Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

Riepilogo

Descriviamo l'evoluzione di un modello tridimensionale, basato su sferoide in vitro che permette di testare l'attuale standard di regimi di terapia sperimentale per testa e collo carcinoma di cellule squamous su linee cellulari, che mira a valutare la terapia suscettibilità e resistenza su cellule primarie dagli esemplari umani in futuro.

Abstract

Opzioni correnti di trattamento per avanzati e ricorrente di testa e collo carcinoma di cellule squamous (HNSCC) racchiudono radiazione e approcci chemio-radioterapia con o senza la chirurgia. Mentre i regimi di chemioterapia platino-basata attualmente rappresentano il gold standard in termini di efficacia e sono indicati nella maggior parte dei casi, i nuovi regimi di chemioterapia, vale a dire l'immunoterapia stanno emergendo. Tuttavia, i tassi di risposta e meccanismi di resistenza di terapia per entrambi il regime chemio sono difficili da prevedere e rimangono insufficientemente capiti. Ampie variazioni dei meccanismi di resistenza di chemio e radiazioni sono noti fino ad oggi. Questo studio descrive lo sviluppo di un test standardizzato, ad alta produttività in vitro per valutare la risposta di linea HNSCC cellulare ai vari regimi di terapia e, auspicabilmente, su cellule primarie da singoli pazienti come un futuro strumento per tumore personalizzato terapia. Il dosaggio è stato progettato per essere integrato nell'algoritmo standard di qualità controllata per pazienti HNSCC presso il nostro centro di cura terziario; Tuttavia, questo sarà oggetto di futuri studi. Fattibilità tecnica sembra essere molto promettente per cellule primarie da biopsie del tumore dai pazienti reali. I campioni sono poi trasferiti in laboratorio. Le biopsie sono separate meccanicamente seguita da digestione enzimatica. Le cellule vengono poi coltivate in flaconi di coltura cellulare ultra-bassa adesione che promuovono la formazione riproducibile, standardizzata e spontanea dei conglomerati di cella tridimensionale, a forma di sferoide. Sferoidi sono pronti per essere esposti a protocolli di chemio-radioterapia e protocolli di immunoterapia come necessario. La dimensione di vitalità e sferoide di cella finale sono indicatori di suscettibilità di terapia e di conseguenza potrebbe essere disegnato in considerazione in futuro, per valutare la risposta probabile terapia dei pazienti. Questo modello potrebbe essere uno strumento prezioso, costo-efficiente verso una terapia personalizzata per il cancro del collo e della testa.

Introduzione

Carcinoma di cellule squamous di testa e del collo (HNSCC) è il sesto più comune cancro in tutto il mondo con un'incidenza aumentante della patogenesi associata a infezione mucosa papillomavirus umano (HPV), accanto a una maggioranza dei casi causati dall'alcol e nicotina eccessiva consumo di ^1,2. Mentre più piccoli tumori e fasi pre-invasive sono di solito ben curabile con l'asportazione chirurgica, di solito combinata con la dissezione di linfonodo cervicale, trattamento per stadio avanzato e ricorrenti HNSCC rimane impegnativo a causa dell'invasione del tumore aggressivo con la diffusione metastatica e resistenza alla radiazione e chemioterapia protocolli^3,4,5,6,7,8. Gli studi recenti suggeriscono un'alta variabilità del fenotipo cellulare e sub-caratterizzazione di circolazione e le cellule del tumore diffuso è appena iniziata^9,10. La precedente convinzione di un tumore solido, uniforme massa ha dovuto essere rivisto alla luce di recenti studi in passato anni^11,12,13,14. Approcci attuali per la caratterizzazione del tumore e l'identificazione di mutazioni chiave potrebbero identificare numerosi geni che sembrano essere associati con resistenza di terapia ma rimangono un approccio costo elevato. Inoltre, conoscenza del genotipo non consente necessariamente una previsione affidabile del fenotipo e la sua risposta al trattamento.

Ci sono stati pochi progressi nel miglioramento della sopravvivenza globale e libera da malattia per malattia in stadio avanzato e ricorrente. Per nicotina - così come carcinoma virus-collegato, le opzioni correnti di trattamento oltre ambulatorio racchiudono aggressivo radiazione e chemioterapia platino-basata. Ci sono state conseguenze per i tassi di risposta diversa fra carcinoma HPV-negativi e positivo; Tuttavia, questo non ha ancora portare a un cambiamento in generale le linee guida di terapia. Resistenza nei confronti di radiazione e la chemioterapia è un fenomeno diffuso in tutte le fasi del tumore ed esiste per chemioterapia platino-basata anche per quanto riguarda la terapia mirata (Anti-EGFR; ricevitore di fattore di crescita epidermico) e recentemente emergenti checkpoint inibizione¹⁵. Chemioterapia e radioterapia inefficace hanno un costo elevato di morbosità significativa paziente in termini di disfagia, mucosite, secchezza delle fauci e rischio di diminuzione della funzione renale o cardiaca, tra gli altri. Prima risposta di terapia di predizione della decisione di un concetto di terapia generale per ogni singolo paziente sembra essere l'obiettivo cruciale, impedire il trattamento inutile concetti, effetti collaterali e costi.

