Amplificazione isotermica multiplex basato su piattaforma diagnostica per rilevare Zika, Chikungunya e Dengue 1

Riepilogo

Corrente multiplexed diagnostica per rilevare virus dengue, chikungunya e Zika richiedono preparazione campioni complessi e costosi strumentazione e sono difficili da utilizzare in ambienti di risorse in esaurimento. Vi mostriamo una diagnostica che utilizza amplificazione isotermica con sonde displaceable strand mirate per rilevare e distinguere questi virus con alta sensibilità e specificità.

Abstract

Zika, dengue e chikungunya virus vengono trasmessi dalle zanzare, che causano malattie con sintomi simili del paziente. Tuttavia, hanno potenzialità di trasmissione paziente--paziente a valle diversi e richiedono trattamenti pazienti molto diversi. Così, recenti focolai di Zika rendono urgente di sviluppare strumenti che discriminano rapidamente questi virus in pazienti e intrappolato le zanzare, per selezionare il corretto trattamento del paziente e per comprendere e gestire la loro epidemiologia in tempo reale.

Purtroppo, attuale test diagnostici, tra cui quelli emergenza 2016 ricevente utilizzare autorizzazioni e fast track stato, rilevare RNA virale da reazione a catena della polimerasi d'inversione della trascrizione (RT-PCR), che richiede strumentazione, addestrato gli utenti, e preparazione del campione considerevole. Così, essi devono essere inoltrati ai laboratori di riferimento "approvato", che richiede tempo. Infatti, in agosto 2016, il Center for Disease Control (CDC) stava chiedendo donne incinte che era stato morso da una zanzara e ha sviluppato un'eruzione che indica Zika aspettare un'inaccettabile 2 a 4 settimane prima di imparare se sono stati infettati. Abbiamo molto bisogno di test che può essere fatto sul posto, con poche risorse e da personale addestrato ma non necessariamente con licenza.

Questo video dimostra un'analisi che soddisfa queste specifiche, lavorando con urina o siero (per pazienti) o carcasse di zanzara schiacciata (per sorveglianza ambientale), tutto senza molta preparazione del campione. Carcasse di zanzara vengono catturate su carta che trasportano gruppi ammonio quaternario (Q-carta) seguite da trattamento con ammoniaca per gestire rischi biologici. Questi sono quindi direttamente, senza isolamento del RNA, messi in provette contenenti i reagenti liofilizzati che hanno bisogno di nessuna catena di refrigerazione. Una forma modificata di trascrizione d'inversione ciclo-amplificazione isotermica mediata da con mirate fluorescente contrassegnati spostabile sonde produce della lettura, in 30 min, come un segnale di fluorescenza in tre colori. Questo viene visualizzato con un dispositivo palmare, alimentato a batteria con un filtro arancione. Contaminazione di avanti è evitata con provette sigillate e l'uso di uracile termolabile DNA glicosilasi (UDG) in presenza di dUTP nella miscela di amplificazione.

Introduzione

Le infezioni virali trasmesse dalle zanzare, incluse dengue e chikungunya virus di Zika sono sulle strategie di gestione immediata ascesa e la domanda. Dengue e chikungunya virus sono già endemico in molte regioni tropicali dove Zika sta ormai dilagando in emisfero occidentale¹. Virus di Zika, come dengue, è un membro della famiglia Flaviviridae ed è originario dell'Africa con una asiatica e due stirpi genetici africano². Anche se l'identificazione del virus Zika risale al 1947, Zika infezione in esseri umani è rimasto sporadico per mezzo secolo prima di emergere nel Pacifico e nelle Americhe. Il primo focolaio segnalato di Zika febbre si è verificato su Isola di Yap, Stati federati di Micronesia nel 2007, seguita da Polinesia francese nel 2013 e nel 2014. Il primo focolaio principale nelle Americhe si è verificato nel 2015 in Brasile.

