Analisi clonale di cellule embrionali staminali ematopoietiche precursori utilizzando indice della singola cella ordinamento combinato con cellule endoteliali nicchia co-cultura

Riepilogo

Qui presentiamo la metodologia per l'analisi clonale di cellule staminali ematopoietiche precursori durante lo sviluppo embrionale murino. Combiniamo Indice ordinamento delle singole cellule della regione di aorta-gonade-Mesonefro embrionale con co-coltura delle cellule endoteliali e trapianto per caratterizzare le proprietà fenotipiche e potenziale di attecchimento dei precursori ematopoietici singoli.

Abstract

La capacità di studiare la genesi di cellule staminali ematopoietiche (HSC) durante lo sviluppo embrionale è stata limitata dalla rarità dei precursori HSC nell'embrione precoce e la mancanza di saggi che funzionalmente identificare il potenziale di multilineage attecchimento a lungo termine di individuali presunti precursori HSC. Qui, descriviamo la metodologia che consente l'isolamento e la caratterizzazione dei precursori HSC funzionalmente validati a livello di singola cellula. In primo luogo, utilizziamo Indice ordinamento per catalogare il parametro fenotipico preciso di ciascuna cella individualmente ordinato, utilizzando una combinazione di marcatori fenotipici arricchire per precursori HSC con ulteriori indicatori per l'analisi sperimentale. In secondo luogo, è co-coltivata con lo stroma vascolare nicchia dalla regione dell'aorta-gonade-mesonephros (AGM), che sostiene la maturazione dei precursori HSC-di capacità di integrazione funzionale HSC con attecchimento multilineare, a lungo termine potenziale in ogni cella di indice ordinato saggi di trapianto. Questa metodologia consente la correlazione di proprietà fenotipiche dei precursori hemogenic clonale con il loro potenziale di attecchimento funzionale o altre proprietà quali profilo trascrizionale, fornendo un mezzo per l'analisi dettagliata del precursore HSC sviluppo a livello di singola cellula.

Introduzione

Clonali studi hanno rivelato eterogeneità nelle proprietà dell'attecchimento a lungo termine di HSCs adulto, fornendo informazioni nuovi sottotipi di HSC e cambiamenti nel comportamento HSC durante invecchiamento¹. Tuttavia, studi simili di HSCs embrionali e loro precursori sono stati più impegnativo. Durante lo sviluppo embrionale precoce, HSCs derivano da una popolazione di precursori noto come endotelio hemogenic in un processo transitorio di cui al come l'endoteliale a transizione ematopoietiche². Il primo HSC, definiti dalla loro capacità di fornire attecchimento multilineare robusto, a lungo termine dopo trapianto in destinatari adulti condizionati, non vengono rilevati fino a dopo giorno embrionale 10.5 (e 10.5) nell'embrione murino, a bassissima frequenza³ . Durante il loro sviluppo, precursori di HSC (pre-HSC) derivanti dall'endotelio hemogenic devono essere sottoposti a maturazione prima di acquisire la proprietà di HSC adulto che consentono per efficiente attecchimento nel trapianto saggi^{4,5 , 6}. oscurando lo studio rari HSC origine, una moltitudine di progenitori ematopoietici con degli eritrociti, mieloidi e linfoidi potenziale sono già individuati prima l'emergere di HSC da pre-HSC^7,8. Così, distinguendo pre-HSC da altri progenitori ematopoietici richiede metodi clonally isolare cellule e fornire loro i segnali sufficienti per la loro maturazione per HSC, per rilevare le loro proprietà di attecchimento in saggi di trapianto.

È state descritte una serie di approcci che consentono il rilevamento di pre-HSC di maturazione sia ex vivo o in vivo di HSC. Ex vivo metodi hanno dipendeva da coltura di tessuti embrionali, come la regione AGM, dove il primo HSC vengono rilevati in sviluppo⁹. Sulla base di questi metodi, protocolli che incorporano la dissociazione, l'ordinamento e ri-aggregazione dei tessuti AGM hanno permesso la caratterizzazione delle popolazioni ordinati contenenti precursori di HSC durante lo sviluppo da E9.5 per E11.5 in para-aortica Splanchnopleura (P-Sp) / AGM regioni^4,5,10; Tuttavia, questi approcci non sono suscettibili di analisi di alto-rendimento dei precursori a livello di singola cellula necessari per l'analisi clonale. Allo stesso modo, maturazione in vivo da trapianto in topi neonati, dove il microambiente è presunta per essere più adatto per il supporto delle precedenti fasi di precursori HSC, ha permesso anche gli studi delle popolazioni ordinati dal sacco vitellino e AGM / P-Sp (P-Sp è la regione di precursore per l'AGM) con caratteristiche di pre-HSC, ma questi metodi anche non riescono a fornire una piattaforma robusta per singola cella analisi^11,12.

