Funzionalizzazione superficiale delle nanoparticelle di Virus di epatite E utilizzando metodi di coniugazione chimica

Riepilogo

Abbiamo progettato la proteina del capside del virus di epatite E come una nanoparticella di teranostici (HEVNP). HEVNP auto-assembla in una gabbia icosahedral stabile nella consegna delle mucose. Qui, descriviamo la modifica di HEVNPs per tumore targeting modificando la superficie esposta residui di cisteine, che coniuga ligandi sintetici che legano specificamente le cellule del tumore.

Abstract

Particelle simili al virus (VLPs) sono state usate come nanovettori Visualizza epitopi stranieri e/o consegnare piccole molecole nella rilevazione e nel trattamento di varie malattie. Questa applicazione si basa sulla modificazione genetica, auto-assemblaggio e coniugazione di cisteina per soddisfare l'applicazione targeting tumorale del ricombinante VLP. paragonati genetica coniugazione di chimica, da sola modificazione di peptidi stranieri a VLPs offre un significativo vantaggio, perché permette una varietà di soggetti, quali peptidi sintetici o oligosaccaridi, per essere coniugato alla superficie di VIP in modo modulato e flessibile senza alterazione dell'Assemblea VLP.

Qui, noi dimostrare come utilizzare l'epatite E virus nanoparticelle (HEVNP), una capsula di teranostici modularizzato, come un vettore di consegna multifunzionale. Funzioni di HEVNPs includono tessuto-targeting, imaging e consegna terapeutico. Basato sulla consolidata ricerca strutturale di HEVNP, i residui strutturalmente indipendenti e superficie-esposta sono stati selezionati per la sostituzione di cisteina come siti di coniugazione per gruppi chimici maleimide-collegato tramite legami tiolo-selettivo. Un particolare cisteina-modificato HEVNP (una sostituzione di Cys dell'asparagina a 573 aa (HEVNP - 573C)) è stato coniugato ad un ligando di cellula-specifico di cancro di seno, LXY30 e marcati con vicino infrarosso (NIR) fluorescenza colorante (CY 5.5), rendendo il targeting per tumore HEVNPs come efficace diagnostiche capsule (LXY30-HEVNP-CY 5.5). Simili strategie di ingegneria possono essere impiegate con altri complessi macromolecolari con ben noti strutture atomiche per esplorare potenziali applicazioni in teranostici consegna.

Introduzione

Lo sviluppo di vettori di dimensioni nanometriche in consegna terapeutica e diagnostica, conosciuto come nanotheranostics, ha spostato gran parte del campo biomedico lontano da trattamenti generalizzate verso mirati consegna¹. Nanotheranostic mirati consegna integra dimensioni nano vettori (nanoparticelle) con molecole teranostici stabilmente dirigere teranostici molecole di uno specifico tessuto malato o via biochimica^2,3,4 . La nanomedicina è venuto alla ribalta della somministrazione mirata perché in modo ottimale dimensioni nanoparticelle hanno la capacità di stabilizzare la circolazione delle molecole teranostici e mirare selettivamente molecole di superficie cellulare presentati su tessuti malati. Molte piattaforme di nanotheranostic soffrono ancora di uptake cellulare passiva, degradazione prematura, tossicità e insufficiente collaborazione con molecole teranostici. VLP superare molti di questi ostacoli in somministrazione mirata. Sono stati utilizzati come nanovettori Visualizza epitopi stranieri e/o consegnare piccole molecole: un regime che può essere usato per combattere molte malattie¹. Questa applicazione si basa principalmente sulla proprietà di auto-assemblaggio così come la facilità di modificazioni genetiche, per soddisfare l'applicazione progettata per il determinato VLP. Rispetto all'ingegneria genetica, coniugazione chimica dei peptidi stranieri a VLP Visualizza un vantaggio significativo perché permette una grande varietà di soggetti, quali peptidi o oligosaccaridi, per essere coniugata con la superficie di VIP in un modulato e modo flessibile senza alterazione dell'Assemblea VLP.