I virus di Zika, chikungunya e dengue sono principalmente trasmessi da Aedes aegypti e Aedes albopictus. Tuttavia, Zika ha trasmissione umano--umana a valle ulteriori possibilità, probabilmente viene diffuso attraverso il contatto sessuale, l'interazione madre-di-feto e tramite l'allattamento^3,4,5. Zika febbre prima credeva di causare una malattia solo lieve. Tuttavia, fu più tardi associato con la sindrome di Guillain-Barré in adulti, microcefalia in neonati e malattie del sistema muscoloscheletrico cronici che possono durare mesi e anni. Diagnosi di malattia di Zika può essere difficile, poiché i sintomi di un'infezione di Zika sono simili a quelli di altri di zanzara-diffondere virus⁶. Co-infezioni comuni di questi virus fanno diagnosi differenziale ancora più impegnativo^7,8. Pertanto, rilevazione rapida e affidabile degli acidi nucleici da Zika e altri virus è necessario per comprendere l'epidemiologia in tempo reale, per avviare il controllo e le misure preventive e di gestire la cura paziente⁹.

Test diagnostici correnti per questi virus includono analisi sierologiche, isolamento del virus, sequenziamento del virus e PCR d'inversione-trascrizione (RT-PCR). Gli approcci sierologici standard spesso soffrono di sensibilità inadeguata e risultati possono essere complicati da reattività crociata in pazienti che sono stati infettati in precedenza da altri flavivirus.

Di conseguenza, degli acidi nucleici testing rimane il modo più affidabile per rilevare e distinguere questi virus. Rilevamento di Zika e altri virus zanzara è di solito eseguita mediante RT-PCR o RT-PCR in tempo reale in varietà di fluidi biologici, come siero, urina, saliva, sperma, latte materno e fluido cerebrale^10,11. Campioni di urina e saliva sono generalmente preferiti sopra anima, poiché esibiscono meno PCR-inibizione, più alti carichi virali, presenza di virus per lunghi periodi di tempo e una maggiore facilità di raccolta e gestione delle^12,13. Test diagnostici basati su RT-PCR, tuttavia, comprendere la procedura di preparazione del campione vasto e costose attrezzature ciclismo termica, rendendolo meno ottimale per il point-of-care.

Retrotrascrizione amplificazione isotermica mediata da loop (RT-LAMP) è emerso come una potente alternativa di RT-PCR, grazie alla sua elevata sensibilità e specificità¹⁴,¹⁵, campioni di relativa tolleranza per sostanze inibitorie in biologico e operazione singola temperatura, che significativamente si abbassa tenore complessità e costi associati, che lo rende adatto per ambienti di risorse in esaurimento. RT-LAMP, come classicamente è implementato, comprende sei iniettori che si legano a otto regioni distinte all'interno del RNA dell'obiettivo. Funziona a temperature costanti tra 60 ° C e 70 ° C e utilizza una trascrittasi inversa e una polimerasi del DNA con filo forte spostando attività.

Durante le fasi iniziali di RT-LAMP, avanti e indietro interni iniettori (FIP e BIP, Figura 1A) con primer esterno avanti e indietro (F3 e B3) formano una struttura con manubri, la struttura di seme di amplificazione esponenziale di lampada. Amplificazione è ulteriormente accelerato tramite i ciclo avanti e indietro gli iniettori (LF e LB), che sono progettati per associare le singole regioni non recuperabili di dumbbell, e risultati nella formazione di concatemeri con ripetere più cicli¹⁶. LAMPADA classica analisi basata su torbidità o lettura di DNA intercalanti coloranti non è completamente adatta per rilevazione di point-of-care di Zika, dove un certo livello di multiplazione è voluto^17,18,19. Multiplexing non è facilmente ottenuti in questi sistemi, come sono inclini a generare falsi positivi a causa di amplificazioni fuori bersaglio.

Per gestire questi problemi, la letteratura aggiunge un componente supplementare sotto forma di una "filo-spostando la sonda" il^21,20,di architettura classica RT-LAMP²². Ogni sonda è una regione del doppio filamento di sequenza-specifico e una regione di adescamento singolo filamento. La sonda con la regione di singolo filamento è etichettata con un fluoroforo 5' e la sonda complementare viene modificata con un quencher estremità 3'. In assenza di un obiettivo, fluorescenza non è osservata a causa di ibridazione dei fili sonda complementare, che porta il fluoroforo e quencher in stretta vicinanza. In presenza di un bersaglio, la porzione di filamento singolo della sonda fluorescente si lega al suo complementare sul bersaglio e viene quindi esteso da un filamento spostando della polimerasi. Ulteriore estensione della polimerasi di iniettori d'inversione provoca la separazione del filo del quencher dal suo filone fluorescente contrassegnati complementari, consentendo l'emissione di fluorescenza (Figura 1B). Con questo disegno, il segnale viene generato dopo la formazione di dumbbell, riducendo le possibilità di falsi positivi segnali.