Gli studi da Rienzi et al hanno dimostrato che quello stroma Akt-attivata delle cellule endoteliali (EC) può fornire un substrato di nicchia per il supporto dell'adulto HSC auto-rinnovamento in vitro^13,14,15. Abbiamo recentemente hanno determinato che la CE Akt attivato derivato dalla regione AGM (AGM-CE) fornisce una nicchia adatta in vitro per la maturazione dei precursori hemogenic, isolato più presto E9 in sviluppo, per HSC adulto-capacità di integrazione, così come la successiva auto-rinnovamento di generato HSC¹⁶. Dato che questo sistema utilizza una semplice 2-dimensionale co-coltura, è facilmente adattabile per analisi clonale del potenziale HSC di precursori hemogenic individualmente isolato.

Recentemente abbiamo segnalato un approccio di saggiare le potenzialità HSC di precursori hemogenic clonale combinando Indice ordinamento dei precursori hemogenic individuali da embrioni murini con AGM-CE co-cultura e successiva analisi funzionale nel trapianto analisi di¹⁷. Indice di ordinamento è una modalità di fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) che registra (indici) tutti i parametri fenotipici (cioè, parametri di forward scatter (FSC-A), side scatter (SSC-A), fluorescenza) di ciascuna cella individualmente ordinato tale che questi caratteristiche possono essere correlati in modo retrospettivo per successiva analisi funzionale seguendo l'ordinamento. FACS software registra sia informazioni fenotipiche per ogni cella e la posizione/pozzetto della piastra 96 pozzetti in cui è stato disposto. Questa tecnica è stata utilizzata precedentemente elegantemente per identificare eterogeneità nell'adulto HSC, determinare parametri fenotipici che ulteriormente arricchiscono per il sottoinsieme di attecchimento a lungo termine di HSC e correlano parametri fenotipici di HSC con trascrizionale Proprietà presso la singola cella livello^18,19. Qui, forniamo metodologia dettagliata di questo approccio che consente l'identificazione di parametri univoci fenotipici e contributi di lignaggio di pre-HSC durante le prime fasi dello sviluppo embrionale.

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Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Fred Hutchinson Cancer Research Center.

1. preparazione di monostrati AGM-CE per la co-cultura

1. 24 h prima della dissezione AGM e ordinamento, fare filtro sterilizzare e terreni di coltura AGM-CE.
2. Aggiungere la gelatina di 0,1% in acqua (100 µ l/pozzetto) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti aspirato la gelatina e lasciare il piatto in una cappa di coltura del tessuto con il coperchio rimosso fino a quando i pozzi sono asciutti.
3. Dissociare la strati monomolecolari AGM-CE e la piastra per piastre da 96 pozzetti.
   Nota: Mantenere l'AGM-CE, preparato come descritto in precedenza¹⁶, in terreni di coltura AGM-CE. Per coerenza, linee cellulari AGM-CE dovrebbero essere congelate appena sufficienti numeri sono ottenuti (generalmente passaggio 1-3) e utilizzate in un numero definito di passaggio (in genere il passaggio 5-12) per gli esperimenti di co-coltura. Linee cellulari AGM-CE sono derivate da C57BL/6J (CD45.2) AGM. Vedi la Tabella materiali per tutte le composizioni multimediali.
   1. Aspirare i media dalla cultura AGM-CE in un pallone da² di 75 cm e aggiungere 5 mL di PBS. Aspirare la PBS e aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina (Vedi Tabella materiali).
   2. Incubare a 37 ° C per 2-4 minuti fino a quando la maggior parte delle cellule sono sollevamento fuori la piastra. Aggiungere 7 mL di terreno di coltura di AGM-CE e dispensare 8 - 10 volte con una pipetta 10ml per preparare la sospensione di singole cellule e trasferire in una provetta da 15 mL.
   3. Girare a 300 x g per 5 min, rimuovere il supernatante, risospendere in terreni di coltura di 10ml AGM-CE e stimare il numero di cellulare con un emocitometro. Diluire le cellule ad una concentrazione di 1 x 10⁵ cellule/mL in terreni di coltura AGM-CE.
4. Aggiungere 100 µ l AGM-CE cella sospensione (1 x 10⁴ celle) in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti gelatinizzata. Posto in un 37 ° C, 5% CO₂ coltura tissutale incubatore durante la notte per consentire alla AGM-CE di allegare e formano un monostrato confluente.
   Nota: Distribuire uniformemente le cellule stromal AGM-CE c'è limitata crescita eccessiva o cella agglutinamento per ottima co-coltura.
5. Preparare il monostrato di AGM-CE per AGM co-culture.
   1. La mattina seguente, preparare i supporti di privo di siero AGM.
   2. Usando una pipetta multicanale 12-pozzetti, rimuovere il supporto di cultura AGM-CE da AGM-CE e aggiungere 200 µ l/pozzetto di media privo di siero AGM senza citochine per lavare qualsiasi supporto contenente siero residuo.
   3. Rimuovere il supporto e aggiungere 200 µ l/pozzetto di media privo di siero AGM con citochine. Lavorare velocemente quando si rimuove e aggiungendo il supporto in modo che lo strato endoteliale non è compromessa; ad esempio, rimuovere e aggiungere nuovamente una riga media in un momento. Posizionare le piastre da 96 pozzetti in coltura tissutale incubatore a 37 ° C fino a quando le cellule embrionali sono pronte per l'ordinamento.

