizza gli iniettori casuali per generare una libreria di frammenti amplificabile.
      1. Nella provetta contenente il DNA aggiungere quanto segue: 2 µ l di libreria preparazione 1x, 1 µ l di soluzione di stabilizzazione della libreria. Mescolare nel Vortex, centrifugare brevemente e posizionare il tubo nella macchina PCR a 95 ° C per 2 min immediatamente raffreddare il campione in acqua con ghiaccio e centrifugare brevemente.
      2. Aggiungere 1 µ l di enzima preparazione libreria alla provetta PCR, mix e centrifugare brevemente. Posto PCR tubo nella macchina PCR e incubare come segue: 16 ° C per 20 min, 24 ° C per 20 min, 37 ° C per 20 min, 75 ° C per 5 min, quindi tenere a 4 ° C.
      3. Rimuovere i campioni dalla macchina PCR e centrifugare. I campioni possono essere amplificati immediatamente o conservati a-20 ° C fino a tre giorni.
    3. Amplificazione della libreria del DNA di BAC
      1. Aggiungere i seguenti reagenti per l'intera reazione casuale frammento 15 µ l: 7,5 µ l 10 x amplificazione Master Mix, 47,5 µ l acqua gratuita di nucleasi, 5 µ l della polimerasi di DNA di WGA. Mescolare nel vortex e centrifugare.
      2. Posto PCR tubo nella macchina PCR e incubare come segue: iniziale denaturazione 95 ° C per 3 min, 14 cicli di denaturazione a 94 ° C per 15 s, seguito da ricottura/estensione a 65 ° C per 5 min, quindi tenere a 4 ° C.
      3. Dopo il ciclismo è completo, dosaggio della concentrazione di DNA. La concentrazione del DNA dovrebbe essere almeno 800 ng / µ l. conservare i campioni a 4 ° C o conservare a-20 ° C fino al pronto per la digestione. Facoltativamente, valutare la dimensione del frammento di DNA eseguendo 400 ng di DNA su un gel di agarosio al 2%. Frammenti dovrebbero variare da 200 bp a 3 kb (Figura 2).
  3. Digestione degli enzimi di restrizione del DNA amplificato
    1. Posto 20 µ g di DNA amplificato dalla sezione precedente in una provetta da 1,5 mL microfuge. Aggiungere 20 unità di Alul, Haelll, Msel, Mspl, Rsal, 25 unità di BfuCl, 0,5 µ l 100 x BSA, 5 µ l 10 x buffer di digestione degli enzimi di limitazione e regolare il volume a 50 µ l aggiungendo la quantità appropriata di ultrapura H2O.
    2. Incubare il digest durante la notte a 37 ° C in un incubatore per evitare la condensa sul coperchio. Etanolo precipitare il DNA digerito. Aggiungere il digest: 1 glicogeno µ l, 1/10 di volume 3M sodio acetato, etanolo 100% grado molecolare 2.5 volumi. Incubare a-80 ° C per 1 h o durante la notte.
    3. Centrifuga per 30 min a 4 ° C. Pellet di DNA lavare con 1 volume di etanolo al 70% temp camera e spin per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e lasciare che il DNA a pellet aria secca o asciugare delicatamente con un flusso costante di aria.
    4. Risospendere il pellet di DNA in 36 µ l sterile ultrapura H2O e utilizzare 1 µ l di DNA per analizzare la concentrazione di DNA, che dovrebbe essere circa 285 ng / µ l. conservare il DNA a-20 ° C.
    5. Eventualmente valutare la dimensione del frammento di DNA in esecuzione 400 ng di DNA su un gel di agarosio al 2%. Maggior parte dei frammenti dovrebbero variare da 100-200 bp, con un segnale più debole fino a 500 bp (Figura 2).
  4. 3' tailing reazione
