Identificazione di OTX1 e OTX2 come due possibili marcatori molecolari per carcinomi Sinonasal e Neuroblastomas olfattivi

Riepilogo

I geni homeobox sono geni regolatori spesso associati con i tumori negli organismi adulti. Abbiamo studiato la loro espressione comparativa di immunohistochemical e l'analisi di PCR in tempo reale, nelle mucose nasali normali ed infiammatorie e nei neoplasma sinonasal al fine di utilizzarli come possibili bersagli terapeutici e diagnostici.

Abstract

OTX geni homeobox (HB) sono espressi durante la morfogenesi embrionale e durante lo sviluppo dell'epitelio olfattivo negli organismi adulti. Mutazioni che accadono in questi geni sono spesso legate al tumorigenesis in essere umano. Non ci sono dati disponibili oggi per quanto riguarda la possibile correlazione tra geni OTX e tumori della cavità nasale. Lo scopo di questo lavoro è quello di capire se OTX1 e OTX2 può essere considerato come marcatori molecolari nello sviluppo dei tumori nasali. Abbiamo selezionato gli adenocarcinomi sinonasal e nasale per studiare l'espressione dei geni OTX1 e OTX2 attraverso analisi PCR in tempo reale e immunohistochemical. Sia OTX1 e OTX2 erano assenti in tutti i campioni di sinonasal intestinale-tipo adenocarcinomi (ITACs). OTX1 mRNA è stata identificata solo in adenocarcinomi di tipo Non-intestinali (NITACs) mentre OTX2 mRNA è stato espresso solo in Neuroblastomas olfattivi (ONs). Abbiamo dimostrato che l'espressione genica differenziale per geni OTX1 e di OTX2 potrebbe essere un utile marker molecolare per distinguere i diversi tipi di tumori sinonasal.

Introduzione

OTX Geni di HB sono l'omologo vertebrato dei geni orthodenticle Drosophila (otd) ed essi codificano per fattori di trascrizione che sono normalmente espressi durante la morfogenesi embrionale, ma possono anche essere espressi nell'organismo adulto con funzioni diverse . Durante lo sviluppo embrionale controllano la specifica di identità cellulare, differenziazione cellulare e il posizionamento del axis¹ corpo. La famiglia OTX comprende OTX1 e OTX2 geni che mostrano diverse funzioni. OTX1 è coinvolto nel cervello e sviluppo organo sensoriale. Nell'organismo adulto, è espresso in organi sensoriali e viene trascritto a bassi livelli nel lobo anteriore della ghiandola pituitaria²; svolge anche un ruolo nell'ematopoiesi, espresso in emopoietiche pluripotenti e di cellule progenitrici³. Otx2 è coinvolto nello sviluppo della testa rostrale e relativi atti di proteina tradotta come morfogeno perché genera un gradiente attraverso quali altri geni sono attivati o repressi in modo spazio-temporale, contribuendo così al cellulare proliferazione e differenziazione. Nell'organismo adulto, OTX2 si trova esclusivamente nella ghiandola pineale e del plesso coroidico⁴.

Mutazioni nei geni OTX sono spesso legate alla comparsa di difetti umani congeniti, somatiche o metabolici. Guadagno o perdita di mutazioni nei geni OTX potrebbero promuovere il tumorigenesis se non sono in grado di controllare adeguatamente la crescita e/o differenziazione cellulare⁵. Nelle leucemie e linfomi anche come in molti tumori solidi (ad esempio, medulloblastomi⁶, linfomi non-Hodgkin aggressivo², seno carcinoma⁷, cancri colorettali⁸e retinoblastoma⁹), il espressione diregolarizzata di geni HB OTX è ben documentato¹⁰. Inoltre, mutazioni di OTX2 sono state dimostrate nei casi di anoftalmia e microftalmia¹¹ a causa del ruolo cruciale per questo gene nel controllo dello sviluppo dell'occhio.