2. preparazione della sospensione singola cella da tessuti embrionali murini

1. Sezionare l'AGM da accoppiamenti temporizzati.
   1. Impostare accoppiamenti temporizzati per la generazione di tessuti embrionali dell'età desiderata.
   2. Raccolta embrioni da femmine gravide al coitum dell'alberino di 9.5-11.5 giorni (dpc), a seconda della fase di pre-HSC per essere analizzati.
      Nota: Tessuti embrionali vengono raccolte da topi C57BL/6J (CD45.2) come descritto in precedenza e precisamente in fasi somite basata su conteggio¹⁶. Ci siamo concentrati sull'analisi delle popolazioni della regione di AGM embrionali e suo precursore, il P-Sp, tra E9.5 a E11.5, basata sulla stadiazione somite.
   3. Sezionare l'AGM da embrioni²⁰.
      Nota: Protocolli dettagliati per la dissezione dell'AGM da embrioni murini sono stati pubblicati da altri²⁰. In alternativa, vitellino o altri tessuti pretesi di avere attività pre-HSC potrebbero anche essere analizzati da questo metodo.
2. Dissociare i tessuti embrionali dissecati.
   1. Raccogliere i tessuti dissecati in una provetta conica da 15 mL contenente 10 mL di PBS con 10% FBS sul ghiaccio. Gravità stabilirsi tessuti, aspirare il PBS/FBS e quindi immediatamente aggiungere 1 mL di 0,25% collagenosi e posto in bagnomaria a 37 ° C per 25 min.
   2. Aggiungere 1 mL di PBS/10% FB e dispensare circa 20 - 30 volte con una punta di pipetta da 1 mL per ottenere una sospensione di singola cellula. Aggiungere un ulteriore 8 mL di PBS/10% FBS e cellule di centrifugare a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante.