    1. Denaturare il DNA digerito a 100 ° C per 1 min in un blocco di calore. Raffreddare immediatamente in acqua ghiacciata. Per i 35 µ l di DNA, aggiungere la seguente: 50 µ l 400 mM sodio cacodilato, 1 µ l 10 mM DTT e vortice bene. Aggiungere 4 µ l 25 mM CoCl2, 2,5 µ l 2 mM 5-(3-aminoallyl)-dUTP da ARES etichettatura kit come specificato nella tabella dei materiali, 5 µ l 1 mM dTTP, 18 µ l 5 x TdT buffer e transferasi terminale di deoxynucleotidyl 1 µ l (TdT) 400 U / µ l. Vortex e centrifugare brevemente.
      Attenzione: CoCl2 tossici, indossare una protezione appropriata.
    2. Incubare per 2 ore a 37 ° C in un incubatore per evitare la condensazione. Aggiungere 1 µ l di 250 mM EDTA per fermare la reazione e il vortice brevemente per mescolare. Etanolo precipitare il DNA munito, come descritto in precedenza (punti 2.3.2 - 2.3.4). Risospendere il pellet di DNA secco in 10 µ l sterile ultrapura H2O. Store il DNA a-20 ° C fino al momento di continuare.
  5. Condurre la coniugazione di tintura fluorescente utilizzando il kit etichettatura del DNA come specificato nella tabella materiali.
    Nota: Una volta che il colorante viene aggiunto conservare campioni al buio.
    1. Denaturare il DNA dalla coda a 95 ° C per 5 min in un blocco di calore. Raffreddare immediatamente DNA in acqua ghiacciata e centrifugare brevemente. Preparare il tampone d'etichettatura secondo le istruzioni del kit e aggiungere 6 µ l di ciascun campione di DNA. Risospendere ciascun tubo di tintura in 4 µ l di DMSO da kit. Vortex e centrifugare brevemente.
    2. Utilizzare un tubo di tintura per ogni reazione d'etichettatura. Aggiungere la soluzione colorante per il DNA, vortex e centrifugare brevemente. Incubare la reazione d'etichettatura a temperatura ambiente per 2 h al buio. 3 µ l di idrossilammina 3M per arrestare la reazione seguita da 77 µ l di nucleasi-free H2O dal kit. Vortex e centrifugare brevemente.
  6. Rimuovere il colorante non coniugato utilizzando il kit di purificazione di PCR come specificato nella tabella dei materiali. Seguire le istruzioni del produttore. Eluire il DNA dalla colonna due volte utilizzando 40 µ l di tampone di eluizione ogni volta.
  7. Etanolo precipitare il DNA etichettato come descritto in precedenza (punti 2.3.2 - 2.3.4). Risospendere il pellet di DNA secco in 10 µ l di tampone di eluizione.
  8. Preparare la miscela della sonda
    1. Per il DNA con etichettato, determinare la concentrazione della tintura fluorocromo in pmol / µ l. La concentrazione di fluorophore può variare da 30-100 pmol / µ l, a seconda della BAC. La concentrazione di DNA può variare da 300-800 ng / µ l.
      Nota: L'impostazione di microarray funziona bene su uno spettrofotometro di microvolume, come specificato nella tabella dei materiali. Nella finestra di microarray, selezionare DNA-50 e specificare il fluorocromo.
    2. Creare un mix master combinando quantità equimolare (pmol fluor) di ciascuna delle sonde BAC. Vortice 30 s prima della combinazione. Per evitare cicli di gelo/disgelo, preparare aliquote di mix master, applicare strato di paraffina per i tubi per evitare l'evaporazione e conservare al buio a-20 ° C.
      Nota: Un mastermix contenente 250 pmol di ciascuno dei 6 singoli BAC sonde in un volume totale di 30-50 µ l funziona bene. Un'aliquota contenente 25 pmol (fluor) per ogni BAC sarà sufficiente per le reazioni di ibridazione di due 40 µ l, con una concentrazione finale di sonda di 0,31 pmol fluor / µ l per ogni BAC.

