Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per mostrare come cella fotoconversione è raggiunto attraverso l'esposizione di UV ad aree specifiche che esprimono la proteina fluorescente, Eos, in animali vivi.

Abstract

Tessuto animale e vegetale è composto da popolazioni distinte delle cellule. Queste cellule interagiscono nel tempo per costruire e mantenere il tessuto e possono causare la malattia quando perturbato. Gli scienziati hanno sviluppato tecniche intelligente per studiare le caratteristiche e dinamiche naturali di queste cellule all'interno del tessuto intatto esprimendo proteine fluorescenti in sottopopolazioni di cellule. Tuttavia, a volte, gli esperimenti richiedono più selezionato visualizzazione delle cellule all'interno del tessuto, a volte alla maniera unicellulare o popolazione di cellule. Per raggiungere questo obiettivo e visualizzare le singole celle all'interno di una popolazione di cellule, gli scienziati hanno utilizzato fotoconversione unicellulare di proteine fluorescenti. Per illustrare questa tecnica, vi mostriamo qui come dirigere la luce UV a una cella che esprimono Eos di interesse in un intatto, vivono zebrafish. Abbiamo quindi immagine quelle cellule di Eos⁺ photoconverted 24 h più successivamente per determinare come sono cambiate nel tessuto. Descriviamo due tecniche: singola cella fotoconversione e photoconversions delle popolazioni della cellula. Queste tecniche possono essere utilizzate per visualizzare le interazioni cellula-cellula, cellula-destino e differenziazione e migrazioni delle cellule, che lo rende una tecnica che è applicabile a numerose domande biologiche.

Introduzione

Più celle distinte interagiscono per costruire e mantenere complessi tessuti animali e vegetali. Queste cellule sono spesso intercalati e difficili da distinguere dai vicini a livello di singola cellula senza microscopia ad alta risoluzione che richiedono la fissazione del tessuto. Tuttavia, per capire come questi si formano tessuti, sono mantenuti e diventare malato, è stato fondamentale per indagare come singole cellule all'interno del tessuto interagisce nel corso del tempo. Idealmente, questi esperimenti richiedono l'etichettatura delle singole cellule all'interno di un tessuto in maniera non invasiva, senza l'obbligo di fissazione. Gli scienziati ora hanno sviluppato numerose tecniche per realizzare questo compito^1,2,3,4.

L'individuazione e l'attuazione della proteina fluorescente Medusa verde (GFP) è stato un approccio emozionante che ha permesso per l'etichettatura di cellule distinte in un tessuto ambiente¹. Utilizzando promotori di cellula-specifico, è possibile selezionare geneticamente un sottoinsieme delle cellule che sono classificati come¹. In alternativa, l'espressione virale indotta di GFP può essere utilizzato per utente-selezionato espressione della GFP^3,4. Anche se molto utile, espressione genetica mediata di GFP non consente l'espressione selezionata dall'utente all'interno di un sottoinsieme delle cellule nel tessuto; e l'espressione virale di GFP, sebbene vantaggioso, può essere invasivo. Con l'avvento di GFP derivati e tecniche intelligente come Brainbow di esprimere distinte proteine fluorescenti più scarsamente all'interno dei tessuti, è diventato possibile visualizzare singole cellule e le interazioni tra loro nel complesso tessuto^{2, 5}. Tuttavia, questi approcci marcare le cellule in modo casuale. Se l'esperimento desiderata richiede la visualizzazione di una singola cella o popolazione di cellule che è definita dallo sperimentatore, pertanto sono limitati. Con tali esperimenti, sarebbe vantaggioso avere una proteina fluorescente geneticamente espressa che può essere manipolata per distinguere, in maniera singola cella, e da altre cellule fluorescenti e non fluorescenti.

Per raggiungere questo obiettivo e visualizzare la biologia cellulare di cellule singole all'interno di un tessuto vivente complesso, la comunità scientifica utilizza fotoconversione unicellulare di distinte proteine fluorescenti^6,7,8. Espressione di una proteina di fotoconvertibile (cioè, eos, kaede, ecc.) che passa dal verde al rosso fluorescente stato quando esposto ai raggi UV con geneticamente controllata (488 nm) luce, possiamo distinguere una singola cella da sua fluorescente contrassegnati i vicini^6,7,8. Questo approccio utilizza un apparecchio attaccato al nostro microscopio confocale che possa indirizzare la luce da una pila di laser a una regione di diffrazione limitata di interesse. Con questa tecnica, possiamo etichettare o singole cellule o più grandi popolazioni in un modo definito dall'utente^9,10,11. La tecnica è mini-invasiva rispetto alle iniezioni di singola cellula di GFP virale. Come un proof of concept, mostriamo che possiamo fotoconvertita singole cellule all'interno di un ganglio nel sistema nervoso periferico e fotoconvertita più grandi popolazioni come cellule situate sul lato ventrale del midollo spinale^{9,10, 11,12}. Quindi possiamo visualizzare queste popolazioni di cellule photoconverted 24 h più tardi per guadagnare la comprensione nel loro movimento e la differenziazione durante lo sviluppo.