Abbiamo cercato di stabilire un modello per testare SUSCETTIBILITA trattamento del singolo paziente attuale chemio-radioterapia standard che poteva essere integrata nell'algoritmo di trattamento oncologico regolari e qualità controllata da un punto di tecniche in piedi. L'obiettivo lontano era quello di utilizzare il modello senza utilizzare linee cellulari pesantemente alterato e invecchiato, come scarsamente rappresentano le cellule di tumore umano effettivo senza loro variabilità ed eterogeneità come la conosciamo ora, mentre l'istituzione del protocollo è stato fatto in varie linee cellulari. Per essere indipendente solo da linee cellulari disponibili in commercio, abbiamo generato recentemente con successo una linea di cella intermedio chiamata "PiCa" da cellule primarie di HNSCC da esemplari del tumore umano con markers cellulari conservato il suoi passaggi superficiale e limitate ¹⁶. linea cellulare questo PiCa dovrebbe servire come preparazione per lo sviluppo del modello sulla strada per poi successivamente seguendo studi con cellule tumorali umane fresche da biopsie del tumore. È stato dimostrato che cellule nella cellula tridimensionale culture reagiscono in modo diverso e più in vivo-come per la somministrazione di farmaci di cancro rispetto a quelli che crescono in strati monomolecolari^{17,18,19,20 ,21}, principalmente a causa della conservazione dei migratori e proprietà Sub-differenziazione di alcune cellule sottoinsiemi^22,23,24. Qui, descriviamo il protocollo di un modello tridimensionale, basato su sferoide da linee cellulari intermedi e modi e cellule di carcinoma di cellule squamous umano primario come integrano tale modello nel trattamento del cancro del collo e della testa chirurgo e oncologo ( Figura 1).

Protocollo

Tutti gli studi indicati in questo manoscritto, vale a dire l'uso degli esemplari del tumore umano, sono protetti sotto e nel consenso con decisioni precedenti da Università di medicina di Mainz/Università di Monaco di Baviera, centro medico etico. I pazienti hanno dato il consenso informato secondo le linee guida legali nazionali, accettando di uso scientifico degli eccessi di materiale biologico che è stato ottenuto nel corso del loro trattamento. Ricerca è stata eseguita nel rispetto di tutte le linee guida istituzionali, nazionali ed internazionali per il benessere umano.

1. prendere una biopsia del tumore dalla testa e Carcinoma di cellule Squamous Heck

1. Eseguire generale (propofol e/o sevoflurane, agente di rilassamento muscolare) o infiltrazione locale (2% ultracaine, adrenalina) / superficie (xylocaine) anestesia in sala operatoria o otorinolaringoiatria sedia esame. Visualizzare la massa tumorale in orale cavità/faringe/laringe/altre parti del tratto digerente e respiratorio superiore con strumenti di funzionamento standard e, se necessario, sotto il microscopio.
2. Prendere una biopsia del tumore fresco dalla periferia della lesione cancerogena con strumenti contundenti o taglienti. Evitare il centro della lesione dovuto necrosi abbondante in questa zona. Mettere il tessuto ottenuto in un contenitore sterile con soluzione salina isotonica.
3. Dopo la biopsia, eseguire l'emostasi come necessario, ad es., con un dispositivo di coagulazione monopolare o bipolare oltre all'uso di sostanze vasocostrittori.
4. Portare la biopsia del tumore può essere utilizzato per esperimenti di coltura cellulare direttamente al tratto di laboratorio adiacente. Invia altre le biopsie del tumore per il patologo come al solito per escludere il cancro.
5. Assicurarsi che un tecnico di laboratorio è pronto a trattare il campione direttamente.