3. la dissezione e la fissazione degli ovociti

  1. Raccogliere 30 femmine adulte Vergine del genotipo appropriato. Per arricchire per ovociti fase tarda, tenere le femmine senza maschi in un flaconcino con alimento e lievito secco per 3-5 giorni prima della dissezione25. Il giorno prima della dissezione, trasferire le femmine senza gas per un flaconcino fresco con il lievito.
  2. Eseguire la dissezione.
    Nota: Vedere la Figura 3 per gli strumenti necessari. Soluzioni vengono rimossi utilizzando una pipetta di Pasteur tirata se non specificato diversamente. Quando si trasferiscono le ovaie sempre utilizzare un puntale rivestito con una soluzione di 10% BSA.
    1. In un piatto piano di dissezione contenente tampone di Robb per volta, utilizzare pinze per rimuovere le ovaie di una donna sola. Uso di forcipe o un ago di tungsteno a strombo delicatamente ogni ovaia, permettendo la soluzione contattare ovarioles interiore. Trasferire la coppia delle ovaie strombate in una provetta di microfuge 1,5 mL contenente tampone di 1 mL per volta Robb.
    2. Ripetere il punto 3.2.1 per accumulare le ovaie da 20-25 femmine nel tubo microfuge 1,5 mL. Finire le dissezioni delle femmine 20-25 entro 10 min.
  3. Eseguire il fissaggio come indicato di seguito.
    1. Con una pipetta Pasteur tirata, rimuovere il liquido nel tubo microfuge, utilizzare un P1000 rapidamente aggiungere 500 µ l di soluzione di 37 ° C alle ovaie e quindi immediatamente aggiungere 500 µ l di eptano temperatura alle ovaie.
    2. Tubo microfuge agitare per mescolare e mettere su un nutator per 3 min. rimuovere il tubo di microfuge dal nutator e posto in una cremagliera del tubo per 1 min consentire gli ovociti per depositarsi sul fondo. La data di fissazione totale è di 4 min.
      Attenzione: Soluzione di correzione ed eptano sono tossici, indossare una protezione appropriata.
    3. Rimuovere la soluzione di fix e risciacquare le ovaie 3 volte in 500 µ l di PBS contenente 0.5% di BSA e 0,1% Triton X-100 (PBSBTx)
  4. Ripetere per i restanti genotipi.

4. rimozione di Chorions e membrana vitellina

Nota: Vedere la Figura 3 per gli strumenti necessari.