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Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Università di Notre Dame istituzionali Animal Care e Comitato di uso.

1. preparazione del campione di Zebrafish

1. Posizionare un maschio adulto e un adulto femmina Tg (convertibile della proteina) in una camera di accoppiamento per le procedure standard¹³. In questo manoscritto, utilizzare Tg(sox10:eos) pesce⁹ a causa di accesso ma altre linee transgeniche con fotoconvertibile della proteina può essere ugualmente usato. Impostare più di una camera nel caso in cui il pesce non posare. Consentire il pesce a rimanere nella camera durante la notte.
2. La mattina successiva, raccogliere le uova in piastre Petri da 100 mm. Consentire uova di maturare alla post-fecondazione 24h (hpf) prima proiezione.
3. Se gli animali di cui sopra erano eterozigoti per il transgene, schermo 24 hpf piatti per Tg(sox10:eos) + embrioni con un 488 nm sorgente e GFP filtrare i set su un microscopio per dissezione. Isolare Tg(sox10:eos) + embrioni e permettono di maturare a 48 hpf.
4. Dechorionate embrioni manualmente con un ago o una pinzetta.
5. Preparare e microonde 5 mL di soluzione di agarosio di punto basso punto di fusione dello 0,8%.
   1. Una volta fredde al tatto dell'agarosi, posto 3-4 anestetizzati Tg (sox10:eos) + 48 pesce hpf al centro di un coprioggetto in vetro-10 mm inferiore di Petri.
   2. Aggiungere sufficiente dell'agarosi per coprire la superficie del vetrino coprioggetti, circa 1 mL. Utilizzare un ago sonda per disporre il pesce sui loro lati. Consentire l'agarosio a solidificare per garantire il montaggio degli animali. Può essere necessario continuamente ri-organizzare il danio zebrato, fino a quando l'agar solidifica¹⁴. Solidificazione dura circa 2 min.
6. Dopo l'agarosio è solidificato per 2 min, aggiungere lentamente il mezzo di embrione contenente 0,02% acido aminobenzoic estere (tricaina) a piatto fino a quando la superficie inferiore dell'agar e il piatto è sommerso. Questo dovrebbe essere circa 3mL.

2. microscopio montaggio e pre-conversione Imaging

1. Confocale software Open e selezionare le finestre di acquisizione e messa a fuoco [Figura 1]. Sotto la finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione di imaging di laboratorio specifico conversione sotto all'opzione cattura impostazione discesa scheda [Figura 1]. Qui, l'impostazione di specifiche del laboratorio viene chiamato "pesce di Imaging".
2. Inserire esemplare nell'ambito confocale e mettere a fuoco usando il corso e le manopole di regolazione fine.
3. Aprire la finestra di messa a fuoco e individuare l'area desiderata di interesse (cioè gangli delle radici dorsali).
4. Selezionare il laser c488 sotto il menu filtro impostato. Impostare l'esposizione a 300 ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2].
5. La casella 3D nella sezione tipo di cattura . Nella sezione Capture 3D , selezionare utilizza la posizione corrente e controllare la gamma intorno a corrente. Nella stessa sezione, è possibile impostare l'intervallo a 35, il numero di aerei a 36 e le dimensioni di passaggio a 1. La gamma può essere aumentata o diminuita per ospitare per la profondità dell'area di imaging. Per il midollo spinale un valore compreso tra 35-40 stack è in genere sufficiente [Figura 5].
6. Selezionare la posizione corrente [Figura 5].
7. Fare clic su start nella parte inferiore della finestra di cattura per acquisire l'immagine.