3. anticorpo macchiatura delle cellule embrionali Murine

1. Preparare il tampone bloccante per la macchiatura dell'anticorpo.
   1. Aggiungere 10 µ g/mL anti-mouse CD16/CD32 (blocco del recettore (FcR) di Fc) e 1 µ g/mL DAPI (1 mg/mL di brodo in H₂O) a 1 mL di PBS con 10% FBS.
   2. Elaborare in una siringa da 3 mL e passare attraverso un filtro per siringa 0,22 µm per sterilizzare. Risospendere il pellet cellulare dai tessuti embrionali murini dissociati (dal punto 2.2.2) in 500 µ l blocco buffer e incubare in ghiaccio per 5 min.
2. Preparare il mix di anticorpo¹⁷.
   1. Aggiungere il blocco di FcR 10 µ g/mL a 1 mL di PBS con 10% FBS e 10 µ l di ogni anticorpo di anti-VE-caderina fluorocromo-coniugate (CD144, vedere la Tabella materiali) e dell'anticorpo anti-EPCR fluorocromo-coniugate (CD201, Vedi Tabella materiali). Utilizzare una diluizione finale di 1: 100 di anticorpi, se non diversamente indicato basata sulle raccomandazioni del produttore o secondo titolazioni.
      Nota: Questa combinazione di anticorpo viene utilizzata per la definizione di cancelli per l'ordinamento, come descritto di seguito (punto 4.2). L'ordinamento in base il co-espressione di VE-caderina ed EPCR consente un arricchimento significativo per la parte di cellule derivate da AGM che contiene attività di precursore HSC, come descritto in precedenza¹⁷.
   2. Aggiungere altri anticorpi fluorocromo-coniugate per ulteriore analisi fenotipica dei singoli precursori indice ordinato.
      Nota: Questi anticorpi non sono necessariamente utilizzati per la definizione di cancelli per l'ordinamento. In questo protocollo di campione, abbiamo incluso PE-coniugato anti-CD41 anticorpo e l'anticorpo coniugato FITC anti-CD45 per analizzare l'espressione relativa di questi marcatori ematopoietici, che evolvono durante l'emersione di pre-HSC dall'endotelio hemogenic^{4 ,5,16,17}. Altri markers di interesse possono essere incluse come desiderato. Campioni colorati con controlli di fluorocromo-coniugate dell'isotipo dell'anticorpo vengono utilizzati per definire gate di negativi e positivi per l'analisi.
   3. Redigere il mix di anticorpo in una siringa da 3 mL e passare attraverso un filtro per siringa 0,22 µm per sterilizzare. Aggiungere 500 µ l della miscela dell'anticorpo alla sospensione di cellule in tampone bloccante, pipetta per mixare e incubare in ghiaccio per almeno 15-20 min.
3. Lavare le cellule marcate.
   1. Aggiungere 8 mL PBS/10% FBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, aspirato e risospendere le cellule a pellet con 1 mL PBS/10% FBS.
   2. Rimuovere grumi di cellule pipettando sospensione delle cellule attraverso un tappo filtro di cella μm 35 su una provetta da 5 mL. Lavare il filtro cella con un ulteriore 3 mL PBS/10% FBS. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 min, aspirare, risospendere in 500 µ l PBS/10% FBS e metterli su ghiaccio fino al FACS.