  1. Ovociti di fase tardo separata
    1. Aggiungere 1 mL PBSBTx per un piatto poco profondo per dissezione. Utilizzare un P200 con una punta rivestita di BSA per trasferire fisse ovaie (in ~ 150 µ l) nel piatto poco profondo. Pipetta ovaie su e giù con la punta della pipetta rivestito di BSA per sloggiare gli ovociti maturi da ovociti meno maturi.
    2. Quando gli ovociti fase tardiva sono sufficientemente separati, è possibile trasferire tutto il tessuto in una provetta di microfuge 500 µ l. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta Pasteur tirato, lasciando circa 150-200 µ l nella provetta. Ripetere sezione 4.1 per i restanti genotipi.
  2. Preparare per la laminazione
    1. Pre-bagnato un pozzo profondo piatto con 200 µ l di PBSBTx. coperchio e mettere da parte. Ottenere 3 lastre di vetro satinato e lucido set #3 da parte. Strofinare delicatamente le regioni di vetro smerigliato di diapositive #1 e #2 insieme. Sciacquare in acqua deionizzata per rimuovere eventuali schegge di vetro e asciugare con un panno monouso.
    2. Rivestire le regioni glassate di diapositive #1 e #2 con PBSBTx aggiungendo 50 µ l di PBSBTx a una diapositiva e sfregamento questa regione con le altre diapositive. Rimuovere il liquido con un panno monouso.
    3. Porre i vetrini con un microscopio per dissezione nella configurazione illustrata nella Figura 4A. Mantenere le regioni glassate di diapositive #1 e #2 in contatto, con scivolo #3 supporto diapositiva #2.
  3. Rotolo di ovociti; Assicurarsi che la direzione di laminazione sia sempre in linea retta e mai un movimento circolare.
    1. Prewet un P200 pipetta punta in PBSBTx e disperdere gli ovociti nel tubo microfuge pipettando su e giù. Trasferire 50 µ l di liquidi contenenti ovociti al centro della parte di vetro glassato della diapositiva #1. Sollevare il vetrino #2 per farlo.
    2. Abbassare lentamente il vetrino #2 fino a quando la tensione superficiale del liquido crea una tenuta tra le due regioni di vetro smerigliato. Ci dovrebbe essere abbastanza liquido per coprire l'area glassato ma nessuno dovrebbe essere che filtra fuori. Se il liquido è straripante, è possibile utilizzare una pipetta Pasteur tirata per eliminare il liquido in eccesso.
    3. Tenere la diapositiva di fondo (#1) in posizione con una mano e usare l'altra mano per spostare la slitta superiore (#2) avanti e indietro in direzione orizzontale, mantenendo lucido #2 livello e supportati su diapositiva #3. Eseguire sotto un microscopio per una visualizzazione semplice dei movimenti degli ovociti e progresso.
      Nota: Questo movimento genera attrito e causare gli ovociti "roll" e perdere la loro chorions. Pressione minima dovrebbe essere usata e movimenti dovrebbero essere breve e veloce.
    4. Dopo pochi movimenti in direzione orizzontale, è necessario modificare leggermente l'angolo di movimento (Figura 4B). Incrementi di più, aumentare gradualmente questo angolo a 90° fino a quando il movimento della slitta superiore (#2) è perpendicolare alla direzione di partenza (Figura 4B). Si noti che chorions vuoto sarà visibile nel liquido e ovociti privi chorions apparirà più lungo e sottile.
    5. Ripetere i passaggi 4.3.3 - 4.3.4 circa 7 - 10 volte fino a quando la soluzione diventa leggermente torbida. Smettere di rotolamento quando la maggior parte degli ovociti (75-85%) sembra aver perso la loro membrana vitellina.
      Nota: Un'estremità appuntita distintiva è spesso visibile su ovociti privi di membrana vitellina. Membrana vitellina è più difficili da rimuovere che chorions. Leggera pressione può essere applicata alla diapositiva superiore (diapositiva #2) durante il rotolamento per ottenere la rimozione della membrana vitellina. Cercando di rimuovere la membrana vitellina da tutti gli ovociti provoca spesso la distruzione di altri ovociti.
    6. Sollevare delicatamente il vetrino superiore (#2), trascinando uno dei suoi angoli al centro della regione glassato della slitta inferiore (#1) che l'annullamento di ovociti si accumulano nel centro della regione smerigliato. Risciacquare gli ovociti da entrambi diapositive con PBSBTx nel pozzo profondo piatto contenente PBSBTx.
    7. Pulire diapositive #1 e #2 con acqua ultrapura, asciugare con un panno monouso e reset. Ripetere i passaggi 4.3.1 - 4.3.6 fino a quando tutti gli ovociti dello stesso genotipo hanno stati rotolati. Questo di solito richiede 3-4 giri di rotolamento al genotipo.
  4. Rimuovere i detriti dopo la laminazione
    1. Aggiungere 1 mL PBSBTx a una provetta conica da 15 mL. Agitare il liquido per rivestire i lati del tubo.
    2. Utilizzando un PBSBTx rivestito P1000 puntale, trasferimento gli ovociti laminati dal profondo ben piatto nella provetta conica contenente 1 mL di PBSBTx. Aggiungi un ulteriore 2 mL di PBSBTx nella provetta conica contenente gli ovociti.
    3. Lasciate che gli ovociti iniziano a depositarsi sul fondo, quindi rimuovere la parte superiore 2 mL di soluzione contenente detriti (chorions, vitellines, ecc.) con un P1000 e scartare. Se necessario, è possibile tenere la provetta conica contro uno sfondo scuro per vedere gli ovociti opachi come si affondano.
    4. Aggiungere un ulteriore 2 mL di PBSBTx gli ovociti e ripetere il punto 4.4.3. Ripetere 4.4.3. per un totale di 3 turni di rimozione detriti.
    5. Utilizzando un PBSBTx rivestito P1000 puntale, trasferimento ovociti torna al tubo originale di 500 µ l del microfuge. 20 - 25 femmine dovrebbero produrre circa 50 µ l di laminati ovociti maturi.
  5. Ripetere il punto 4 per i restanti genotipi utilizzando diapositive smerigliati freschi, un piatto pulito profondo bene e un nuovo tubo conico per ciascun genotipo.
  6. Se è necessaria la conservazione, trasferire gli ovociti a 1X PBS con 0,1% TritionX-100 e store durante la notte a 4 ° C. Stoccaggio a lungo termine non è raccomandato perché la reticolazione di formaldeide può essere invertita con detergenti non ionici.