HEVNPs, derivati dalla proteina del capside HEV ricombinante, 2^nd aperto lettura telaio (ORF2), sono non-infettiva, auto-assemblanti capsidi capace di cella-associazione e voce. Perché HEV evoluto per la trasmissione della mucosa, la proteina del capside assemblato è allo stesso modo stabile in condizioni mucoso proteolitici e acide⁵. HEVNPs formare una cavità, T = 1 capside icosaedrica, composto da 60 unità identiche^6,7 di ORF2, rendendolo altamente stabile sia in condizioni fisiologiche in deposito. In mancanza di qualsiasi elemento genetico virale, la produzione efficiente, ad alto rendimento si ottiene attraverso il sistema di espressione di baculovirus in cellule di insetto. A causa della loro stabilità proteolitica, HEVNPs auto-assemblati vengono estratti e purificati dal surnatante delle cellule, riducendo notevolmente la procedura di purificazione necessaria. Inoltre, HEVNPs possiedono un superficie esposta protrusione dominio (P) collegato attraverso una cerniera flessibile ad una stabile base icosaedrica. Il dominio P forma picchi di superficie-esposta sopra la base icosahedral mentre la cerniera flessibile rende possibile modificare sensibilmente il dominio P senza compromettere la struttura icosaedrica. Con 60 unità ripetute, singola modifica site-specific si traduce in 60 siti simmetriche per modulazione chimica. Recentemente, abbiamo proposto una nano-piattaforma usando HEVNP che sappia coniugare chimicamente ligandi o piccole molecole per applicazioni teranostici. Questo è stato ottenuto sostituendo un singolo aminoacido con cisteina nel dominio di protrusione di HEV-VLP come un sito di reazione con molecole o peptidi maleimide-collegata. Sulla base di precedenti analisi strutturali di HEV-VLP e ben studiati gli epitopi immunogenici^8,9i seguenti cinque di aminoacidi HEV-VLP sono stati sostituiti con cisteina come potenziali candidati: Y485C, T489C, S533C, N573C e T586C ( Figura 1). Dopo espressione e purificazione da cellule di insetto, loro formazioni VLP sono stati confermati tramite l'osservazione di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione (Figura 2), e i siti di cisteina esposta sono stati analizzati mediante Western blot dopo biotina legata al maleimide Coniugazione (Figura 2). Tra i cinque mutanti, HEVNP - 573C visualizzato il segnale più forte di coniugazione maleimide-biotina (Figura 2) ed è stato usato per follow-up dimostrazione come il nanocarrier per cellule di cancro al seno destinazione⁴ (Figura 3).

Questo protocollo descrive metodi di coniugazione chimica per allegare molecole targeting tumorale HEVNPs attraverso la coniugazione di cisteina superficiale. Dettagliamo la coniugazione di molecole di targeting e di rilevazione del tumore per la consegna del tumore con HEVNPs ricombinante contenente una cisteina a N573 (HEVNP - 573C). Ci siamo concentrati su un processo di coniugazione chimica clic in due passaggi per associare un tumore di cancro del seno targeting peptide, LXY30¹⁰ per HEVNPs al modulo LXY30-HEVNP (Figura 4). Successivamente, N-hydroxysuccimide (NHS)-CY 5.5 sono state coniugate al sito Lys separato su HEVNPs per costruire LXY30-HEVNP-CY 5.5 per rilevazione fluorescente sia in vitro (Figura 5) e in vivo⁴.

Protocollo

1. HEVNP produzione in cellule di insetto

Nota: Tutti i passaggi seguenti dovrebbero essere eseguite in una cappa di cultura cellulare. Fare riferimento alla nostra precedente pubblicazione per procedure più dettagliate produzione di HEVNP¹¹.

