Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli

Riepilogo

Codice genetico espansione serve come un potente strumento per studiare una vasta gamma di processi biologici, compreso l'acetilazione della proteina. Qui dimostriamo che un protocollo facile sfruttare questa tecnica per la generazione in modo omogeneo acetilato proteine in siti specifici in cellule di Escherichia coli .

Abstract

Modificazioni post-traduzionali che si verificano alle posizioni specifiche delle proteine hanno dimostrati di svolgere un ruolo importante in una varietà di processi cellulari. Fra loro, acetilazione reversibile lisina è uno dei più ampiamente distribuita in tutti i domini della vita. Sebbene siano stati condotti numerosi studi basati sulla spettrometria di massa acetylome, ulteriore caratterizzazione di questi bersagli putativi acetilazione è stato limitato. Una possibile ragione è che è difficile generare proteine puramente acetilati alle posizioni desiderate dalla maggior parte degli approcci biochimica classica. Per superare questa sfida, la tecnica di espansione del codice genetico è stata applicata per utilizzare la coppia di una variante di derivati dal pyrrolysyl-tRNA sintetasi e sue cognate tRNA da specie Methanosarcinaceae , per dirigere l'incorporazione di cotranslational di acetyllysine presso il sito specifico della proteina di interesse. Dopo la prima applicazione nello studio di acetilazione dell'istone, questo approccio ha facilitato gli studi di acetilazione su una varietà di proteine. In questo lavoro, abbiamo dimostrato un protocollo facile per produrre proteine site-specifically acetilati utilizzando il batterio Escherichia coli di modello come host. La malato deidrogenasi è stata utilizzata come un esempio di dimostrazione in questo lavoro.

Introduzione

Modificazioni post-traduzionali (PTM) delle proteine si verificano dopo il processo di traduzione e derivano da covalente aggiunta di gruppi funzionali ai residui dell'amminoacido, giocando ruoli importanti in quasi tutti i processi biologici, tra cui gene trascrizione, risposta allo stress, differenziazione cellulare e metabolismo^1,2,3. Ad oggi, circa 400 distintivo PTMs sono state identificate⁴. La complessità del genoma e del proteoma è amplificata in grande misura dalla proteina PTMs, come essi regolano la localizzazione e l'attività della proteina e influenzare l'interazione con altre molecole come proteine, acidi nucleici, lipidi e cofattori⁵.

Acetilazione della proteina è stato all'avanguardia di PTMs studi nell'ultimo ventennio^{6,7,8,9,10,11,12}. Acetilazione di lisina in primo luogo è stato scoperto in istoni più di 50 anni fa^13,14, ha stato bene esaminato ed è conosciuta per esistere in più di 80 fattori di trascrizione, regolatori e varie proteine^{15, 16,17}. Studi sull'acetilazione della proteina hanno non solo ci ha fornito una comprensione più profonda dei suoi meccanismi di regolamentazione, ma anche trattamenti per un certo numero di malattie causate da disfunzionale acetilazione^18,19, guidati ^{20 , 21 , 22 , 23}. si credeva che l'acetilazione lisina accade solo negli eucarioti, ma recenti studi hanno dimostrato che acetilazione di proteina svolge anche ruoli chiave in fisiologia batterica, tra cui chemiotassi, resistenza agli acido, attivazione e stabilizzazione di Isole di patogenicità e altri virulenza relative proteine^{24,25,26,27,28,29}.

Un metodo comunemente usato per caratterizzare biochimicamente acetilazione di lisina è mediante mutagenesi sito-diretta. Glutamina è usata come un mimo di acetyllysine a causa delle sue dimensioni simili e la polarità. Arginina è utilizzata come un mimo di lisina non-acetilati, poiché esso conserva la sua carica positiva in condizioni fisiologiche, ma non può essere acetilato. Tuttavia, entrambi imita non è veri isosteri e non sempre danno i risultati attesi³⁰. L'approccio più rigoroso è quello di generare in modo omogeneo acetilati proteine ai residui di lisina specifico, che è difficile o impossibile per i più classici metodi a causa della bassa stechiometria di acetilazione di lisina in natura^7,11. Questa sfida ha stata svelata dalla strategia di espansione di codice genetico, che impiega una derivati dal pyrrolysyl-tRNA-sintetasi variante da Methanosarcinaceae specie di addebitare tRNA^Pyl con acetyllysine, utilizza l'host traslazionale macchinari per sopprimere l'UAG codone nel mRNA di arresto e dirige l'incorporazione di acetyllysine in posizione progettata della proteina bersaglio³¹. Recentemente, abbiamo ottimizzato questo sistema con una migliore EF-Tu-associazione tRNA³² e un aggiornato acetyllysyl-tRNA sintetasi³³. Inoltre, abbiamo applicato questo sistema avanzato incorporazione negli studi di acetilazione di malato deidrogenasi³⁴ e tyrosyl-tRNA sintetasi³⁵. Qui, dimostriamo il protocollo per la generazione di proteine puramente acetilati dalla clonazione molecolare per l'identificazione biochimica utilizzando la malato deidrogenasi (MDH), che abbiamo studiato estesamente come esempio dimostrativo.