3. single-cell fotoconversione

1. Confocale software Open e selezionare le finestre di acquisizione e messa a fuoco [Figura 1]. Sotto la finestra di acquisizione, selezionare l'impostazione di imaging di laboratorio specifico conversione sotto all'opzione cattura impostazione discesa scheda [Figura 1]. Qui, l'impostazione di specifiche del laboratorio viene chiamato "Pesce l'ablazione chip completo."
2. Selezionare il laser c488 e c541 sotto il menu filtro impostato. Se non si utilizza lo stesso software di microscopio, trovare il menu per selezionare diversi laser e selezionare la 488 nm e 541 nm laser. Impostare le esposizioni ai 300 ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2]. Queste impostazioni di laser vengono selezionate in base a produrre abbastanza segnale fluorescente senza causare tossicità o photobleaching. Se è visualizzata la tossicità o photobleaching, ridurre potenza laser o esposizione.
3. Aprire la finestra di messa a fuoco e fare clic sulla scheda photomanipulation nella finestra di messa a fuoco. Regolare di conseguenza i parametri laser. Modificare la potenza del laser dello stack a 2 e quindi fare clic su Vai. Modificare la dimensione del blocco Raster 1 e fare clic su imposta. Modificare le dimensioni di doppio clic a 4. Modificare la linea laser a v405 [Figura 3].
4. Aprire le impostazioni di acquisizione avanzate nella finestra di acquisizione. Selezionare la scheda photomanipulation e modificare le ripetizioni fare doppio clic su 2. Fare clic su OK [Figura 4].
5. Selezionare la scheda XY nella finestra di messa a fuoco. Ricontrollare i parametri laser dal passaggio 2 nella scheda photomanipulation [Figura 3, Figura 4]. Impostare impostazioni laser fotoconvertita la cella di interesse senza fotoconversione delle cellule circostanti.
   1. Se fotoconversione delle celle adiacenti è presente, ridurre la potenza del laser. Se fotoconversione delle cellule non si verifica, poteri del laser possono essere aumentate. Impostare in modo ottimale, potenza laser fotoconvertita solo la regione di interesse e non le zone circostanti.
6. Selezionare la casella di timelapse sotto tipo di cattura. Quindi, fare clic su Start [Figura 6A].
7. Una volta aperta la finestra di live della webcam, selezionare lo strumento cerchio sulla barra superiore [Figura 7]
8. Disegnare un cerchio nella regione più centrale della cellula. Fare clic destro il cerchio disegnato, selezionare regione FRAPe attendere 3 secondi. L'area selezionata dovrebbe diventare dimmer [Figura 8]. Scegliere Interrompi acquisizione.
9. Se più di un animale di imaging, tornare alla scheda XY nel menu di messa a fuoco e selezionare la posizione 2. Quindi, ripetere i passaggi 4.1-4.6.
10. Per convertire una popolazione di cellule, seguire i parametri di protocollo e laser per la procedura 4.1-4.4 tranne invece di disegnare un cerchio di FRAP la regione di interesse, utilizzare lo strumento linea. Tracciare una linea sulla regione di interesse e FRAP la regione utilizzando gli stessi parametri sopra elencati.

4. post-fotoconversione Imaging

1. Una volta che tutti i punti sono photoconverted. Selezionare lo stack di immagine standard di laboratorio specifiche impostazione descritta in precoversion passo 3 di imaging. Questo si trova sotto all'opzione cattura impostazione scheda a discesa nella finestra di cattura [Figura 5].
2. Selezionare il laser c488 e impostare l'esposizione a 300ms, laser di potenza a 5 e intensificare a 75 [Figura 2].
3. Selezionare il laser c541 trovato sotto lo stesso menu come il laser c488. Impostare l'esposizione a 500 ms, laser di potenza a 10 e intensificare a 75 [Figura 9].
4. La casella 3D nella sezione tipo di cattura . Nella sezione Capture 3D , selezionare utilizza la posizione corrente e controllare la gamma intorno a corrente. Nella stessa sezione, è possibile impostare l'intervallo a 35, il numero di aerei a 36 e le dimensioni di passaggio a 1. Il numero di serie può aumentare o diminuire per accomodare la profondità imaging desiderata [Figura 5].
5. Se esistono più punti nella scheda di messa a fuoco XY, è possibile selezionare l'opzione multipunto elenco nella finestra di acquisizione. In caso contrario, selezionare la posizione corrente.
6. Fare clic su start nella parte inferiore della finestra di cattura per acquisire l'immagine.

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Risultati

Fotoconversione di proteine fluorescenti può essere utilizzato per marcare le cellule distinte all'interno di un tessuto⁶. Per dimostrare questo, Tg(sox10:eos) pesce⁹ sono stati utilizzati per esprimere la proteina fotoconvertibile Eos sotto le sequenze regolatrici di sox10. Gli animali di Tg(sox10:eos) 48 hpf erano prima montato e poi ripreso per rilevare qualsiasi fotoconversione aspecifici che può essersi veri...

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Discussione

In tessuti complessi, distinti tipi di cellule si organizzano in domini specifici. Recentemente sono state utilizzate tecniche a singole celle etichetta all'interno di queste strutture di grande tessuto^1,2,3. Qui dimostriamo due tecniche che possono essere utilizzate allo stesso modo per visualizzare interazioni cellula singola e interazioni di popolazione delle cellule all'interno di tessuti complessi. Il vantaggio della tecnic...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tg(sox10:eos) zebrafish animals			Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish	VWR	25384-302
Embryo medium			Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose	dot scientific inc	9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish	Ted Pella Inc.	14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)	Fluka analytical	A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters	Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets	3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion	405 nm laser
Slidebook software	3i
Methylene blue	Kordon