2. trattamento del campione di tumore

1. Posizionare l'esemplare del tumore su una superficie adatta e sterile e tagliare accuratamente con un bisturi monouso sterile in pezzi il meno possibile.
   Attenzione: Assicurarsi che lo stato di malattie infettive ed ematica è ben documentato e il tecnico è in attenzione delle istituzioni standard protocolli per impedire ad aghi bastone o lesioni di taglio con potenzialmente materiale paziente di rischio biologico e la protocolli da seguire dopo possibili lesioni.
2. Dopo una separazione meccanica sufficiente del tessuto primario, mettere il tessuto in un flaconcino contenente collagenasi I / II e incubare per 1h a 37 ° C. Passare al setaccio attraverso un colino di cella di 70 µm falcon e lavare la sospensione con soluzione salina bilanciata Hanks' (HBSS).
3. Dopo la riuscita separazione e lavaggio successivo, posizionare la sospensione contenente 1-2 × 10⁶ cellule in un matracci di cultura di cellule (75 cm²) T75 a crescere a sub-confluency 5% CO₂ e temperatura di 37 ° C. Questo passaggio potrebbe richiedere fino a 10 giorni.
   1. Utilizzare speciali dei cheratinociti terreno di coltura costituito da quanto segue: 125 mL di Dulbecco modificato medio eagles (DMEM), 250 mL di Keratinocyte completato medio (medio integrato composto da 500 mL di Medium di SF del Keratinocyte, 15 mg di ipofisi bovina estrarre (BPE), 2,5 mL di penicillina/streptomicina, 150 ng umano ricombinante fattore crescita epiteliale (EGF), 516 µ l di 300 mM CaCl₂, stock mix per essere preparati in anticipo), 125 mL di miscela nutriente di F12, 10 mg di BPE (0,75 mL), 75 ng EGF umano ricombinante (2 µ l) , 3,75 mL 200 mm L-alanil-L-Glutamin-Dipeptide (tabella materiali).

3. le cellule di semina in piastre per colture cellulari ultra-bassa adesione

1. Confermare la crescita delle cellule tumorali al microscopio. Contare le celle in cultura (primaria o colture cellulari) e seme 5.000 cellule primarie del tumore o 1.000-2.000 cellule della linea cellulare intermedio / altra linea cellulare a 200-300 µ l di media (punto 3.2.) in un piatto ultra-bassa adesione concavo, rotondo bottoms (96-well).
2. 1% della coltura le cellule al 5% CO₂ a 37 ° C e in mezzo a parti uguali DMEM e delle vie respiratorie delle cellule epiteliali (BEGM), 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina/streptomicina, piruvato di sodio 1%, 1% non essenziali aminoacidi, L-Glutammina (punto 2.3.). Se vengono utilizzate linee cellulari, media sulla base di DMEM è sufficiente.
   1. Eseguire modifiche di supporto ogni altro giorno. Prestare attenzione a non aspirare la sferoide con la pipetta durante i cambi di mezzi. Fino a quando il livello di crescita della coltura sferoidi come descritto al punto 3.3 è raggiunto (circa 7-10 giorni).
3. Confermare la formazione spontanea della sferoide al microscopio cercando di conglomerati di cella tridimensionale, a forma di sferoide. Escludere i pozzetti con irregolare e/o formazione di sferoide multipla da ulteriori indagini.
   Nota: Sferoidi dovrebbero essere visibile ad occhio nudo, troppo, facilitare l'ulteriore elaborazione e modifiche di supporto come descritto di seguito.

4. esporre sferoidi alla terapia multimodale del tumore Standard o sperimentali

1. Scegliere un regime di terapia desiderata. Progettazione di gruppi di controllo sufficientemente grande che consentono confronti dei trattamenti di sferoidi non trattate o sferoidi che ricevono solo i regimi di terapia parziale, ad es. radiazione da solo. La dimensione dei gruppi di controllo dipende dalla progettazione del gruppo sperimentale e non può essere definita universalmente.
2. Scambiare i mezzi di comunicazione ai media con additivi, significato media con chemioterapici e/o anticorpi monoclonali alle concentrazioni desiderate. Aggiungere cisplatino alle concentrazioni di 2.5/5/10 µM o 5-fluoruracil (5FU) a 30 µM.
   Nota: Per esperimenti di throughput elevato o grande gruppo dimensioni/grande numero di gruppi, uno può utilizzare un robot di pipettaggio automatizzato come stiamo stabilendo ulteriormente negli esperimenti.
3. In alternativa, irradiare le piastre per colture cellulari con sferoidi a 2 Gy usando un impianto di irradiazione adatto.
   Attenzione: Rispettare protocolli dell'istituzione per quanto riguarda la prevenzione dell'esposizione di radiazioni nocive dei dipendenti. Funziona solo con i tecnici designati e addestrati secondo le linee guida di protezione di radiazione. Se lo si desidera, aggiungere chemioterapici come descritto sotto 4.2. in seguito.
4. Incubare le cellule per 24 h in condizioni di coltura precedentemente descritti (37 ° C, punto 3.2).
5. Dopo l'incubazione, continuare la coltura delle cellule per almeno 6 giorni con le modifiche di supporto ogni altro giorno.