Protocollo

1. mutagenesi del Gene Target

Nota: MDH è espresso sotto promotore T7 nel vettore pCDF-1 con l'origine di CloDF13 e un numero di copia di 20 a 40³⁴.

1. Introdurre il codone di stop ambra nella posizione 140 nel gene di primer (forward primer: GGTGTTTATGACTAGAACAAACTGTTCGGCG e reverse primer: GGCTTTTTTCAGCACTTCAGCAGCAATTGC), seguendo le istruzioni del kit di mutagenesi sito-diretta.
2. Amplificare il plasmide di modello che contiene il gene della deidratasi di selvaggio-tipo malate e inserire la mutazione del codone di arresto dalla reazione della polimerasi reazione a catena (PCR). Nella miscela di reazione, sono 12,5 µ l della miscela enzima di 2 X DNA polimerasi, 1.25 µ l di 10 µM Forward primer, 1.25 µ l di primer Reverse di 10 µM, 1 µ l di DNA campione (20 ng / µ l) (pCDF-1 plasmide contenente il gene di tipo selvatico MDH) e 9 µ l di acqua priva di nucleasi.
   1. Utilizzare parametri di reazione di PCR come segue: iniziale denaturazione a 98 ° C per 30 s; 25 cicli di 10 s a 98 ° C, 30 s a 55 ° C e 3 min a 72 ° C; estensione finale a 72 ° C per 3 min. Dopo la PCR, aggiungere il materiale amplificato direttamente al mix enzima chinasi-ligasi-DpnI dal kit per 1 h a temperatura ambiente per rimozione circularization e modello.
      Nota: La miscela di reazione contiene 1 µ l di prodotto PCR, 5 µ l di tampone di reazione: 2x, 1 µ l di miscela di enzima 10 X chinasi-ligasi-DpnI e 3 µ l di acqua priva di nucleasi.
3. Aggiungere 5 µ l di miscela di reazione per il tubo di 25 µ l scongelati competente Escherichia coli cellule DH5α dal kit. Attentamente a scatti la provetta per mescolare e mettere il composto sul ghiaccio per 30 min. scossa di calore la miscela a 42 ° C per 30 s e posto in ghiaccio per ulteriori 5 minuti.
   1. Pipettare 600 µ l di temperatura ottimale Super brodo con media di repressione (SOC) dei cataboliti dal kit nella miscela, incubare a 37 ° C per 60 min con agitazione a 250 giri/min, sviluppa 100 µ l su una piastra di agar del brodo (LB) di Lisogenesi con l'antibiotico corrispondente e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.
4. Prendere 4-6 singole colonie in media LB fresco 6 mL con l'antibiotico corrispondente e incubare a 37 ° C per una notte con agitazione a 250 giri/min. Estrarre i plasmidi dall'ogni cultura durante la notte con il kit di purificazione del plasmide, seguendo il manuale del produttore, quindi invia plasmidi per la sequenza di DNA in base al protocollo del prestatore per confermare la mutazione del codone di arresto alle posizioni corrette.
5. Conservare il ceppo con la corretta sequenza a-80 ° C mescolando 1 mL coltura durante la notte e 300 µ l 100% DMSO.