4. Indice ordinamento dei precursori Hemogenic singolo 96-pozzetti con lo Stroma AGM-CE per la co-cultura

1. Preparare la macchina di FACS per modalità di piastra e allineare per l'ordinamento per piastre da 96 pozzetti secondo le istruzioni del produttore. Selezionare la modalità singola cella e indice ordinamento nel software per impostazioni di maschera di massima purezza e per consentire l'acquisizione di parametri di indice per ogni cella ordinato.
2. Acquisire un campione di cellule dall'anticorpo macchiato campioni per impostare le porte per l'ordinamento.
   1. Caricare il campione di cellule macchiato sulla macchina FACS e acquisire le cellule alla minima portata. Plot FSC-A versi SSC-A e selezionare un cancello che include celle di varie dimensioni (Figura 1B) (che si basa sull'osservazione che attività di pre-HSC è identificato in cellule di profili di diverse dimensioni a AGM¹⁷). Trama: FSC-A versi FSC-W e SSC-A versi SSC-W e selezionare cancelli per escludere doppietti. Poi tracciare FSC-A versi DAPI a cancello cellule vive (negative per DAPI) (Figura 1B).
   2. Trama PECy7 (o il fluorocromo pertinente per la macchia di VE-caderina) contro PerCP (o il fluorocromo pertinente per la macchia EPCR). Le cellule che sono positive per VE-caderina (che comprende una popolazione mista di cellule endoteliali come progenitori ematopoietici e pre-HSC da AGM) e che hanno alta espressione EPCR (che arricchisce per pre-HSC dal P-Sp/AGM¹⁷) del cancello. Questa è la porta finale che verrà utilizzata per indicizzare sorta singole cellule in fase 4.3 (Figura 1B).
   3. Trama fluorocromi aggiuntivi utilizzati per la colorazione.
      Nota: A seconda la sottopopolazione per essere analizzati, porte aggiuntive possono essere impostate in base sulla rilevazione di altri marcatori incluso per la macchiatura delle celle. Tuttavia, l'ordinamento indice permette di registrare i parametri fluorescenti per ogni cella ordinato tale che questi parametri possono essere analizzati in modo retrospettivo. Così, ulteriori gating non è necessario a questo punto. Per tutte le impostazioni di FACS, campioni macchiati con gli anticorpi singoli devono essere utilizzati per regolare la compensazione, per tenere conto di ricaduta nell'emissione dei fluorocromi sovrapposti e con gli anticorpi di controllo isotipo, al conto per una colorazione di fondo e determinare cancelli di negativo/positivo.
3. Indice di ordinare le celle AGM.
   1. Posto una piastra a 96 pozzetti preparata con lo stroma di AGM-CE in media senza siero AGM con citochine (dal punto 1.5.3) nel blocco piastra del sorter FACs. Caricare l'esempio e iniziare l'acquisizione del campione. Selezionare la modalità di ordinamento/singola cella di indice e iniziare sortingsingle cellule individuali 96-pozzetti. Utilizzare il più basso tasso di flusso per ridurre al minimo la sollecitazione di taglio sulle cellule embrionali.
   2. Garantire che tutti gli eventi vengono registrati durante l'ordinamento di indice. Ciò consentirà di enumerazione del numero totale delle cellule analizzate nel cancello ordinamento relativo per l'effettivi numeri ordinato ai singoli 96-pozzi, come non tutti gli eventi registrati verranno ordinati per pozzi.
   3. Una volta che le cellule sono state ordinate per un'intera piastra a 96 pozzetti, posizionare la piastra in un incubatore di coltura del tessuto a 37 ° C, impostato al 5% CO₂. Ripetere per piastre aggiuntive richieste per ogni esperimento.
   4. Cellule di co-coltura individualmente ordinato a 96 pozzetti contenenti AGM-CE (dal punto 4.3) fino a 7 giorni (5 giorni per le celle filtrate dagli embrioni E11-11.5, 6 giorni da embrioni E10-10.5, 7 giorni da embrioni E9-9.5). Visualizzare colonie ematopoietiche di varie dimensioni e morfologie con un microscopio invertito a 100 ingrandimenti (Figura 2B) dopo il periodo di co-coltura.
      Nota: I media non ha bisogno di essere cambiato durante il periodo di co-coltura. Ordinato hemogenic precursori inizialmente possono integrare il livello di AGM-CE con una morfologia simile a CE e non possono essere inizialmente distinto dallo stroma AGM-CE (Figura 2A). Tuttavia, seguenti 24-48h in co-coltura, piccola, arrotondate cellule ematopoietiche o mazzi delle cellule possono essere rilevati. Alla fine di co-coltura (5-7 giorni), diverse colonie di cellule ematopoietiche possono essere visualizzati nel sottoinsieme di 96-pozzi che ha ricevuto un'ordinata delle cellule con potenziale ematopoietico clonale. Se visivamente ispezionati pozzetti contengono più di una colonia distinto, quindi in questo esempio viene escluso dall'analisi a valle per escludere campioni che potrebbero aver ricevuto più di una cella ordinata per pozzetto.