5. PESCE

Nota: Tutti i lavaggi vengono eseguiti su un nutator a temperatura ambiente, se non specificato diversamente. Gli ovociti che hanno stati rotolati richiedono più tempo per depositano alla parte inferiore del tubo microfuge, soprattutto nelle soluzioni che contengono formammide. È importante essere pazienti quando si cambia soluzioni affinché gli ovociti non vengono persi nel processo. Ciò può richiedere in attesa di 5-15 min per lasciare gli ovociti stabilirsi dopo risciacqui e lavaggi. Si noti inoltre che gli ovociti in formammide sono meno opachi.

  1. Trattamento di estrazione e RNasi
    1. Risciacquare gli ovociti con 500 µ l di PBS contenente l'1% Triton X-100 (PBSTx). Rimuovere il liquido e aggiungere 500 µ l tampone di estrazione (PBSTx contenente RNasi). Incubare su nutator a temperatura ambiente per 2 h.
  2. Lavate di pre-ibridazione
    1. Risciacquare gli ovociti 3 volte con 500 µ l 2 x Saline citrato di sodio contenente Tween 20 (SSCT). Preriscaldare un'aliquota (~ 500 µ l/genotipo) di 2 x SSCT + 50% formammide a 37 ° C.
      Attenzione: formammide è tossica, indossare una protezione appropriata.
    2. Lavare gli ovociti 3 volte per 10 minuti ciascuno, in 500 µ l 2 x SSCT. Lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT + 20% formammide. Lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT + 40% formammide. Lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT + 50% formammide.
    3. Rimuovere il liquido e aggiungere 500 µ l di 37 ° C 2 x SSCT + 50% formammide dal punto 5.2.1 al campione e incubare per 2 ore a 37 ° C con rotazione.
      Nota: Un forno di ibridazione dotato di un rotore funziona bene per questo. Un tubo di microfuge schiuma "galleggiante" attaccato al rotatore può essere utilizzato per fissare i tubi.
  3. Denaturazione e ibridazione
    1. Per ogni provetta di ovociti, utilizzare 40 µ l di tampone di ibridazione 1x contenente la sonda centromerica di 2,5 ng / µ l e 0,31 pmol fluor / µ l di ciascuna sonda BAC. Preparare una soluzione di sonda in tampone di ibridazione sufficiente per tutti i genotipi. Vortice sonda mix 30 s prima di aggiungere.
    2. Utilizzando una punta di pipetta rivestite con BSA P200, trasferire gli ovociti in una provetta PCR di 200 µ l. I campioni possono essere conservati a 37 ° C e lasciare ovociti settle alla parte inferiore, quindi utilizzare una pipetta Pasteur tirata per rimuovere quanto più liquido possibile.
    3. Aggiungere 40 µ l di soluzione di ibridazione contenente sonda (preparato nella sezione 2) per gli ovociti. Collocare la provetta PCR contenente gli ovociti nella macchina PCR e incubare come segue: 37 ° C per 5 min, 92 ° C per 3 min, poi 37 ° C durante la notte. Dopo aver aggiunto sonda gli ovociti, tenerli al buio per quanto possibile.
  4. Lavaggi post-ibridazione
    1. Preriscaldare il 2 x SSCT + 50% formammide a 37 ° C e tenerlo in incubatrice ibridazione. Con un BSA rivestito P200 Pipettare suggerimento, aggiungere 100 µ l di 37 ° C 2 x SSCT + 50% formammide nella provetta PCR con gli ovociti e trasferire gli ovociti in una provetta di microfuge nuovo 500 µ l.