Nel contesto delle neoplasie solide, l'individuazione di marcatori molecolari e fenotipici è una sfida importante per la diagnosi, classificazione e trattamento di diversi tipi di tumore¹¹, compresi quelli che hanno origine nella cavità nasali e paranasali seni paranasali. Infatti, nonostante che queste aree occupano solo un modesto spazio anatomico, epitelio della mucosa, ghiandole, tessuti molli, osso, cartilagine o neurale/neuroectodermal e cellule del hematolymphoid possono essere spesso il sito per l'origine del complesso e istologicamente diverse gruppi di tumori. Diversi tipi di neoplasie che coinvolgono il tratto sinonasal presentano una varietà di caratteristiche che superare ciò che è veduto solitamente nel tratto aerodigestive superiore o anche durante la maggior parte delle parti del corpo¹². Le malignità sinonasal sono rare e presentano un'incidenza annuale di 1: 100 000 abitanti in tutto il mondo, e così questo impedisce studi per quanto riguarda le vie coinvolte nella tumorigenesi e la sperimentazione di strategie alternative di trattamento. Nonostante questo, i progressi nelle tecniche di imaging approcci chirurgici e la radioterapia hanno migliorato la gestione clinica di cancro sinonasal. Inoltre, lo sviluppo di linee cellulari e modelli animali nonché assetto genetico cancro attualmente costituiscono la base per le future terapie anticancro mirate¹³. Fin qui, ci sono rapporti per quanto riguarda OTX1 e/o OTX2 espressione nelle neoplasie della cavità nasale, seni paranasali e del nasopharynx. Dal momento che abbiamo precedentemente osservato che OTX1 e OTX2 sono coinvolti nel cancro di seno⁷, ci siamo chiesti se questi geni potrebbero essere presenti non solo nella mucosa nasale normale ma anche nei tumori della cavità nasale. Per raggiungere questo obiettivo che abbiamo ottenuto dal dipartimento di patologia di "Ospedale di Circolo" nei campioni di Varese di mucosa normale e adenocarcinomi sinonasal e nasale raccolti dal 1985 al 2012 e classificati secondo l'organizzazione mondiale della sanità (OMS) classificazione dei tumori di collo e testa. Scegliamo di analizzarli attraverso analisi in tempo reale di PCR e immunohistochemistry e abbiamo valutato l'espressione OTX1 e OTX2 per determinare se possono essere considerati marcatori molecolari per questi tipi di tumori.

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Protocollo

Tutti gli studi sono stati effettuati secondo la dichiarazione di Helsinki (1975) con il consenso informato scritto e approvato dal comitato etico dell'Università dell'Insubria di Varese.

1. raccolta dei campioni

1. Raccogliere e dividere tutti i campioni di Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) umano in diversi sottogruppi secondo la classificazione del WHO dei tumori di collo e testa¹⁴.
   Nota: Qui abbiamo utilizzato i seguenti campioni: mucosa normale sinonasal come controllo (10 campioni); Papilloma invertito (IP, codice ICD-O 8121/1); ITAC Sinonasal (codice ICD-O 8144/3, 32 campioni); NITAC (codice ICD-O 8140/3, 12 campioni); Carcinoma cistico adenoideo (CRNA, codice ICD-O 8200/3); Adenoma pleomorphic (PA, codice ICD-O 8941/3); (Codice ICD-O 9522/3, 13 campioni); Scarsamente differenziato Carcinoma neuroendocrino (PDNEC, codice ICD-O 8041/3, 19 campioni); Tumore neuroendocrino (NET, codice ICD-O 8041/3).

2. immunochimica

1. Sparaffinatura e reidratazione delle sezioni
   1. Riscaldare le diapositive di esempio in un forno a 60 ° C per 30 min e reidratare 3 µm sezioni spesse FFPE utilizzando una serie di alcool all'acqua.
   2. Brevemente lavare i vetrini in xilene per 10 min e ripetere questo passaggio; lavare i vetrini per 5 min in alcole a 100% e ripetere questo passaggio utilizzando alcol 95%, 85% e 75% in serie. Sciacquare i vetrini per 5 min in acqua distillata.
2. Bloccando l'attività endogena
   1. Bloccare l'attività endogena mettendo le diapositive in acquoso perossido di idrogeno 3% per 12 min.
3. Ricupero dell'antigene
   1. Eseguire ricupero dell'antigene trattando con 10 mM di tampone citrato (pH 6) per 10 min in un trattamento di microonda.
4. Incubazione con anticorpo primario
   1. Lavare le sezioni in tampone TBS (pH 7,4), quindi aggiungere la soluzione bloccante per 10 min.
   2. Lavare le sezioni in tampone TBS (pH 7,4), poi aggiungere 0,2% Triton X.
   3. Incubare per una notte a 4 ° C con capra anti-umani OTX2 anticorpo diluito 1: 100.
5. Incubazione con anticorpo secondario
   1. Incubare le sezioni per 1 h a temperatura ambiente con anticorpo secondario anti-capra diluito 1: 200 di biotinylated coniglio, seguita da ABC-perossidasi complesso (Vedi Tabelle materiali).
6. Sviluppando il immunoreaction
   1. Sviluppare il immunoreaction utilizzando 3, 3'-diaminobenzidina tetrahydrochloride e colorante di contrasto i nuclei con Harris Hematoxylin.
7. Montaggio e imaging
   1. Disidratare le sezioni utilizzando una mezzaluna alcool-scala e chiarirli utilizzando una sostanza di schiarimento di origine terpene (Vedi Tabella materiali). Incorporare sezioni in mezzo di montaggio, inserire le sezioni su un vetrino da microscopio e osservare le sezioni attraverso un microscopio ottico.