La parte di double-stranded della sonda strand-spostando può essere qualsiasi sequenza, e quando viene applicato il multiplexing, la stessa sequenza può essere utilizzata con coppie diverse fluorophore-quencher. Con questa architettura, contaminati dal virus dell'urina, siero o zanzara campioni schiacciati sulla carta sono stati introdotti direttamente il dosaggio senza preparazione del campione. Letture di tre colori di fluorescenza visibile all'occhio umano sono stati generati all'interno di 30-45 min, e i segnali sono stati visualizzati da una finestra di osservazione 3D-stampato che utilizza un LED blu e un filtro arancione. Liofilizzazione i reagenti RT-LAMP attivata la distribuzione di questo kit per abbassare le impostazioni delle risorse senza la necessità di refrigerazione.

Protocollo

Nota: Le zanzare erano gli unici animali direttamente utilizzati in questo studio. Le procedure per la gestione di polli, il cui sangue è stato utilizzato per alimentare le zanzare infette, sono state approvate come IACUC protocollo n. 201507682 dalla propagazione University of Florida istituzionali cura degli animali e uso Committee.Virus e gli studi di infezione zanzara erano eseguite presso l'impianto di BSL-3 del laboratorio di entomologia medica Florida a Vero Beach, FL. RT-LAMP esperimenti sono stati eseguiti in laboratorio BSL-2 ha condiviso la foto di FfAME e Firebird LLC di Scienze Biomolecolari a Alachua, FL.

1. disegno di primer e Strand spostando le sonde

1. Estrarre sequenze virali per Dengue 1 dal database Broad Institute²³; sequenze per Zika e chikungunya dal NIAID Virus patogeno Database e analisi delle risorse²⁴.
   1. Creare allineamenti multipli di sequenza (MSAs) per sequenze di interesse utilizzando software muscolo v3.8.31²⁵. Utilizzare MSAs generato per la ricerca di set di primer lampada all'interno di una regione conservata del bersaglio ed evitare obiettivi non pertinenti o non intenzionali, come distinzioni tra sottotipi di un bersaglio.
2. Seguire le regole di progettazione per gli iniettori lampada come descritto online (http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/) e consentire l'uso di basi miste nei primers per coprire il virus divergenza²⁶. Per evitare la cross-reattività dei set di primer, confrontare generato lampada primer per il database di virus del RNA di NCBI utilizzando NCBI BLAST²⁷. Confrontare ogni set per eliminare gli iniettori che sarebbero dimerizzano in un'analisi multiplex utilizzando NCBI BLAST pure.
3. Schermo la parte di double-stranded della sonda strand-spostando contro qualsiasi sequenza del genoma virale e la sequenza genomic zanzara. Modificare la 5'-estremità della sonda di associazione di destinazione con fluorescina amidite (FAM), tintura HEX e 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) tintura per Zika, chikungunya e Dengue 1, rispettivamente.
   1. Includono un set per campioni di urina di primer di controllo positivo. Disegnare primers lampada target DNA mitocondriale umano. Etichetta strand-spostando la sonda con TET estremità 5'. Sonde di quencher di etichetta che sono parzialmente complementari a ciascuno fluorescente etichettati sonda con quencher (ad es., Iowa nero-FQ) 3'-estremità (tabella 1).

2. virus isolati e infettati zanzara campioni

1. Uso degli isolati del virus di Zika (ceppo di Puerto Rico), virus di Chikungunya (ceppo La Réunion o Isole Vergini britanniche) e virus di febbre rompiossa sierotipo-1 (ceppo di Key West). Determinare i titoli virali mediante placca dosaggio²⁸ o di RT-PCR quantitativa²⁹. Estrarre RNA virale utilizzando disponibili in commercio kit di estrazione di RNA.
   Nota: La tabella 2 rappresenta i titoli virali di ogni virus isolato utilizzato in questo studio.
2. Seguire l'articolo pubblicato da Yaren et per un protocollo dettagliato circa l'infezione di Ae. aegypti femmine con Zika e chikungunya virus²⁰. Vedere la tabella 2 per il titolo virale del campione zanzara infettato con il virus di Zika.