    2. Aggiungere un ulteriore 400 µ l di 37 ° C 2 x SSCT + 50% formammide al tubo stesso e lasciare che gli ovociti stabilirsi a 37 ° C nell'incubatore.
      Nota: Assestamento spesso richiede più tempo in questa fase. Non è insolito da prendere 15 min o più a lungo. Una mancanza di pazienza si tradurrà in una perdita significativa di ovociti.
    3. Lavare gli ovociti 3 volte per 20 minuti ciascuno, in 500 µ l 37 ° C 2 x SSCT + 50% formammide a 37 ° C con rotazione. Mantenere gli ovociti a 37 ° C, mentre si depositano.
    4. Lavare gli ovociti 3 volte per 10 minuti ciascuno, in 500 µ l 37 ° C 2 x SSCT + 50% formammide a 37 ° C con rotazione. Mantenere gli ovociti a 37 ° C, mentre si depositano.
    5. A temperatura ambiente, lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT + 40% formammide su un nutator. Lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT + 20% formammide. Lavare gli ovociti per 10 min in 500 µ l 2 x SSCT.
  5. Macchiare con DAPI
    Attenzione: DAPI è tossico, indossare una protezione appropriata.
    1. Lavare gli ovociti per 20 min a 500 µ l di soluzione DAPI (1 µ g/ml) in 2 x SSCT sui nutator. Risciacquare gli ovociti 3 volte in 500 µ l 2 x SSCT. Lavare gli ovociti 2 volte per 10 minuti ciascuno, in 500 µ l 2 x SSCT sui nutator. Campioni possono essere conservati per fino a 4 h a temperatura ambiente al buio fino a quando non sono pronti a montare sulle lamelle.
  6. Montaggio
    Nota: Vedere la Figura 3 per gli strumenti necessari.
    1. Porre un coprivetrino rivestito di poli-L-lisina al microscopio per dissezione. Rimuovere il liquido dal tubo di ovociti, regolazione del volume totale di circa 150 µ l. Con un BSA rivestito P200 puntale, pipetta su e giù per disperdere gli ovociti in tutta la soluzione e poi trasferire 40 µ l di soluzione ed l'ovociti di una lamella rivestita di poli-L-lisina.
    2. Alcuni del liquido togliere il vetrino coprioggetto utilizzando una pipetta Pasteur tirata fino a quando gli ovociti bastone per il vetrino coprioggetto, ma sono ancora circondati da liquido. Con il forcipe, tenere premuto il vetrino coprioggetto su un lato e utilizzare un ago di tungsteno delicatamente dissociare ciuffi di ovociti, spostandoli per ottenere un singolo strato di ovociti non sovrapposte.
    3. Rimuovere il resto del liquido intorno gli ovociti con una pipetta Pasteur tirato. Prendere un vetrino pulito e utilizzare gas compresso per soffiare via la polvere. 22 µ l di montaggio supporti (ad es., prolungare-oro) al centro della diapositiva. Abbassare lentamente il vetrino verso il vetrino coprioggetto, con il supporto di montaggio rivolto verso il campione, fino a quando i media tocca il campione. Tensione superficiale causerà il coprioggetto di aderire alla diapositiva.
    4. Mettere i vetrini in un contenitore di plastica con un coperchio a chiusura ermetica che contiene uno strato di fresco essiccante (ad es., drierite). Lasciate che scivoli asciugare per 3-5 giorni al buio prima di formazione immagine. Tempo di asciugatura può variare a seconda dell'umidità della stanza.

6. imaging

  1. Rimozione di diapositive asciutti dalla casella di essiccante, pulirli per rimuovere eventuali particelle di polvere. Sigillare le lamelle con smalto. Sigillato vetrini possono essere conservati a tempo indeterminato a-20 ° C.
  2. Acquisire immagini confocal con un'apertura numerica elevata olio obiettivo 40x zoom digitale 6x di scansione laser.
    Nota: Idealmente, sistema software vi permetterà di trovare e contrassegnare la posizione X-Y dei cromosomi meiotici per più ovociti durante la visualizzazione di loro utilizzando epifluorescenza. Questa funzionalità consente di risparmiare tempo durante una sessione di imaging. Rapido imbianchimento con un obiettivo di apertura numerica elevata 60 X fatto suo uso inadatto con il sistema confocale scelto, ma può funzionare per altri sistemi.
  3. Acquisire una serie di Z per ogni ovocita, impostazione superiore e inferiore della serie utilizzando il segnale DAPI.
    Nota: Guadagno, offset, e potere del laser dovrà essere determinata empiricamente utilizzando un sottoinsieme degli ovociti. Una volta individuati i parametri adatti, solo piccoli aggiustamenti devono essere fatte.
    Se alterata acquisizione sono necessarie impostazioni, utilizzare la serie di immagini raccolte in precedenza per stimare le modifiche necessarie. Per evitare lo sbiancamento, astenersi da pre-imaging la sonda del braccio prima di catturare la serie Z. Con un passo di 0,25 µm, serie Z in genere vanno da 25 a 30 passi a seconda dell'orientamento e posizionamento dei cromosomi. Una dimensione di passaggio inferiore può migliorare la capacità di valutare se due macchie di pesce sono separati nella dimensione assiale, ma c'è un trade-off con il tempo necessario per catturare piccoli passaggi e perdita dell'intensità del segnale a causa di candeggio. Un obiettivo 40x con 6 X zoom digitale e un campo di immagine 1.024 x 512 genera immagini con una dimensione di pixel di 0,05 µm.

7. immagine analisi e segnando per difetti di coesione

  1. Deconvoluzione della serie Z per ottimizzare il rapporto segnale-rumore per ogni ovocita19.
    Nota: Un pacchetto di software come quello specificato nella Tabella dei materiali permette di deconvoluzione utilizzando restauro integrativo, nonché ritagliare e contrasto-migliorare le immagini. D'importanza, un pacchetto software che permette di visualizzare le immagini e il punteggio per i difetti di coesione in tre dimensioni è imperativo.
  2. Per ogni ovocita, catalogare il numero del braccio e i fuochi centromerici che colocalize con il segnale DAPI. Perdita di coesione comporta tre o quattro segnali distinti e separati per una sonda specifica. Non è raro osservare due fuochi che sono collegati da un filo sottile. Secondo i criteri più severi, questi fuochi non sarebbero considerati "separato".

Risultati

Figura 5 presenta le immagini ottenute con una sonda di braccio che ibridizza con citologico regione 6E-7B sul cromosoma X . Questo risultati di sonda in un segnale che co-localizza con quello di DAPI, è facilmente distinguibile dallo sfondo ed è stato usato con successo per quantificare i difetti di coesione del braccio in diversi genotipi19. Quantificazione dei difetti di coesione è stata limitata a prometafase io e metaf...