5. analisi della progenie ematopoietici clonali dopo co-coltura

1. Cloni di raccolto da ogni 96 pozzetti per analisi al FACS.
   1. Vigorosamente dispensare a dissociare le cellule ematopoietiche da strati endothelial usando una pipetta multicanale con punte di pipetta 200 µ l. Cercate di non dissociare lo strato endoteliale. Rimuovere 100 µ l (~ 50% del campione) per analisi fenotipica di ematopoietico progenie di FACS.
   2. Versare in un piatto fondo V 96 pozzetti e centrifugare a 300 x g per 2 min agglomerare le cellule. Rimuovere il supporto scorrendo media dalla piastra con un unico movimento rapido, mentre la piastra è invertita (Scorri la piastra).
   3. Inserire le celle rimanenti 100 µ l nell'originale piastra a 96 pozzetti in un uso di incubatorfor di 37 ° C nel dosaggio successivo attecchimento (passaggio 6).
2. Incubare le cellule con gli anticorpi adatti per analisi ematopoietico.
   1. Risospendere il pellet cellulare in ciascun pozzetto di una carena a V-96 pozzetti con 50 µ l di PBS/2% FBS contenente 10 µ g/mL FcR blocco e 1 µ g/mL DAPI. Incubare la piastra a 4 ° C per 5 min.
   2. Aggiungere 50 µ l di PBS/2% FBS contenente il blocco di FcR 10 µ g/mL e un mix di anticorpo per analisi HSC contenente PE-Cyanine7-coniugato anti-VE-caderina, PerCP-coniugati anti-CD45, PE-coniugato anti-EPCR, APC-coniugato anti-Sca1 e FITC Coniugato anti-Gr1 e anti-F4/80 (ogni anticorpo a diluizione finale di 1: 100 se non diversamente indicato basato sulle raccomandazioni del produttore o secondo titolazioni). Incubare la piastra a 4 ° C per almeno 20 min.
3. Rimuovere l'anticorpo non legato con diluizioni sequenziale e analizzare le cellule.
   1. Aggiungere 200 µ l/pozzetto PBS/2% FBS e centrifugare a 300 x g per 2 min agglomerare le cellule. Quindi, scorri la piastra per scartare il surnatante e aggiungere 200 µ l PBS/2% FBS ad ogni pellet cellulare e centrifugare a 300 x g per 2 min agglomerare le cellule.
   2. Scorri a piastra per scartare il surnatante e aggiungere 50 µ l/pozzetto PBS/2% FBS per l'analisi. Procedere per analizzare le cellule di FACS utilizzando un citometro a flusso dotato di un lettore di piastra.
      Nota: Acquisire un volume fisso di cellule (ad es., 35 µ l del totale 50 µ l utilizzato per risospensione) per enumerare i sottoinsiemi della progenie ematopoietico.
4. Analizzare i dati di FACS per ciascun pozzetto contenente ematopoietiche progenie alla schermata per le colonie che contengono potenziali HSC (Figura 3).
   1. Cancello in primo luogo la popolazione di CD45 positiva che è negativa per gli indicatori mieloidi Gr1 e F480. Non cancello le cellule che ancora esprimono bassi livelli di VE-caderina. Cellule dallo strato AGM-CE che sono interrotti durante la vendemmia delle colonie ematopoietiche sono VE-caderina positivo e negativo di CD45.
   2. Gate CD45⁺VE-Cad^{- / low}Gr1 cellule F4/80^{– –}più avanti il sottoinsieme che esprimono alti livelli di EPCR e Sca1 (Figura 3A -C).
      Nota: In studi precedenti, colonie carente di cellule con CD45⁺VE-Cad^{- / low}Gr1^––F4/80 Sca1^CiaoEPCR^Ciao fenotipo (Figura 3D) riproducibile non è riuscito a fornire rilevabile attecchimento multilineare sangue periferico in topi irradiati destinatario¹⁷ (dati non mostrati); così, queste colonie non devono essere inclusi nell'analisi successivo trapianto nel passaggio 6.

6. analisi delle proprietà di Engraftment di singoli cloni e correlazione con proprietà fenotipiche delucidato da indice di ordinamento