5. valutazione della sferoide formato ed il limite di proliferazione cellulare per test lettura

1. Misurare la dimensione di sferoide in termini di superficie dopo documentazione fotografica digitale il giorno 6 (giorno 10, giorno 16) con un software di grafica (parametro 1).
2. Dopo centrifugazione a 520 x g per 2,5 min della piastra, eliminare il surnatante. Lavare le cellule con sufficiente quantità di 1X PBS e centrifugare che la piastra nuovamente come descritto, seguita da rimuovendo il surnatante (PBS).
3. Aggiungere 100 µ l di soluzione di distacco enzimatica cellulare ad ogni flacone per consentire le sferoidi a dissolversi. Incubare la piastra per 8 min a 37 ° C.
4. Verifica per la dissoluzione del successo di sferoide sotto il microscopio. Aggiungere 100 µ l di DMEM. Centrifugare la piastra a 520 x g per 2,5 minuti rimuovere il surnatante e sospendere le cellule in 100 μl di DMEM.
5. Eseguire un'analisi di proliferazione colorimetrico disponibile nel commercio, nell'analisi di esempio WST-8 su ciascun flaconcino secondo istruzioni^{25 del produttore}. Leggere il saggio in un lettore di test (ELISA) enzima-collegata dell'immunosorbente (parametro 2).

Risultati

Siamo stati in grado di generare riproducibile sferoidi dalle sospensioni unicellulare, in primo luogo da linee cellulari differenti compreso la proprietaria linea cellulare di PiCa, più tardi dalle cellule di cancro umano primario derivato da biopsie del tumore fresco come descritto in Hagemann et al. . ²⁶. abbiamo valutato due metodi consolidati per la generazione di sferoide; i due sono l'impiccagione cosiddetto drop (HD) metodo e il metodo di ultra-ba...

Discussione

Siamo stati in grado di stabilire un protocollo per generare sferoidi riproducibile da sospensioni cellulari, per entrambe le linee cellulari e, in esperimenti preliminari, cellule primarie del tumore umano. Abbiamo valutato due metodi precedentemente descritti e identificati l'ULA-metodo, un metodo dove sono utilizzati piatti di coltura con superfici ultra-bassa aderenza, per essere quello più sicuro e affidabile per la generazione di sferoidi tridimensionale uniforme. Combinando i due metodi distinti per lettura di do...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)	Biochrom, Berlin, Germany	F 0425
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies, Paisley, UK	10500-064
penicillin/streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2212
sodium pyruvate	Biochrom, Berlin, Germany	L0473
non-essential amino acids	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
L-Glutamine	Biochrom, Berlin, Germany	K0293
Liberase	Roche Life Sciences, Basel, Switzerland	5401127001
GravityPLUS 3D Culture and Assay Platform	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS 06-001
GravityTRAP plate	InSphero, Schlieren, Switzerland	PB-CS-01-001
Ultra-low attachment (ULA) culture plates	Corning, Corning, NY, USA	4520
airway epithelial cell growth medium	Promocell, Heidelberg, Germany	C-21060
amphotericin B	Biochrom, Berlin, Germany	A 2612
airway epithelial cell growth medium supplement mix	Promocell, Heidelberg, Germany	C39165
WST-8 test	Promocell, Heidelberg, Germany	PC PK-CA705-CK04
Keratinocyte SFMedium + L-Glutamine 500mL	Invitrogen	#17005-034
Bovine Pituitary Extract (BPE), 25mg	Invitrogen	#37000015
Recombinant human Epithelial Growth Factor 2.5 µg	Invitrogen	#37000015
DMEM High Glucose	Invitrogen	#21068-028
Penicillin Streptomycin 10000U/mL Penicillin/ 10000µg/mL Streptomycin	Invitrogen	#15140-122
F12 Nutrient Mix	Invitrogen	#21765-029
Glutamax (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptide in NaCl)	Invitrogen	#35050087
HBSS (Ca, Mg)	Life Technologies	#14025-092	(no phenol red)
1x TrypLE Expres Enzyme	Invitrogen	#12604-013	(no phenol red)
Accutase (enzymatic cell detachment solution)	Innovative cell technologies	Cat# AT104
70 µm Falcon cell strainer	BD Biosciences, USA	#352350