1. Cellule in insetto Sf9 cella media (Vedi Tabella materiali) alla confluenza di 50-75% in piastre da 6 pozzetti.
2. Utilizzando i reagenti di transfezione delle cellule di insetto secondo i protocolli del produttore, transfect Bacmids contenente HEVNP - 573 C ORF2 in Sf99 cellule per produrre baculovirus ricombinanti. Incubare le cellule transfected a 27 ° C per 3-6 giorni, a seconda la vitalità delle cellule.
3. Raccogliere il supernatante a 3-6 giorni post-infezione (dopo il transfected le cellule vengono lisate dovuto l'infezione di baculovirus) P0 baculovirus stock.
4. Rimuovere il mezzo di cultura prima di applicare 200 µ l di P0 stock al 50-75% cellule Sf9 confluenti in un fiasco di monostrato di² cm 25. Per garantire la copertura completa dell'inoculo della roccia il matraccio ogni 15 min. Ripetere 4 volte, per un totale di 60 min.
5. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura delle cellule dell'insetto al pallone e mantenere a 27 ° C per 3-6 giorni, a seconda di attuabilità delle cellule, per amplificare baculovirus per un più alto titolo.
6. Eseguire analisi di placca per ottenere il titolo di baculovirus lettura¹².
7. Coltura le cellule di insetto Tn5 sospese (Tabella materiali) con 100 mL di mezzo di insetto cellulare in pallone da 250 mL e agitare a 27 ° C a 150 rpm ad un titolo di 0,5 x 10⁵ - 1 x 10⁶ per inoculazione.
8. Aggiungere baculovirus ad una molteplicità di infezione (MOI) delle cellule di Tn5 5-10 a 100 mL in un pallone da 250 mL. Dopo l'inoculazione, agitare a 27 ° C a 150 rpm per 5-7 giorni.
9. Una volta che la maggior parte delle cellule sembrano avere vescicole e 70-90% delle cellule sono morti sotto osservazione del microscopio ottico, raccogliere le cellule Tn5 e trasferire nelle provette ultracentrifuga 33 mL. Posto l'ultracentrifuga tubi in oscillazione secchio rotori, equilibrio e spin-down i detriti cellulari e Baculoviridae ricombinante a 10.000 x g per 90 minuti a 25 ° C.
10. Mantenere il supernatante contenente il HEVNPs rilasciato a 4 ° C per ulteriore purificazione. Per un prolungato stoccaggio di baculovirus surnatante, aggiungere gli inibitori della proteasi.

2. HEVNP purificazione

1. Pellet e isolare il HEVNPs utilizzo della separazione dei gradienti al cesio cloruro (CsCl):
   1. Trasferire il surnatante raccolto (dal punto 1.10) e aggiungere 20% NP-40 in ciascuna provetta per rendere una concentrazione finale di 0,5% NP-40 per sciogliere qualsiasi restante membrana cellulare. Delicatamente mescolare pipettando e incubare per almeno 30 minuti a 25 ° C.
   2. Ultracentrifuga HEVNPs a 112.400 x g in oscillazione secchio rotori per 2 h a 4 ° C a pellet giù il HEVNPs dal surnatante. Eliminare il supernatante dopo centrifugazione e delicatamente risospendere il pellet di greggio a 200 µ l di tampone 10 mM MES pH 6.2 in ciascuna provetta durante la notte (O/N) a 4 ° C. Eseguire SDS-PAGE (punto 3.1) per confermare la presenza di HEVNP ORF2 nel pellet grezza come una fascia di kDa 52.
   3. Preparare una sfumatura di CsCl 38,5% (p/v) di miscelazione g 1,96 CsCl, il greggio risospeso e ~ 4 mL di 0,01 M a pH MES 6.2 in una provetta da 5 mL ultracentrifuga. Bilanciare i tubi e posizionare in un rotore oscillante. Ultracentrifuga a 147.000 x g per 16 h a 4 ° C.
2. Raccogliere le frazioni dopo CsCl gradiente:
   1. Scartare la frazione superiore di 500 µ l, che è principalmente membrana cellulare leggero detriti. Raccogliere 500 frazioni µ l, a partire dalla parte superiore del tubo e cambiare suggerimenti tra ciascuna frazione. Inserire ogni frazione in provette numerate/etichettato 1,5 mL.
      Nota: La presenza di HEVNP ORF2 in frazioni separate da CsCl gradiente non può essere rilevato mediante l'esecuzione SDS PAGE gel dovuta all'alta concentrazione di CsCl. Il CsCl in ogni frazione può essere rimosso o diluito seguendo una procedura di pulitura di CsCl. In alternativa, il gradiente di CsCl può essere sostituito da un gradiente di saccarosio¹³ di 10-40% per evitare residui CsCl.
   2. Ogni frazione di trasferimento ad un tubo di ultracentrifuga di 5 mL e diluire il CsCl con 4,5 mL di 10 mM MES, pH 6,2. Bilanciare i tubi e posizionare in un rotore oscillante. Ultracentrifuga a 147.000 x g per 2 ore a 4 ° C a pellet giù il HEVNPs.
   3. Scartare il surnatante e Risospendere delicatamente il HEVNPs in 100 µ l di 10 mM a pH MES 6.2 in ciascun tubo. Coprire le provette per evitare l'evaporazione e incubare O/N a 4 ° C.
   4. Registrare la lettura A280 ed il rapporto A260/A280 nm rapporto utilizzando uno spettrofotometro. Determinare la concentrazione approssimata di ORF2 come:
      