1. Il giorno della (se possibile) o la mattina seguente l'analisi fenotipica nel passaggio 5, ri-sospese le restanti cellule µ l 100 da ogni 96 pozzetti contenenti colonie ematopoietiche dopo co-coltura (dal passaggio 5.1) pipettando vigoroso utilizzando una punta di pipetta 200 µ l.
2. Preparare e aggiungere celle di salvataggio intero midollo osseo del ceppo Congenici B6. SJL-Ptprc^unPepc^b/BoyJ (B6 CD45.1) topi adulti^16,17.
   1. Contare le cellule nucleate del midollo osseo in soluzione turchi sotto un emocitometro. Diluire a una concentrazione di 5 x 10⁵ nucleate cellule/mL in PBS con 2% FBS.
   2. Aggiungere 100 µ l di cellule del midollo osseo di salvataggio (5 x 10⁴) ad ogni pozzetto contenente ematopoietiche progenie per analisi di trapianto e Miscelare pipettando.
3. Progenie di trapianto dei singoli cloni in un unico irradiati letalmente destinatario Congenici ceppo B6. SJL-Ptprc^unPepc^btopo adulto di /BoyJ (CD45.1 B6).
   1. Letalmente irradiano lo stesso numero di topi B6 CD45.1 come il numero di cloni per iniettare individualmente la progenie di un singolo clone (utilizzando cGy 1.000 da una fonte di cesio).
   2. Disegnare 200 sospensione totale delle cellule di µ l (questo include le cellule dal clone così come cellule del midollo osseo di 5 x 10⁴ B6 CD45.1 soccorso) in una siringa di insulina ½ mL con ago 29 G ½ pollice.
   3. Letalmente irradiare B6 CD45.1 destinatari adulti 2-24 h prima all'iniezione.
   4. Utilizzando un dispositivo di ritenuta di plastica del mouse che consente l'accesso di coda, iniettare tramite il volume di 200 µ l della vena della coda contenente entrambe le cellule da ogni clone e 5 x 10⁴ B6 CD45.1 del midollo osseo adulto le cellule soccorso per aiutare nella sopravvivenza destinatario.
   5. Marchio auricolare e pesare i topi destinatari e controllare il loro peso/salute a intervalli regolari (ad esempio, 3 - 4 volte / settimana post trapianto di irradiazione, o per individuali e istituzionali delle procedure operative standard) per garantire una buona salute.
4. Eseguire analisi di engraftment di sangue periferico ad intervalli regolari (ad es., 2, 16, 24 settimane) dopo trapianto.
   1. Rimuovere il 50-100 µ l di sangue tramite retro-orbitale sanguinare o un altro metodo di locazione sangue eticamente approvati.
   2. Aggiungere 3 mL di tampone di lisi (16,6 g NH₄Cl, 2 g NaHCO₃ e mg 74,4 EDTA a L 2 H₂O) al sangue e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare a 300 x g per 5 min, aspirato e risospendere il pellet con 2 mL PBS/2% FBS. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
   3. Risospendere il pellet con blocco FcR di 150 µ l PBS/2% FBS contenente 10 µ g/mL e 1 µ g/mL DAPI e versare 1/3 del volume da un contenente controlli di isotipo 50 µ l per donatore e lignaggio, 1/3 ad un anticorpo contenente 50 µ l per donatore e isotype controlli per lignaggio e 1/3 ad un pozzo contenente 50 µ l anticorpi per rilevare donatore e del lignaggio.
      Nota: Gli anticorpi per il rilevamento di attecchimento multilineare: APCeFluor780-coniugato anti-CD45.2, Pe-Cyanine7-coniugati anti-CD45.1, FITC Coniugato anti-CD3, PE-coniugato anti-F4/80, PerCP-coniugato anti-Gr1 e APC-coniugato anti-CD19, o isotype pertinenti controlli.
   4. Identificare cloni con attecchimento a lungo termine per valutare il contributo di sangue periferico da FACS nel tempo di CD45.2 (donatore)-derivato cellule ematopoietiche mieloidi (Gr1 e/o F4/80 positivo), delle cellule di B (CD19 positiva) e cellule T (CD3 positivi) (Figura 4A -B).
      Nota: Engraftment ematopoietico può essere analizzato anche da CD45.2 (donatore)-derivato contributo alle popolazioni ematopoietiche da tessuti raccolte da midollo osseo, milza, timo e peritoneo, o a seguito di trapianto secondario delle cellule del midollo osseo nei topi di B6 CD45.1 per analizzare seriale engraftment proprietà¹⁷.
5. Correlare il proprietà fenotipiche di ogni clone come determinato dall'indice iniziale singola cella ordinamento con le sue proprietà di attecchimento. Utilizzando software di analisi di flusso, caricare i parametri di ordinamento per ogni cella di indice ordinato (correlato al 96-pozzo a cui è stato risolto). Mappa dati funzionali su diagrammi di flusso per valutare le proprietà fenotipiche delle singole cellule in relazione alla loro uscita funzionale (ad esempio, attecchimento a lungo termine, multilineare) (Figura 4).

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Risultati

Figura 1A Mostra un schema di disegno sperimentale. Una volta tessuti P-Sp/AGM sono dissecati, riuniti e dissociate in collagenasi, sono macchiati con gli anticorpi al VE-caderina ed EPCR indice dell'ordinamento. Pre-HSC sono arricchiti in cellule ordinate alla VE-caderina⁺EPCR^alta (Figura 1B). È possibile includere in modo retrospettivo analizzare parametri fenotipici aggiuntivi, che vengono registrati per...