3. RNA estrazione e inversione-trascrizione

1. Estrazione del RNA
   1. Estrarre RNA da sezioni eseguendo la prima fase del protocollo di immunoprecipitazione (Vedi sezione 2.1) e tenere i vetrini in acqua distillata. Si sovrappongono le sezioni non macchiate con il corrispondente ematossilina-eosina macchiato sezioni al fine di identificare i frammenti di interesse.
   2. Eseguire l'estrazione di RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA commerciale per campioni FFPE (Vedi Tabella materiali) e le istruzioni del produttore riportato di seguito.
2. RNA d'inversione-trascrizione
   1. Utilizzare un kit commerciale per retro-trascrizione del RNA in cDNA (Vedi Tabella materiali) seguendo il protocollo. Retrò-trascrivere almeno 1.000 ng di RNA totale per eseguire diverse analisi.

4. Real-Time PCR e analisi dei dati

1. PCR in tempo reale
   1. Eseguire analisi PCR in tempo reale quantitative (qRT-PCR) con tecnologia basata su sonda (Vedi Tabella materiali) e un termociclatore.
2. Preparazione della miscela di reazione PCR
   1. Preparare la miscela di reazione PCR utilizzando 12,5 µ l di mix master basata su probe, 1.25 µ l di OTX1, OTX2 e ACTB sonde (vedere Tabella materiali), 50 ng di cDNA e nucleasi-free fino a 25 µ l di volume totale di acqua.
   2. Eseguire tutte le reazioni in triplice copia utilizzando il gene ACTB come il controllo endogeno per normalizzare i livelli di espressione genica.
   3. Centrifugare la piastra a 1.109 x g per 3 min e memorizzare la piastra riparo dalla luce a 4 ° C fino all'esperimento.
3. Impostazione del termociclatore
   1. Insieme al profilo del termociclatore con un avvio a caldo iniziale ciclo a 50 ° C per 2 min e 95 ° C per 10 minuti, seguiti da 40 cicli a 95 ° C per 15 s e un ciclo finale a 60 ° C per 1 min.
4. Analisi livello di espressione genica
   1. Normalizzare i livelli di espressione genica mediante il metodo di soglia (ΔCt) ciclo comparativa utilizzando il gene ACTB come il controllo endogeno.
   2. Valutare i livelli di espressione genica utilizzando il metodo 2^-ΔCt e rappresentare graficamente i risultati.
5. Analisi statistiche
   1. Eseguire analisi statistiche utilizzando di Student t-Test, considerando i risultati statisticamente significativi con p < 0.05.

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Risultati

Nella mucosa normale abbiamo osservato reattività nucleare forte ed omogenea per geni OTX sia nell'epitelio ciliated pseudostratified tipo respiratorio e nelle cellule ghiandolari submucosal (Figura 1A). Abbiamo trovato espressione nucleare per OTX1 in tutti i campioni di NITACs (Figura 1B), mentre poco o assente il immunoreactivity è stato evidenziato in ITACs (Figura 1). Immunoreactivity intenso ...

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Discussione

Questo studio dimostra per la prima volta che, sulla base dei livelli di mRNA, i geni di HB OTX1 e OTX2 sono espressi in mucosa normale sinonasal e ghiandole submucosal, polipi infiammatori, sinonasal Schneiderian papillomi e nelle diverse epiteliale e neuroectodermal neoplasie, compresi i carcinomi squamosi, adenocarcinomi sinonasal di tipo non-intestinale, i tumori delle ghiandole salivari-tipo, neoplasie neuroendocrine e ONs.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi:

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799