      Ogni ORF2 conterrà 1 sito di Cys e 1 sito di Lys per coniugazione chimica.
      Nota: Il coefficiente di estinzione molare di HEVNP ORF2 è 60.280, che equivale a 1,019 mg/mL × A280. Questo è così vicino a 1:1 che la concentrazione di HEVNPs (in mg/mL) può essere approssimata dall'A280 e di conseguenza, la concentrazione di ORF2 dalla suddetta equazione. Ad esempio, un HEVNP con una lettura di A280 di 1 avrà una concentrazione di 1 mg/mL, che è equivalente a 18,8 µM ORF2.
   5. Preparare una SDS-PAGE. Utilizzare un 6 µ l di campione da ogni frazione per determinare le frazioni contenenti 53,3 proteina di kDa HEVNP ORF2 (punto 3.1). Il HEVNPs dovrebbe essere trovato in frazioni 3-5, con una densità di ~1.25 g/mL.
   6. Confermare la presenza e la purezza della HEVNPs tramite l'osservazione di TEM. Preparare o diluire i campioni HEVNP a 0,5 - 2,0 mg/mL per il TEM. I HEVNPs appaiono nel TEM come proteine icosahedral vuote, ~ 27 nm di diametro (Figura 2). Alcuni contaminanti di proteina possono rimanere nelle frazioni e saranno osservati sotto TEM (punto 3.2).
3. Nel caso che le impurità sono presenti sotto TEM, ripetere il punto 2.1.3 - 2.2.6 per migliore purezza della HEVNPs.
   Nota: Purificazione Extra attraverso CsCl gradiente può causare perdita di resa di HEVNPs. In alternativa, la purificazione di gradienti di CsCl può essere sostituita da un gradiente di saccarosio di 10-40% per evitare residui di CsCl¹³.

3. HEVNP caratterizzazione

1. Preparare gel proteina Bis-Tris di 4-12% del SDS PAGE, 1.0 mm, 17-wells (Vedi Tabella materiali) secondo il manuale dell'utente¹⁴:
   1. Aggiungere 2 µ l di 4 x caricamento buffer per 6 µ l di campione della proteina. Incubare la miscela del campione in un blocco di calore per 10 min a 100 ° C per denaturare la proteina. Caricare i campioni della proteina sul gel.
   2. Eseguire la SDS-PAGE impostando l'alimentatore CC a 100 V per 10 min, poi 150 V per 45 min fino a quando gli esempi eseguiti a circa 1 cm sopra il fondo del gel.
   3. Macchia del gel di SDS PAGE con blue di Coomassie (0,25% (p/v) Coomassie Brilliant Blue R250, 30% (v/v) metanolo, acido acetico 10% (v/v)), per 1 h.
   4. Dopo la procedura di colorazione, rimuovere la macchia blu di Coomassie e applicare la de-colorazione buffer (30% (v/v) metanolo, acido acetico 10% (v/v)) in gel di proteina per > 12 h a temperatura ambiente.
   5. Documentare il gel sotto luce bianca per confermare la presenza di HEVNP ORF2 presso la band 52 kDa.
2. Osservare il HEVNPs utilizzando TEM.
   1. Preparare o diluire i campioni HEVNP di 0.5 - 2 mg/mL con 10 mM a pH MES 6.2 per l'imaging di TEM.
   2. Ionizzare le griglie rivestite di carbonio con scarico di incandescenza 40 mA per 30 s per produrre una superficie idrofila carbonio. Le attrezzature di scarico di incandescenza sono descritta nella Tabella materiali.
      Nota: La superficie idrofila carbonio delle griglie può solo ultima per 30 min dopo bagliore di scarico trattamento.
   3. Tenere a pinzette e aggiungere 2 µ l di campione HEVNP alla griglia, attendere per 15-30 s e tamponare con carta da filtro.
   4. Lavare immediatamente la griglia con ddH₂0 e tamponare con carta da filtro.
   5. Immediatamente aggiungere 2 µ l di acetato di uranile 2% alla griglia, aspettare 15 s, poi tamponare con carta da filtro. A secco le griglie di esempio mettendoli in un formato elettronico deumidificare Governo asciutto per O/N.
   6. Trasferire la griglia in un TEM e immagine all'ingrandimento 10 - 80K. HEVNPs appaiono in TEM come vuote icosahedral proteine che sono ~ 27 nm di diametro, a causa dell'assenza di RNA virale.