2. espressione della proteina acetilata

1. Inserire i geni di ottimizzato acetyllysyl-tRNA sintetasi³³ e ottimizzato tRNA^{Pyl 32} nel plasmide pTech . Luogo del gene di tRNA sintetasi sotto il promotore costitutivo lpp . Posto del gene tRNA sotto il promotore costitutivo proK ³⁴.
   1. Co-trasformare il vettore di espressione³⁴ contenente il gene mutato contenenti TAG del malato deidrogenasi e il plasmide che harboring il sistema di incorporazione di acetyllysine ottimizzato, in 25 µ l competente scongelati e. coli BL21 (DE3) cellule di shock termico a 42 ° C per 10 s e posto in ghiaccio per ulteriori 5 minuti.
   2. Pipettare 600 µ l di temperatura media SOC in miscela, incubare a 37 ° C per 60 min con agitazione a 275 giri/min, sviluppa 100 µ l in un piatto con 100 µ g/mL di streptomicina e cloramfenicolo di 50 µ g/mL e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 275 giri/min.
2. Pick up una singola Colonia dalla piastra e inoculare in media LB freschi 15ml con 100 µ g/mL di streptomicina e cloramfenicolo 50 µ g/mL in una provetta da 50 mL durante la notte a 37 ° C con agitazione alla velocità di 250 giri/min. Trasferire la cultura notte 15 mL media LB fresco 300 mL con antibiotici in un pallone da 1 L e incubare a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.
3. Sciogliere acetyllysine con acqua per fare la soluzione di riserva di 100 mM, conservare a 4 ° C. Aggiungere acetyllysine di 5 mM e 20 mM nicotinammide (inibitore delle deacetilasi) ai media crescita quando assorbanza raggiunge 0,5 a 600 nm.
   1. Crescere le cellule per un ulteriore 1 h a 37 ° C, agitando a 250 giri/min, poi aggiungere 0,5 mM IPTG per l'espressione della proteina e far crescere cellule a 25 ° C durante la notte, con agitazione a 180 giri/min.
      Nota: Le condizioni di espressione possono bisogno di ottimizzazione per diverse proteine.
4. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g a 4 ° C per 15 min, scartare il surnatante e lavare palline delle cellule con il tampone fosfato salino (PBS) buffer (10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl). Raccogliere cellule lavate a 10.000 x g a 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante e archiviare palline delle cellule a-80 ° C.

3. la purificazione della proteina acetilata

1. Scongelare il pellet di cellule congelate su ghiaccio e risospendere con 15 mL di tampone di lisi (50mm tris (idrossimetil) amminometano (Tris) a pH 7,8, 300 mM NaCl, imidazolo di 20 mM e 20 mM nicotinammide), 5 µ l di β-mercaptoetanolo e nucleasi di 1 µ l Benzonase (250 unità).
2. Rompere le cellule di sonicazione 40 kHz a 70% potenza di uscita con 10 cicli di 10 brevi raffiche di s, seguite da intervalli di 30 s per il raffreddamento estratto grezzo di forma. Centrifuga del greggio estratto a 20.000 x g per 25 min a 4 ° C. Filtrare il surnatante con il filtro a membrana da 0,45 µm e caricare in una colonna contenente 1 mL di nichel-nitrilotriacetico acido resina (Ni-NTA) equilibrata con 20 mL di acqua e 20 mL di tampone di lisi.
   Nota: Cellule detergenti delicati, potrebbero essere interrotta anche se sonicazione non è disponibile.
3. Lavare la colonna con 20 mL di tampone di lavaggio (50 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, imidazolo di 50 mM e 20 mM nicotinammide) e quindi eluire con 2 mL di tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, imidazolo di 150 mM e 20 mM nicotinammide).
4. Dissalare la frazione di eluizione con desalificazione buffer (25 mM Tris pH 7,8 e 10 mM NaCl) dalla colonna PD-10, seguendo il manuale del produttore. Misurare la concentrazione della proteina eluita seguendo le istruzioni del reagente di analisi della proteina di Bradford. La proteina dissalata è pronta per ulteriori esperimenti.
   Nota: Fare magazzino di glicerolo di 50% della proteina e mantenere a-80 ° C per la conservazione.

4. Descrizione biochimica della proteina acetilata

1. Analisi di spettrometria di massa e SDS-PAGE.
   1. Denaturare le proteine con il sodio dodecil solfato (SDS) tampone del campione (campione di proteina 5 µ l con 2 µ l 4 X tampone campione SDS) in una provetta da 2 mL a 105 ° C per 5 min, centrifugare la miscela a 2000 x g per 10 s, carico sui 4-20% sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide electroph gel di oresis (SDS-PAGE) ed eseguire a 200 V per 30 min.
   2. Lavare il gel con acqua distillata e agitare delicatamente per 5 min, ripetendo il processo 3 volte. Eliminare l'acqua e macchia il gel con la macchia blu di Coomassie per 1 h con agitazione delicata. De-macchia il gel con acqua distillata, agitare delicatamente per 30 min e ripetere questo de-macchia 3 volte.
   3. Tagliare la banda al kDa 33 sul gel di SDS-PAGE di Coomassie blu-macchiato e inviarlo a: Servizi di spettrometria di massa o aziende per confermare che il acetyllysine è stato incorporato nella posizione progettata.
      Nota: Il protocollo di analisi di spettrometria di massa ha seguito il precedente esperimento³⁴.
2. Macchiarsi occidentale
   1. Esegua il gel di SDS-PAGE con lo stesso protocollo al punto 4.1. Dopo il gel di eseguire, immergere il gel con il buffer di trasferimento (25 mM Tris, glicina 192 mM, pH 8.3 e 20% metanolo) per 15 min.
   2. Attivare un 0,2 µm, membrana di 7 x 8,5 cm polivinilidene difluoruro (PVDF) con metanolo per 1 min e sciacquare con tampone di trasferimento prima di preparare il panino di trasferimento.
      Nota: Il metanolo è pericoloso in caso di contatto con la pelle, contatto con gli occhi, ingestione o inalazione. Sovresposizione severa può provocare la morte.
   3. Fare il panino di trasferimento dal catodo all'anodo (spugna, carta da filtro, SDS-PAGE gel, PVDF membrana, carta da filtro e spugna). Mettere la pila in carro armato di trasferimento, eseguito a corrente costante di 350 mA per 45 min.
      Nota: Tempo di trasferimento potrebbe bisogno di ottimizzazione.
   4. Lavare la membrana PVDF con 25 mL Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20 (TBST) (137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0.1% Tween-20, pH 7.6) buffer per 5 minuti con agitazione delicata. Bloccare la membrana con 5% di albumina di siero bovino (BSA) nel buffer TBST per 1 h a temperatura ambiente.
   5. Incubare la membrana con acetyllysine-anticorpo HRP-coniugato con una concentrazione finale di 1 µ g/mL diluito con 5% BSA in TBST a 4 ° C durante la notte con agitazione delicata.
      Nota: Per risultati più veloci, questo passaggio potrebbe essere eseguita a temperatura ambiente per 1 h. La diluizione dell'anticorpo può avere bisogno di ottimizzazione.
   6. Lavare la membrana con 20 mL di tampone TBST per 5 minuti con agitazione delicata, ripetere il passo 4 volte. Applicare il substrato di chemiluminescenza per la membrana seguendo le istruzioni del produttore. Catturare il segnale con un imager di macchina fotografica a base di charge coupled device (CCD).

Risultati

La resa di proteina acetilata di MDH era 15 mg al cultura L 1, mentre quello di selvaggio-tipo MDH era 31 mg / cultura 1 L. Le proteine purificate sono state analizzate da SDS-PAGE, come illustrato nella Figura 1. Il selvaggio-tipo MDH è stato usato come un controllo positivo³⁴. La proteina purificata dalle cellule che harboring il sistema di incorporazione di acetyllysine (AcK) e il gene mutante mdh , ma senza AcK in mezzi d...

Discussione

La costituzione genetica degli aminoacidi noncanonical (ncAAs) si basa sulla soppressione di un codone assegnato, per lo più la fermata ambra codone UAG^36,37,38,39, dal tRNA ncAA-pagano contenente l'anticodone corrispondente. Come è noto, il codone UAG viene riconosciuto dalla release factor-1 (RF1) nei batteri, e può anche essere soppressa da vicino cognate tRNAs da host praticati da aminoa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford protein assay	Bio-Rad	5000006	Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain	Bio-Rad	1610786	SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel	Bio-Rad	4561093	Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate)	Cell Signaling	6952	Antibody
IPTG	CHEM-IMPEX	194	Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine	CHEM-IMPEX	5364	Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column	GE Healthcare	17085101	Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit	NEB	E0554	Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells	NEB	C2527	Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Extracting plasmids
Ni-NTA resin	QIAGEN	30210	Affinity purification resin
nicotinamide	Sigma-Aldrich	N3376	Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250	Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent	Sigma-Aldrich	70584	Breaking cells
Benzonase nuclease	Sigma-Aldrich	E1014	DNase
ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	Chemiluminescence
Premixed LB Broth	VWR	97064	Cell growth medium
Bovine serum albumin	VWR	97061-416	western blots blocking