3. RT-LAMP accoppiato con uracile termolabile DNA glicosilasi

1. 10 x preparazione della miscela di primer.
   1. Preparare soluzione stock di 100 µM di ogni primer e sonde (Vedi punto 1) aggiungendo acqua gratuita nucleasi. Vortice bene e conservare a-20 ° C fino all'utilizzo.
   2. Per 10 mix di Primer X per ogni Zika, Dengue 1 o bersaglio di DNA mitocondriale, mix 16 µ l di FIP, 16 µ l BIP, 2 µ l di F3, 2 µ l di B3, 5 µ l di LF, 2 µ l di LB, 3 µ l di LB-fluorescente etichettati sonda, 4 µ l di sonda quencher e 50 µ l di acqua priva di nucleasi per un totale di 100 µ l di volume.
   3. Per 10 X Primer mix per Chikungunya, mescolare 16 µ l di FIP, 16 µ l BIP, 2 µ l di F3, 2 µ l di B3, 5 µ l di LB, 2 µ l di LF, 3 µ l di LF-fluorescente etichettati come sonda, 4 µ l di sonda quencher e 50 µ l di acqua priva di nucleasi per un totale di 100 µ l di volume.
      Nota: La sonda concentrazione descritta sopra usi 300 nM di finale sonda fluorescente e 400 nM della sonda quencher. In alternativa, utilizzare 80 nM di sonda fluorescente contrassegnata e 200 nM di sua sonda quencher per analisi in tempo reale.
2. Aggiungere 5 µ l di miscela primer: 10x (per 3-plex, aggiungere 5 µ l di ogni 10 X mix di primer), 5 µ l di tampone di amplificazione isotermica 10x (1x buffer di composizione: tampone 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 50 mM KCl, 10mm (NH₄)₂SO₄, 8mm MgSO₄ 0.1% Tween-20, 1 millimetro DTT), 7 µ l di miscela di dNTP (10 millimetri di dATP, dCTP e dGTP; 5mm di dTTP e dUTP), 16 unità di DNA polimerasi, 15 unità di trascrittasi inversa, 80 unità di inibitore ricombinante ribonucleasi, 2 unità di UDG termolabile, 1-2 µ l di quantità variabili di vi RAL RNAs e acqua per portare il volume totale fino a 50 µ l in un mL 0,25 PCR tube (Vedi Tabella materiali).
3. Comprendono le analisi di controllo negativo in questa fase da sostituendo virale RNA volume con acqua. Incubare i campioni tra 65-68 ° C per 45 min a 1 h, quindi analizzare mediante l'esecuzione di 5 µ l di ogni campione su gel di agarosio al 2,5% in 1 tampone di X TBE contenente bromuro di etidio (0,4 µ g/mL). Utilizzare un 25 bp o scala del DNA di 50 bp come marcatore sul gel.
   Nota: Aggiunta di un modello specifico non bersaglio è facoltativa.
4. Per rilevare la presenza di RNA patogeno, testare ogni set di primer ed il relativo controllo no-modello variando la concentrazione di temperatura e/o magnesio, poiché ogni set di primer RT-LAMP è stato progettato per funzionare a temperature variabili (65 ° C a 68 ° C) o magnesio concentrazioni (da 6 a 10 mM finale). Preparare gli esperimenti a temperatura ambiente.

4. RT-lampada usando urina a spillo RNA virale

1. Primer RT-lampada di prova in varie concentrazioni finali di urina (0%, 10%, 20% e 50%) in 50 µ l di volume di reazione totale. Per concentrazione di urina finale del 10%, aggiungere 1 µ l di RNA virale a 5 µ l di urina. Per la concentrazione di urina finale del 20%, aggiungere 1 µ l di RNA virale a 10 µ l di urina. Per concentrazione di urina finale del 50%, aggiungere 1 µ l di RNA virale a 25 µ l di urina.
2. Per monitorare in tempo reale RT-LAMP nel 10% delle urine, utilizzare uno strumento PCR in tempo reale (Vedi Tabella materiali) con fluoroforo diversi filtri.
   1. Per leggere i segnali di fluorescenza da ampliconi FAM-etichettati per Zika, utilizzare un filtro che vanno da 483 a 533 nm; per ampliconi HEX-etichettati per chikungunya, utilizzare un filtro che vanno da 523 a 568 nm; per ampliconi TAMRA-etichettati per Dengue 1, utilizzare un filtro che vanno da 558 a 610 nm; e per ampliconi TET-etichetta per il DNA mitocondriale, utilizzare un filtro che vanno da 523 a 568 nm.
      Nota: FAM ha maxima di eccitazione e di emissione di 495 nm e 520 nm, rispettivamente. HEX è maxima di eccitazione e di emissione di 538 nm e 555 nm, rispettivamente. TAMRA ha maxima di eccitazione e di emissione di 559 nm e 583 nm, rispettivamente. TET ha maxima di eccitazione e di emissione di 522 nm e 539 nm, rispettivamente.
3. Uso 96 pozzetti e sigillo la piastra con un foglio di plastica trasparente, quindi incubare i campioni a 65-68 ° C per 60-90 min e registrare la fluorescenza ogni 30 s utilizzando il ciclatore luce. Inizialmente utilizzare 80 nM di sonde fluorescente identificate e poi prova il 300 nM di sonde fluorescente contrassegnate.
   1. Determinare il limite di rilevamento per ogni destinazione aggiungendo in serie diluito RNA virale nella concentrazione di urina finale del 10%.
      Nota: Utilizzare in tempo reale RT-LAMP per determinare la temperatura ottimale, la concentrazione di magnesio, sonda fluorescente contrassegnati concentrazione e tempo di reazione.
4. Per visualizzare la fluorescenza generata dalle sonde displaceable strand dall'occhio, utilizzare una sorgente di luce LED blu da un ciclatore luce con eccitazione a 470 nm (qualsiasi casella di elettroforesi del gel con built-in fonte di luce blu sarà lavorare, vedere tabella dei materiali) e registrare l'immagine con una cellulare fotocamera a temperatura ambiente al buio.
   Nota: Uso 300 nM di sonde fluorescente contrassegnate, quando è richiesta la visualizzazione di tutti i tre colori dall'occhio utilizzando LED blu.

5. RT-lampada sul rilevamento delle zanzare Zika-infetto utilizzando tecnologia Q-Paper

1. Preparare quaternario d'ammonio-modificato filtro carta (Q-carta), secondo i metodi precedentemente pubblicati con lievi modifiche³⁰.
   1. Immergere 1 g di cerchi di carta da filtro di cellulosa (Vedi Tabella materiali) con un diametro di 3,5 cm in 50 mL di 1,8% di soluzione acquosa di NaOH per 15 min per l'attivazione.
   2. Raccogliere la carta attivata cerchi di filtrazione sotto vuoto e poi immergerli in 40 mL di soluzione acquosa di cloruro di (2,3-epossipropil) trimetilammonio (0,28 g) durante la notte a temperatura ambiente.
      Nota: Mantenere il rapporto massa di (2,3-epossipropil) trimetilammonio cloruro di carta da filtro a 0.28-1.
   3. Raccogliere la carta cationica risultante dalla filtrazione sotto vuoto e neutralizzare con 50 mL di 1% di acido acetico.
   4. Lavare la carta tre volte con etanolo e asciugare all'aria sotto un cofano con flusso d'aria costante.
2. Tagliare i fogli di carta Q in piccoli rettangoli (3 x 4 mm) utilizzando un pugno di carta o forbici. Schiacciare le zanzare femmina Ae. aegypti potenzialmente infettate con Zika su ogni carta con un pestello di micro.
3. Aggiungere a ogni carta 20 µ l di soluzione di ammoniaca acquosa 1 M (pH ≈ 12) e aspettare per 5 min. Poi lavare ogni carta una volta con 20 µ l di 50% EtOH e una volta con 20 µ l di acqua priva di nucleasi. Asciugare la carta in BSL-2 di biosicurezza per circa 1 h.
   Nota: A questo punto, campioni possono essere conservati a-20 ° C durante la notte fino all'utilizzo.
4. Con una pinzetta, posizionare ogni carta in 100 µ l di miscela di reazione di RT-LAMP e incubare a 65-68 ° C per 45 min. Assicuratevi di immergere completamente la carta nella soluzione; esso non dovrebbe essere mobile. Leggere e registrare la fluorescenza derivanti da virus di Zika con sorgente luminosa a LED blu e filtro di colore arancio o giallo.

6. liofilizzazione di RT-LAMP reagenti per 100 µ l di Volume di reazione

1. Preparare 10 X lampada primer miscela conformemente al punto 3.1 e preparare la miscela di dNTP contenenti dUTP conformemente al punto 3.2. Conservare la miscela di primer e dNTPs a-20 ° C fino all'utilizzo.
2. Preparare 10 mL di tampone di dialisi enzimatico per rimuovere glicerolo, mescolando 100 µ l di 1 M Tris-HCl pH 7.5, 500 µ l di 1 M KCl, 2 µ l di EDTA 0.5 M, 100 µ l di 10% Triton X-100, 100 µ l di 0,1 M DTT e 9,198 mL di acqua priva di nucleasi. Memorizzare nel buffer di dialisi a 4 ° C.
   Nota: Assicurarsi di filtro (filtri da 0,2 micron) tutte le soluzioni di reagente tampone prima dell'utilizzo e conservare a 4 ° C.
   1. Utilizzare una membrana di ultrafiltrazione con limite di cut-off di 10 kDa (Vedi Tabella materiali). Posto 350 µ l di tampone di dialisi, 4 µ l di 32 unità della DNA polimerasi, 2 µ l di 30 unità della trascrittasi inversa e 2 µ l di 80 unità di inibitore di RNAsi in membrana di ultrafiltrazione e centrifugare a 14.000 x g per 5 min a 4 ° C.
   2. Aggiungere un altro 350 µ l di tampone di dialisi alla membrana di ultrafiltrazione e centrifugare (14.000 x g) per 5 min, un altro vuoto del tubo di raccolta e ripetere questo passaggio, quindi centrifugare (14.000 x g) per 3 min.
   3. Per l'eluizione, la membrana e posizionarlo in un nuovo tubo di raccolta. Spin a 1.000 x g per 2 minuti misura il volume di eluizione; Se meno di 8 µ l, portare il volume fino a 8 µ l con l'aggiunta di buffer di dialisi. Memorizzare l'eluizione a 4 ° C e procedere immediatamente al passaggio successivo.
      Nota: Questo protocollo è per liofilizzazione tubo singolo, ma preparare almeno 10 provette di reazione contemporaneamente utilizzando la stessa membrana di ultrafiltrazione e utilizzare la stessa quantità di tampone di dialisi.
3. Mescolare 10 µ l di primer X lampada 10 se singleplex (per 3-plex, aggiungere 10 µ l di ogni 10 X mix di primer), 14 µ l di miscela di dNTP, 8 µ l di miscela di enzima dializzati, 2 µ l di 2 unità degli UDG termolabile e 66 µ l di nucleasi acqua (per 3-plex gratis utilizzare 46 µ l) in un tubo del microcentrifuge 0,5 mL e lasciare il coperchio aperto. Al contrario, aggiungere un altro Coperchio perforato con un ago per consentire la fuoriuscita di vapore.
4. Immediatamente congelare le provette a-80 ° C per 2 h e lyophilize il tubo per 4 h. coperchio della camera di liofilizzazione con foglio di alluminio per la protezione dalla luce. Quando i reagenti vengono essiccati, rimuovere i coperchi forati, chiudere il coperchio originale e conservare le provette con i reagenti liofilizzati a 4 ° C al buio.
   Nota: I reagenti possono essere liofilizzati durante la notte, se necessario.

7. test liofilizzato RT-LAMP reagenti su Urine e campioni di zanzara contenenti Zika

1. Utilizzare i seguenti elementi del kit (Vedi la Tabella materiali) per Zika: una finestra di osservazione 3D-stampato con filtro arancione (filtro passa-lungo, taglio-su ~ 540 nm), 2 batterie AAA per l'osservazione di casella, liofilizzato etichettate ZV per rilevamento Zika, le provette di reazione e 1.1 tubi di X reidratazione Buffer in 1,5 mL con tappo a vite.
2. Preparare 50 mL di 1.1 X buffer di reidratazione mescolando 5,5 mL di tampone di amplificazione isotermica che arriva con DNA polimerasi 10x (Vedi la Tabella materiali), 3,3 mL di 100mm MgSO₄, 110 µ l di 0,5 M DTT e 41,09 mL di acqua priva di nucleasi. Mescolare bene, aliquotare 1 mL di questa soluzione per provette da 1,5 mL tappo a vite e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
3. Aggiungere 90 µ l di tampone di reidratazione X 1,1 a ciascuna provetta di reazione (0,5 mL). Assicurarsi che il liquido riempie il fondo della provetta contenente i reagenti liofilizzati (dissolvenza con miscelazione agitando, poi brevemente rotazione verso il basso (1.000 x g)). Aggiungere 10 µ l di campione di urina addizionato con RNA virale per le provette di reazione (vedere sezione 4.1 per dettagli).
   1. Se il test zanzare, aggiungere un rettangolo di Q-carta holding carcasse zanzara (come preparato nei passaggi descritti nelle sezioni 5.2 e 5.3), insieme a 10 µ l di acqua invece di campioni di urina purificata.
      Nota: In alternativa, aggiungere 10 µ l di campioni di saliva o siero invece di urina. Se i campioni sono estratti DNA o RNA, aggiungere 2-5 µ l del campione nell'impasto reidratato e completare con acqua priva di nucleasi a 10 µ l di volume del campione finale.
4. Chiudere il coperchio delle provette di reazione. Metterli in una vasca/blocco di calore (o incubatrice) pre-impostati di 65-68 ° C. Incubare per 30-45 min, ma non più di 1 h. Dopo l'incubazione, togliere il tubo dal fuoco. Per evitare la contaminazione dei saggi di futuri, assicurare che questi tubi rimangono chiusi.
5. Provette di reazione del luogo nella casella di osservazione; la temperatura scenderà a temperatura ambiente (preferibilmente 25 ° C). Accendere l'interruttore sul retro della finestra di osservazione. Osservare il campione attraverso il filtro arancio e catturare l'immagine di un cellulare fotocamera che si tiene a distanza dove l'immagine riempia l'80% del campo di vista.
   Nota: Migliore visualizzazione avviene in ambienti scarsamente illuminati.
6. Al termine della visualizzazione, spegnere l'interruttore. Conservare le provette sigillate al buio, preferibilmente con refrigerazione, se è richiesta la visualizzazione successiva.

Risultati

Inizialmente, le prestazioni di ogni primer RT-LAMP (tabella 1) con il suo corrispondente virale RNA substrato così come controlli negativi sono state valutate mediante elettroforesi in gel. Primer RT-LAMP sono stati progettati per NS5 regione target (RNA polimerasi RNA-dipendente) Zika e Dengue 1 e nsP2 regione (proteine non strutturali P2) per Chikungunya. Modelli erano RNA totale Estratto da stock virali coltivati in cellule di rene (Vero) cercopiteco africano. In un ...

Discussione

Zanzara virus compreso Zika, chikungunya e dengue minacciano la salute pubblica ed evidenziazione di focolai Zika risale la necessità di alternative di rilevazione di point-of-care di basso costo per la diagnostica del paziente, nonché per la sorveglianza di zanzara. Come alternative a prezzi accessibili ai sistemi basati su PCR sono stati sviluppati metodi di amplificazione isotermica. In particolare, sono state applicate piattaforme basate su RT-lampada per rilevare un'ampia gamma di agenti patogeni. Tuttavia, l'uso ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SafeBlue Illuminator/ Electrophoresis System, MBE-150-PLUS	Major Science	MBE-150	Gel electrophoresis
G:BOX F3	Syngene	G:BOX F3	Gel imaging
LightCycler 480 Instrument II, 96-well	Roche Applied Science	05 015 278 001	Real-time PCR
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane	Millipore Sigma	UFC501096	ultrafiltraton membrane for dialysis
Eppendorf 5417C Centrifuge	Marshall Scientific	EP-5417C	centrifuge
Myblock Mini Drybath	Benchmark Scientific	BSH200	drybath
FreeZone Plus 6 Liter Cascade Console Freeze Dry System	Labconco	7934020	lyophilizer
all priers and probes	IDT	custom	RT-LAMP primers and probes
dNTP set	Bioline	BIO-39049
Deoxyuridine Triphosphate (dUTP)	Promega	U1191
Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase	New England Biolabs	M0538L	enzyme
WarmStart RTx Reverse Transcriptase	New England Biolabs	M0380L	enzyme
RNase Inhibitor, Murine	New England Biolabs	M0314L	enzyme
Antarctic Thermolabile UDG	New England Biolabs	M0372L	enzyme
50bp DNA Step Ladder	Promega	G4521	marker
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white	Roche Applied Science	4729692001	real-time RT-LAMP analysis