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Discussione

Lo studio della Genesi HSC durante lo sviluppo embrionale necessita di mezzi per rilevare potenziali dei precursori hemogenic ancora manca la competenza per fornire a lungo termine multilineare ricostituzione ematopoietica nei destinatari adulti trapiantati HSC. In questo protocollo, presentiamo un'analisi clonale dei precursori embrionali hemogenic da co-stromal coltura su nicchia vascolare ECs da AGM, che sostiene la maturazione dei precursori di HSC, con successiva analisi funzionale in saggi di trapianto. Incorporazi...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AGM-EC culture media
Materials for culture of endothelial cells
TrypLE Express	Gibco	12605-028	Use to dissociate AGM-EC monolayers
Gelatin 0.1% in water	StemCell Technologies	7903	Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic
96-well tissue culture plates	Corning	3599	Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Use for dissection and FACS staining
500 ml filter bottles	Fisher Scientific	9741202	Use to sterile filter Endothelial media
AGM-EC culture media (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	12440-053	400 mls
Hyclone Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	SH30088.03	100 mls
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	5 mls
Heparin	Sigma	H3149	50 mg dissolved in 10 mls media
L-glutamine (200 mM)	StemCell Technologies	7100	5 mls
Endothelial Mitogen (ECGS)	Alfa Aesar	J64516 (BT-203)	Add 10 mls media to dissolve and add
Materials for AGM index sort
Collagenase (0.25%)	StemCell Technologies	7902	Use for dissociation of embryonic tissues
3ml syringe	BD Biosciences	309657	Use to sterile filter antibody solutions for FACS
0.22 µM syringe-driven filter	Millipore	SLGP033RS	Use to sterile filter antibody solutions for FACS
5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap	Corning	352235	Use to remove cell clumps prior to FACS
DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O)	Millipore	268298	Use to exclude dead cells from sort
anti-mouse CD16/CD32 (FcR block)	BD Biosciences	553141	Use to block non-specific staining to Fc receptors
Antibodies for AGM index sort
Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7	eBioscience	25-1441-82	Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4301-81	Isotype control for CD144 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710	eBioscience	46-2012-80	Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710	eBioscience	46-4031-80	Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710
Anti-mouse CD41 PE	BD Biosciences	558040	Staining
Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE	BD Biosciences	553925	Isotype control for CD41 PE
Anti-mouse CD45 FITC	eBioscience	11-0451-85	Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC	eBioscience	11-4031-81	Isotype control for CD45 FITC
AGM-serum free media (10mls)
X-Vivo 20	Lonza	04-448Q	10 mls
recombinant murine stem cell factor (SCF)	Peprotech	250-03	10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L)	Peprotech	300-19	10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml
recombinant human thrombopoietin (TPO)	Peprotech	300-18	2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
recombinant murine interleukin-3 (IL3)	Peprotech	213-13	2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml
Materials for Staining co-cultured cells
96 well plate, V-bottom	Corning	3894	Use for FACS analysis
Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells
Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5	eBioscience	45-0451-82	Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5	eBioscience	35-4031-80	Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5
Anti-mouse CD201 (EPCR) PE	eBioscience	12-2012-82	Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE	eBioscience	12-4031-81	Isotype control for CD201 PE
Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC	eBioscience	17-5981-83	Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC	eBioscience	17-4321-81	Isotype control for Ly-6A/E APC
Anti-mouse F4/80 FITC	eBioscience	11-4801-81	Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC	eBioscience	11-4321-41	Isotype control for F4/80 FITC
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC	BD Biosciences	553127	Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC	BD Biosciences	556923	Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC
Materials for tail vein injection for transplant
1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles	BD Biosciences	309306	Use for tail vein injection for transplantation
Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant
Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP	Biolegend	108426	Staining
Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP	Biolegend	400629	Isotype control for Ly-6G/C PerCP
Anti-mouse F4/80 PE	eBioscience	12-4801-82	Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE	eBioscience	12-4321-80	Isotype control for F4/80 PE
Anti-mouse CD3 FITC	BD Biosciences	555274	Staining
Anti-mouse CD19 APC	BD Biosciences	550992	Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC	BD Biosciences	553932	Isotype control for CD19 APC
Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7	eBioscience	25-0453-82	Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-81	Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780	eBioscience	47-0454-82	Staining
Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780	eBioscience	47-4321-80	Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II with DIVA software	BD Biosciences
BD FACSCanto II with plate reader	BD Biosciences
Haemocytometer	Fisher Scientific	S17040	For counting cells
Multi-channel pipette	Fisher Scientific	14-559-417	For dispensing cells
FACS analysis software	FlowJo/BD Biosciences		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo