Un Western Blotting protocollo per un piccolo numero di cellule staminali ematopoietiche

Riepilogo

Un standard Western blotting protocollo è stato ottimizzato per analizzare come pochi come 500 ematopoietiche staminali o cellule progenitrici. Ottimizzazione comporta un'attenta manipolazione del campione cellulare, limitando i trasferimenti tra tubi e Lisi direttamente le cellule in tampone di Laemmli.

Abstract

Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule rare, con il midollo osseo di topo contenente solo ~ 25.000 fenotipica lungo termine repopulating HSCs. Un protocollo macchiante occidentale è stata ottimizzata e adatta per l'analisi di un piccolo numero di HSCs (500-15.000 cellule). Fenotipica HSCs sono stati purificati, accuratamente contati e direttamente lisate nel tampone di Laemmli. Lisati contenente un numero uguale di cellule sono stati analizzati mediante elettroforesi del gel di poliacrilammide del sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) e la macchia è stata preparata ed elaborato seguendo standard Western blotting protocolli. Usando questo protocollo, 2.000-5.000 HSCs può essere analizzato sistematicamente, e in alcuni casi i dati possono essere ottenuti da poco più di 500 cellule, confrontate alle cellule 20.000 a 40.000 segnalate nella maggior parte delle pubblicazioni. Questo protocollo dovrebbe essere generalmente applicabile ad altre cellule ematopoietiche e consente l'analisi di routine di un piccolo numero di celle utilizzando le procedure standard di laboratorio.

Introduzione

Cellule staminali ematopoietiche (HSCs) sono cellule autorinnovabile che possono dare origine a tutti i lignaggi di sangue. Essi sono relativamente rare cellule nel midollo osseo, rendendo difficile analisi biochimiche. Adatto per l'analisi di cellule rare, come la citometria a flusso, gli approcci sono stati estremamente utili per quantificare la quantità relativa di marcatori di superficie delle cellule e proteine intracellulari. Tuttavia, l'analisi delle proteine intracellulari richiede l'uso di procedure di permeabilizzazione delle cellule per consentire l'accesso dell'anticorpo, e non tutte le superficie epitopi sopravvivono queste procedure^1,2. Inoltre, gli anticorpi che discriminano tra prodotti di isoforme o scissione di diverse proteine non sono spesso disponibili per citometria a flusso, e quindi gli investigatori si basano ancora su Western blot per determinati tipi di analisi.

L'analisi Western blot dei lisati cellulari è una procedura di routine nella maggior parte dei laboratori. Le cellule possono essere purificate in condizioni native che conservano gli epitopi di molecole della superficie cellulare e lisati cellulari possono successivamente essere preparati ed analizzati. Tuttavia, l'analisi delle proteine nella cellula primaria rara popolazioni mediante Western blot può richiedere gran numero di animali per ottenere abbastanza cellule di eutanasia. Apportando piccole modifiche a diversi passi, un protocollo macchiante occidentale convenzionale è stato in grado di rilevare le proteine in un relativamente piccolo numero di HSCs (500-15.000, a seconda della proteina di interesse). Le regolazioni sono accuratamente contando le cellule, gestire attentamente il pellet cellulare, riducendo i trasferimenti delle cellule fra tubi per ridurre al minimo la perdita delle cellule, e un numero definito di cellule con un carico concentrato di lisi del buffer contenente proteasoma e inibitori delle fosfatasi. Molti rapporti pubblicati includono Western blot ottenuti con 20.000 o più HSCs^3,4,5,6,7; Questa semplice procedura ridurrà il numero delle cellule e animali da esperimento necessari per produrre dati equivalenti di compreso tra 4 e 40 volte. Il protocollo è progettato per normalizzare i risultati su base per cella, piuttosto che ad un controllo interno. Questo consente il rilevamento di riduzioni complessive nei livelli della proteina che possono essere trascurati se i dati sono normalizzati ad un controllo interno. L'importanza della normalizzazione su base per cellula è stato descritto per l'analisi dei dati di espressione genica⁸, e lo stesso principio si applica a quantificare le proteine mediante Western blot. Questo protocollo ottimizzato dovrebbe essere utile per chiunque abbia bisogno di analizzare un piccolo numero di cellule.

Protocollo

Tutte le procedure devono essere eseguite conformemente all'uso animale istituzionale e orientamenti di cura. La procedura è stata sviluppata per l'analisi di murine cellule ematopoietiche staminali e progenitrici (HSCs e HPs), ma può essere adattata per l'analisi di altre popolazioni cellulari.

1. flusso Cytometry isolamento di HSCs murino e HPs

1. Raccogliere le cellule del midollo osseo murino come descritto in letteratura⁶.
   Nota: Nei dati presentati in Figura 1 e Figura 2, midollo osseo è stato raccolto da topi C57BL/6J.
2. Eseguire svuotamento di stirpe delle cellule di midollo osseo utilizzando un kit di svuotamento lignaggio di mouse, seguendo le istruzioni del produttore.
3. Incubare le cellule con gli anticorpi contro i marcatori di superficie delle cellule di interesse come descritto⁷. Negli esperimenti illustrati nella Figura 1 e Figura 2, sono utilizzati anticorpi Sca-1, Kit, Flt3, e dei marcatori di lignaggio (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 e Ter119.
4. Ordinare le 2.000-20.000 Lin^– Sca1⁺Kit⁺ Flt3^– le cellule (HSCs) o Lin^–Sca1^–cellule Kit⁺ (HPs) in una provetta Eppendorf da 1,5 mL contenente 0,1 mL di fosfato tampone salino (PBS) con 2% fetale bovino siero (FBS).
   Nota: Per i dati mostrati nella Figura 1 e Figura 2, le cellule erano ordinate utilizzando un citometro a flusso con un ugello di 70 µM. Il volume massimo collezione è 1,4 mL.

2. preparazione del campione

Nota: Questo passaggio è fondamentale. Elaborare il campione molto attentamente. Quando si rimuove il supernatante, essere molto attenti a non disturbare il pellet cellulare.

1. Il 1.5 mL provette contenenti cellule ordinate in un rotore oscillante a 4 ° C, 500 x g, per 5 min. Rimuovi tutti, ma circa 100 µ l del surnatante dalla cella a pellet molto delicatamente utilizzando una pipetta e una punta di dispensare 20 µ l. Non disturbare il pellet.
   1. Se il campione contiene meno di 5000 cellule e il volume totale del campione ordinato è inferiore a 0,2 mL, trasferire le cellule prima di provette per PCR 0,2 mL obbligatoria bassa prima centrifugazione.
   2. Se il campione contiene meno di 5000 cellule e il volume è superiore a 0,2 mL, rallentare le cellule con una centrifuga a 4 ° C, 500 x g, per 5 min e rimuovete tutti ma 200 µ l del surnatante. Risospendere le cellule pellettate nei restanti 200 µ l di supernatante, poi trasferire le cellule per le provette per PCR 0,2 mL e girare di nuovo verso il basso. Rimuovere tutti i ma 20-30 µ l dal pellet dopo il secondo giro e risospendere le cellule.
2. Risospendere le cellule in surnatante a sinistra nel tubo. Se necessario, aggiungere ulteriori PBS nel 2% FBS/PBS (è anche possibile utilizzare 2% albumina di siero bovino (BSA) / PBS, o PBS da solo) per ottenere una concentrazione 5 x10⁴ a 5 x 10⁵ cellule/mL.
   Nota: Utilizzare la cella conta raccolti mediante citometria a stimare il volume utilizzato per sospendere le cellule.
3. Utilizzare 2-5 µ l delle cellule ri-sospensione per determinare una concentrazione di cellule accurato utilizzando un contatore di cellule automatizzato (seguendo le istruzioni del produttore) o un emocitometro⁹.
4. Trasferire un volume di ri-sospensione celle contenenti il numero desiderato di cellule in nuove provette da 1,5 mL. Per l'esperimento in Figura 1, 500, 1.000 o 2.000 HSCs o HPs sono stati trasferiti. Il numero di celle desiderato dipende dalla forza del segnale ottenuto mediante Western blot e viene determinato empiricamente. Eseguire il trasferimento utilizzando un 20 µ l o 100 µ l Eppendorf pipetta.
5. Centrifugare le cellule in un rotore oscillante a 4 ° C, 500 x g, per 5 min.
6. Per generare soluzioni di riserva: 100x, sciogliere gli inibitori del proteasoma e fosfatasi in DMSO secondo le istruzioni del produttore.
7. Preparare 2 x Laemmli tampone diluendo la 4 x Laemmli sample buffer fornito dal produttore con una quantità equivalente di acqua distillata. Aggiungere una quantità appropriata di stock 100x di inibitori del proteasoma e fosfatasi per ottenere una concentrazione finale di 2 inibitori di x nel 2 buffer del campione di x Laemmli.
   Nota: Il tampone del campione x Laemmli 2 può essere fatta in anticipo, ma gli inibitori del proteasoma e fosfatasi devono essere aggiunto immediatamente prima di aggiungere il 2 x Laemmli tampone (più inibitori) per il pellet cellulare per lisare le cellule, come descritto nel passaggio seguente.
8. Con attenzione rimuovere una porzione del supernatante dal pellet e al supernatante restanti nel tubo con il pellet cellulare, aggiungere un volume equivalente di tampone del campione x Laemmli 2 più inibitori del proteasoma e fosfatasi per ottenere una concentrazione finale di 500 cellule / µ l in 1 tampone del campione x Laemmli.
   Nota: ad esempio, se si trasferiscono 2.000 cellule in un volume totale di 20 µ l per un tubo nel punto 2.5, dopo centrifugazione le cellule (passo 2.6) si dovrebbe rimuovere 18 µ l del supernatante dal pellet e per i 2 µ l di supernatante che rimane aggiungere un volume uguale (2 µ l) di 2 x Laemmli buffer del campione per ottenere una concentrazione finale di 500 cellule / µ l in 1 tampone del campione x Laemmli.
9. Risospendere il pellet per generare il lisato appena possibile. A questo punto, i campioni possono essere immediatamente electrophoresed attraverso i gel di SDS-PAGE, oppure può essere snap congelato nel liquido N₂ e conservati a-80 ° C per un uso futuro.

3. elettroforesi

1. Riscaldare i lisati in un blocco di calore a 95 ° C o in acqua bollente per 5 min.
2. Electrophorese 1-40 µ l dei lisati (contenente da 500 a 20.000 equivalenti di cella) attraverso gel SDS-PAGE, a 100V, utilizzando protocolli standard¹⁰.
   Nota: Il volume di lisato caricati nel gel è determinato dal numero di cellule necessarie per generare il segnale desiderabile e dipenderà l'abbondanza della proteina di interesse e la qualità dell'anticorpo. I dati nella Figura 1 sono stati ottenuti con 2.000, 1.000 e 500 equivalenti di cella di lisato. La larghezza del pozzo dovrebbe essere nella gamma di 3 mm a 1,5 mm. 1,5 mm denti possono essere tagliata da un pettine di commercialmente disponibile con denti più ampia con le forbici.

4. trasferimento e bloccare

Nota: Eseguire un Western blot seguendo protocolli standard¹¹. I passaggi sono brevemente descritte qui:

1. Pretrattare una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) con metanolo per 10 s, quindi lavare la membrana brevemente con acqua distillata.
2. Trasferire le proteine dal gel SDS-PAGE alla membrana seguendo le istruzioni riportate nel manuale fornito dal costruttore dell'apparato di trasferimento.
3. Dopo il trasferimento, bloccare la membrana con 2 mL di 5% di albumina di siero bovino (BSA) in PBST (PBS con 0,1% Tween) overnight a 4 ° C, seguendo protocolli standard¹¹.

5. anticorpo etichettatura

1. Incubare la membrana con anticorpi su un agitatore durante la notte a 4 ° C, utilizzando diluizioni di anticorpo consigliati dal fornitore.
   Nota: Nella tabella materiali, gli anticorpi, che abbiamo convalidato per HSCs e HPs e le diluizioni di anticorpo corrispondente, sono indicati. Eseguire l'anticorpo etichettatura utilizzando le procedure standard⁸.

6. rilevazione

1. Lavare la membrana 3 volte, 5 min per ogni lavaggio in PBST a temperatura ambiente.
2. Incubare la membrana con 2 mL di tampone di chemiluminescenza per 1 min a temperatura ambiente. Rilevare i segnali utilizzando un sistema di imaging seguendo le istruzioni, o pellicola di autoradiografia e sviluppatrice pellicola del fabbricante.

Risultati

Risultati rappresentativi da 500-2.000 purificata HSCs e HPs sono mostrati nella Figura 1 e Figura 2. Il segnale di β-actina nella Figura 1 può essere rilevato da poco più di 500 HSCs e HPs purificate dal midollo osseo di un mouse. Si noti che i lisati di caricamento nei pozzetti di 1,5 mm prodotto un segnale molto più forte da 500 HPs di caricamento nei pozzetti di 3,0 mm. F...

Discussione

Western Blotting è una tecnica comune per la rilevazione di proteine specifiche e l'attivazione di vie di segnalazione in tessuti o cellule. Con l'introduzione di piccole modifiche ad una procedura comunemente utilizzata, siamo stati in grado di rilevare ordinariamente 15 proteine diverse (Tabella materiali) a 15.000 HSCs e in alcuni casi in appena 500 HSCs. Le fasi critiche in questo protocollo sono: 1) accuratamente contando le cellule, 2) riducendo al minimo il numero di trasferimenti tra tubi e 3) l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Ammonium Persulfate	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 comb	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Transfer System	Bio-Rad	1704155EDU	transfer
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052EDU	electrophoresis
Imaging System	Bio-Rad	1708195	signal detection
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747EDU	sample preparation
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer	Bio-Rad	1610732EDU	electrophoresis
2-Mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710EDU	sample preparation
RTA Mini PVDF Transfer Kit, for 40 blots	Bio-Rad	1704272	transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11697498001	sample preparation
Phosphatase Inhibitor Cocktailrs	Gold Biotechnology	GB-450-1	sample preparation
EIF4G	Cell signaling	2469	WB antibody, validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
p-Rps6	Cell signaling	4858	WB antibody,validated in 1000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): Fig2
actin(HRP conjugated)	abcam	ab49900	WB antibody,validated in 500 cells antibody concentration: 1:5000 reference(figure): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
S6	Cell Signaling	2317	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	WB antibody, validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
mTOR	Cell Signaling	2983	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:1000 reference(figure): ref5 (FigS1)
actin	Santa Cruz	sc-47778	WB antibody,validated in 15000 cells antibody concentration: 1:3000 reference(figure): ref5 (Fig4)
lineage depletion kit (mouse)	Miltenyi Biotec	130-090-858	hematopoietic stem and progenitor cells purification
LS columns	Miltenyi Biotec	130-041-305	hematopoietic stem and progenitor cells purification
SCF	PeproTech	250-03	phosphorylation stimulation
APC-Cy7 c-kit antibody	ThermoFisher	A15423	cell sorting
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	cell sorting
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	cell sorting
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	cell sorting
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	cell sorting
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	cell sorting
Spacer Plates with 1.0 mm Integrated Spacers	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	membrane blocking
serum	Atlanta Biologicals	A12450	medium supplement
cell counter	Invitrogen	AMQAF1000	cell counting
hemocytometer	ThermoFisher	S17040	cell counting
flim	Denville Scientific	E3012	signal detection
medical film processor	Konica	SRC-101A	signal detection
Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	Therom Scientific	34096	signal detection
Allegra X-15R Centrifuge (Rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	sample preparation
BLUEstain protein ladder	Gold Biotechnology	P007-500	electrophoresis
cell sorter	BD	FACSAria II	sample preparation
Incublock	Denville Scientific	I0510	electrophoresis