4. chimica coniugazione del HEVNPs con biotina, cancro Targeting ligando e fluorofori

1. Eseguire una coniugazione di passaggio di HEVNPs e biotina maleimide collegato.
   1. Cambiamento del buffer: applicare il HEVNPs nelle unità di dialisi mini e Dializzare contro PBS 0,01 M a pH 7.4 a temperatura ambiente per 1 h secondo il protocollo del produttore (Tabella materiali). Trasferire la HEVNPs per provette da 1,5 mL e misurare la concentrazione di proteina a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
   2. Mescolare il HEVNP a 1 mg/mL, che è equivalente a 18,8 µM di Cys reazione siti (Vedi dettagli al punto 2.2.4), con una quantità uguale di maleimide-biotina (100 µM) in PBS 0,01 M, pH 7.4, per rendere un rapporto molare 1:5; reagire O/N a 4 ° C. Rimuovere la biotin-maleimide non con una procedura di colonna 40K MWCO Spin desalazione secondo il protocollo del produttore (Tabella materiali).
   3. Analizzare i campioni attraverso standard riduzione dello SDS-PAGE (punto 3.1).
   4. Utilizzando le procedure standard, preparare un chemiluminescente Western Blot utilizzando streptavidina HRP-collegata. Catturare il segnale chemiluminescente dalla pellicola di raggi X (Figura 2).
2. Eseguire il passaggio due LXY30 coniugazione a cisteina superficie esposta su HEV NPs (Figura 5).
   1. Cambio del buffer: applicare HEVNPs in dialisi mini e Dializzare contro PBS 0,01 M a pH 7.4 a temperatura ambiente per 1 h. trasferimento del HEVNPs per provette da 1,5 mL e misurare la concentrazione di proteina a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.
   2. Aggiungere 650 µM maleimide-azide e 650 µM alchino-LXY30¹⁰ in 0,01 M PBS pH 7.4 con 200 µM CuSO₄ e 1 mM acido ascorbico per formare LXY30 maleimide-collegato (Mal-LXY30) a 650 µM. Incubare la miscela a 4 ° C per O/N.
   3. Mescolare il HEVNP a 1 mg/mL, che è equivalente a 18,8 µM di Cys sito di reazione (Vedi dettagli al punto 2.2.4), con circa il 10% volume di Mal-LXY30 (650 µM) in PBS 0,01 M a pH 7.4, per rendere un rapporto molare 1:3; reagire O/N a 4 ° C.
      Nota: A causa della concentrazione relativamente alta di Mal-LXY30, le concentrazioni finali dei reagenti, ad esempio CuSO₄, sono ridotti circa 10 volte dopo la miscelazione, per evitare loro danni al HEVNPs. Un'altra opzione è la Cu-libera coniugazione metodo¹⁵.
   4. Rimuovere unbound maleimide-clicca-LXY30 con una colonna K MWCO Spin desalificazione 40 secondo il protocollo del produttore (Vedi Tabella materiali). Mantenere il HEVNPs LXY30-collegato (LXY30-HEVNPs) a 4 ° C.
3. Eseguire una coniugazione di passo della LXY30-HEVNPs e CY 5.5 NHS estere (NHS-CY 5.5)
   1. Mescolare il HEVNPs LXY30-collegato (LXY30-HEVNPs) a 1 mg/mL, che è equivalente a 18,8 µM del sito reazione Cys (Vedi dettagli al punto 2.2.4), con un volume uguale di NHS-CY 5.5 (100 µM) in PBS 0,01 M a pH 7.4 per rendere un rapporto molare 1:5; reagire O/N a 4 ° C.
   2. Rimuovere unbound CY 5.5-NHS con una procedura di colonna MWCO Spin desalificazione 40K secondo il protocollo del produttore (Vedi Tabella materiali). Tenere le LXY30, CY 5.5-collegato HEVNPs (LXY30-HEVNP-CY 5.5) a 4 ° C.