Discussione

L'uso di pesce sonde per valutare lo stato di coesione braccio in prometafase io e metafase ho Drosophila ovociti è un progresso significativo nel campo della drosofila meiosi. Storicamente, i ricercatori della Drosophila sono stati limitati a test genetici per dedurre la perdita prematura di coesione braccio in ovociti maturi11,18,19. Ora, con i metodi qui presentati, lo stato di coesione del braccio...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da NIH Grant GM59354 assegnato a Sharon E. Bickel. Ringraziamo Huy d. Nguyen per assistenza nello sviluppo del protocollo per la generazione di sonde fluorescenti braccio, Ann Lavanway per aiuto con microscopia confocale e J. Emiliano Reed per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche numerosi colleghi nella comunità della drosofila per utili discussioni e consigli.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
Midi Prep kitQiagen12143Prep BAC clone DNA
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) KitSigmaWGA2Amplify BAC clone DNA
ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kitInvitrogenA21676Label BAC clone DNA
PCR purification kitQiagen28104Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals & Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
Bovine serum albumin (BSA)Fisher ScientificBP1600-100Prepare 10% stock
Freeze aliquots
Calcium chlorideFisher ScientificC75-500
DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use.
Dextran sulfateSigmaD-8906
DrieriteDrierite Company23001
Dithiothreitol (DTT)Invitrogen15508-013Prepare 10 mM stock
dTTP (10 µmol, 100 µl)Boehringer Mannheim1277049Prepare 1 mM stock
EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid)Fisher ScientificS311-500Prepare 250 mM stock
100% ethanol (molecular grade, 200 proof)Decon Laboratories2716
Tris (Ultra Pure)Invitrogen15504-020
EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid)SigmaE-3889
16% formaldehydeTed Pella, Inc.18505Toxic: wear appropriate protection
FormamideInvitrogenAM9342Toxic: wear appropriate protection
GlucoseFisher ScientificD16-1
GlycogenRoche901393
HEPESBoehringer Mannheim737-151
HeptaneFisher ScientificH350-4Toxic: wear appropriate protection.
Hydrochloric acidMilliporeHX0603-4Toxic: wear appropriate protection.
HydroxylamineSigma438227Prepare 3 M stock
4.9 M Magnesium chlorideSigma104-20
Na2HPO4 Ÿ 7H2OFisher ScientificS373-500
NaH2PO4 Ÿ 2H2OFisher ScientificS369-500
Poly-L-lysine (0.1mg/ml)SigmaP8920-100
Potassium acetateFisher ScientificBP364-500
Sodium acetateFisher ScientificS209-500Prepare 3M stock
Sodium cacodylatePolysciences, Inc.1131Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock
Sodium citrateFisher ScientificBP327-1
Sodium chlorideFisher ScientificS271-3Sodium chloride
SucroseFisher ScientificS5-500
10% Tween 20Thermo Scientific28320Surfact-Amps
10% Triton X-100Thermo Scientific28314Surfact-Amps
NameCompanyCatalog NumberComments
Solutions
Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization.
TE buffer10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0
20X SSC (Saline Sodium Citrate)3 M NaCl, 300 mM sodium citrate
2X cacodylate fix solutionToxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA
1.1X Hybridization buffer3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate
Fix solutionToxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution
PBSBTx1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100
PBSTx1X PBS, 1% Trition X-100
Extraction buffer (PBSTx + Rnase)1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase
2X SSCT2X SSC, 0.1% Tween 20
2X SSCT + 20% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide
2X SSCT + 40% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide
2X SSCT + 50% formamideToxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide
NameCompanyCatalog NumberComments
Enzymes
AluINew England BiolabsR0137S
HaeIIINew England BiolabsR0108S
MseINew England BiolabsR0525S
MspINew England BiolabsR0106S
RsaINew England BiolabsR0167S
BfuCINew England BiolabsR0636S
100X BSANew England BiolabsComes with NEB enzymes
10X NEB buffer #2New England BiolabsRestriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µlRoche/Sigma3333566001
TdT bufferRoche/SigmaComes with TdT enzyme
Cobalt chlorideRoche/SigmaToxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme
RNase A (10 mg/mL)Thermo-ScientificEN0531
NameCompanyCatalog NumberComments
Cytology Tools etc.
ForcepsDumont#5 INOX, Biologie
9” Disposable glass Pasteur pipettesFisher13-678-20CAutoclave to sterilize
Shallow glass dissecting dishCustom made
Deep well dish (3 wells)Pyrex7223-34
Fisherfinest Premium microscope slidesFisher Scientific22-038-104Used to cover deep well dishes
Frosted glass slides, 25 x 75 mmVWR Scientific48312-002
Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thickThermo-Scientific3051
Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5Thermo-Scientific3405
Tungsten needlehomemade
Prolong GOLD mounting mediaMolecular ProbesP36930
Compressed-air in canVarious
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
PCR machineVarious
Nanodrop 2000, spectrophotometerThermo-Scientificmicrovolume spectrophotometer
VortexerVarious
Table top microfuge at room temperatureVarious
Table top microfuge at 4 °CVarious
Heat blockVarious
Hybridization oven or incubator with rotatorVarious
NutatorVarious
A1RSi laser scanning confoalNikon40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3)
NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables etc.
50 mL conical tubesVarious
15 mL conical tubesVarious
1.5 mL microfuge tubesVarious
500 µl microfuge tubesVarious
200 µl PCR tubesVarious
Plastic container with tight fitting lidVariousTo hold Drierite
KimwipesVariousdisposable wipes
ParafilmVariousparaffin film
NameCompanyCatalog NumberComments
Other
HPLC purified 5'-labeled oligonucleotidesIntegrated DNA TechnologiesCy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome
Volocity 3D Image Analysis SoftwarePerkinElmerVersion 6.3

Riferimenti

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