5. HEVNP associazione a e internalizzazione in cellule di cancro al seno MDA-MB231

1. Cellule di cancro al seno MDA-MB231 semi in un bicchiere da 35 mm fondo piatti (5 x 10⁴ per ogni piatto) O/N in una coltura di cellule di mammifero armadietto.
2. Per l'esperimento di associazione di cella, è possibile preparare LXY30-HEVNP-CY 5.5 dai seguenti passaggi 4.2-4.3. Diluire il LXY30-HEVNP-CY 5.5 a 0,01 mg/mL, che è equivalente a 0,188 µM di HEVNP ORF2 (fare riferimento al punto 2.2.4), a 250 µ l di 0 - 1% FBS/DMEM.
   1. Preparare il campione di controllo negativo a 0,01 mg/mL HEVNP-CY 5.5 eseguendo il passaggio 4.3 ma coniugati con NHS-CY 5.5 tintura solo, (HEV-CY 5.5). Diluire il HEVNP-CY 5.5 a 0,01 mg/mL, che è equivalente a 0,188 µM di HEVNP ORF2 (fare riferimento al punto 2.2.4), a 250 µ l di 10% FBS completati con DMEM.
3. Lavare le cellule una volta applicando 250 µ l di tampone PBS di 1 M, pH 7,4. Rimuovere il tampone PBS dopo il lavaggio, mantenendo alcuni buffer nella piastra di coltura delle cellule.
4. Applicare 250 µ l di LXY30-HEVNP-CY 5.5 in 10% FBS completati con DMEM o HEVNP-CY 5.5 in 10% FBS completati con DMEM per le cellule di cancro al seno MDA-MB231 coltivate. Scudo della cella coltivate piatti dalla luce con carta stagnola.
5. Mantenere i piatti delle cellule coltivate in una coltura cellulare di 37 ° C per 1 h per internalizzazione armadietto.
6. Lavare le cellule coltivate sul ghiaccio 3 volte, 5 min per lavaggio, con 250 µ l di PBS di 1 M, pH 7,4.
7. Fissare le cellule in 4% PFA in 1m PBS, pH 7.4 per 20 minuti e poi lavare una volta con 250 µ l di PBS di 1 M, pH 7,4.
   Nota: Le cellule sono ora pronte per essere ripreso da microscopio confocale. Dati rappresentativi sono illustrati nella Figura 5.

Risultati

Simile a HEV-VLP, Cys tutti modificato HEVNPs formata solubile icosahedral capsidi e non ha fatto aggregare in soluzione durante la produzione o purificazione. Prima e dopo coniugazione passo singolo maleimide-biotina, ciascuno della Cys modificato HEVNPs erano indistinguibili da HEV-VLP nella macchia negativa EM (Figura 2). Efficienza di coniugazione di maleimide-biotina di Cys HEVNPs modificate in primo luogo è stato testato con Western blotting attraverso...

Discussione

A differenza della procedura di ingegneria genetica che richiede tempo, che prende di solito settimane, Qui dimostriamo in due semplici passaggi e le procedure di coniugazione chimica One-Step, che possono essere completate entro 3 giorni, aggiungendo il cancro ligando di targeting e/o fluorescenza della tintura di rilevamento per i siti di Cys/Lys di HEVNPs. La tecnica può essere utilizzata a schermo per la migliore destinazione di legante da un pool di candidati e quindi sfrutta i servizi di sintesi disponibili peptid...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MINI Dialysis Units, 10K MWCO	Thermo Fisher Scientific	69572	mini dialysis unit
High Five Cells	Thermo Fisher Scientific	B85502	Tn5 cells
SF9 Cells	Thermo Fisher Scientific	11496015	Sf9 cells
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Thermo Fisher Scientific	A11101, A11100	Baculovirus expression system
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Life Technologies	10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024	Bacmid
ESF921 Insect Cell Media	Expression Systems LLC	96-001-01	insect cell media
Cy5.5 NHS ester, 5mg	Lumiprobe Corp	27020	Cy5.5 NHS ester
Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL	Thermo Scientific	87766	spin desalting column
MES Hydrate	Sigma-Aldrich Chemical Co	M8250-250G	MES
Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes	Beckman Coulter, Inc	Depends on Rotor	ultracentrifuge tube
NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels	Thermo Fisher Scientific	NPO321BOX	SDS protein gel
Cellfectin II Reagent	Thermo Fisher Scientific	10362100	transfection reagent
EMS Glow Discharger	Electron Microscopy Science		glow discharger