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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione e la valutazione degli anticorpi monoclonali contro prodotti naturali per l'utilizzo in vari test immunologici. Questa procedura comprende l'immunizzazione, la fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto per clone positivo di screening e preparazione di ibridoma monoclonale. A vostra disposizione anche le specifiche per la caratterizzazione dell'anticorpo usando MALDI-TOF-MS e le analisi di ELISA.

Abstract

L'analisi dei componenti bioattivi presenti negli alimenti e prodotti naturali è diventata una popolare area di studio in molti campi, compreso il tradizionale cinese medicina e cibo sicurezza/tossicologia. Molte delle tecniche di analisi classica richiedono attrezzature costose e/o competenze. In particolare, le analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) sono diventati un metodo emergente per l'analisi di alimenti e prodotti naturali. Questo metodo si basa sulla rilevazione dell'anticorpo-mediata dei componenti di destinazione. Tuttavia, come molti dei componenti bioattivi in prodotti naturali sono piccole (< Da 1.000) e non indurre una risposta immunitaria, creazione di anticorpi monoclonali (mAbs) contro di loro è spesso difficile. In questo protocollo, forniamo una spiegazione dettagliata dei passaggi necessari per generare anticorpi monoclonali contro molecole bersaglio, nonché quelli necessari per creare l'associato indiretta competitivo (ic) ELISA per l'analisi rapida del composto nei campioni multipli. La procedura descrive la sintesi dell'antigene artificiale (cioè, il coniugato aptene-carrier), immunizzazione, fusione cellulare, preparazione di ibridoma monoclonale, caratterizzazione del mAb e l'applicazione basata su ELISA del mAb. Il coniugato aptene-carrier è stato sintetizzato dal Sodio Metaperiodato metodo e valutati mediante MALDI-TOF-MS. Dopo immunizzazione, splenocytes sono stati isolati dal mouse immunizzato con il più alto titolo dell'anticorpo e fuso con il deficit di ipoxantina-aminopterina-timidina (cappello) - linea cellulare di mieloma mouse sensibile Sp2/0 - Ag14 utilizzando un polietilene glicole (spina)-metodo basato. Gli ibridomi secernenti anticorpi monoclonali reattivi all'antigene bersaglio sono stati selezionati dall'icELISA per la specificità e la reattività crociata. Inoltre, è stato applicato il metodo di diluizione limitante per preparare ibridomi monoclonale. MAbs finale sono stati ulteriormente caratterizzata da icELISA e poi utilizzate in un'applicazione basata su ELISA per la rilevazione rapida e conveniente dell'aptene esempio (naringina (NAR)) nei prodotti naturali.

Introduzione

Gli anticorpi monoclonali (mAbs), noto anche come anticorpi mono-specifici, sono prodotte da un singolo clone di linfocita b e sono composti da monovalenti anticorpi che si legano al stesso epitopo1. Negli ultimi anni, molti prodotti medicinali vegetali naturali sono stati utilizzati nel trattamento di varie malattie2. Infatti, molti piccoli composti molecolari originariamente derivati da prodotti naturali vengono ora applicate come farmaci di prima linea, come ad esempio artemisinina per malaria e paciltaxel (taxolo) per cancro2,3. Lo studio di prodotti naturali ha fatto rapidi progressi, in gran parte dovuto l'enorme sviluppo e l'ottimizzazione delle tecniche di analisi convenzionali, tra cui la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e spettrometria di massa (MS). Tuttavia, ci sono ancora alcune limitazioni connesse con questi metodi, quali i loro complessi protocolli pretrattamento e costi associati per quanto riguarda il tempo, manodopera/competenze e strumenti necessari4.

Recentemente, sono stati applicati i saggi basati su mAb enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) analizzare qualitativamente e quantitativamente il cibo e prodotti naturali. In realtà, questo metodo è stato applicato per analisi di campioni biologici e per la sperimentazione clinica e ha dimostrato di essere accurati, sensibili e altamente efficiente, evitando anche le fasi di pretrattamento noiose connesse con altre analisi5, 6.

Quando si utilizza basato su mAb ELISAs per studiare prodotti naturali complessi, preparazione degli anticorpi monoclonali è uno dei passi fondamentali. Purtroppo, i mAbs specifici per i piccoli componenti bioattivi presenti in questi tipi di sostanze6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 sono spesso limitati rispetto agli antigeni della proteina. Per ovviare a questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per generare specificamente mAbs contro piccoli composti. Il protocollo presentato qui include sintesi artificiale dell'antigene, mouse immunizzazione, fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto e preparazione di ibridoma monoclonale.

In particolare, il nostro gruppo di ricerca ha studiato la formazione di anticorpi monoclonali contro piccoli composti bioattivi da medicine cinesi tradizionali e sviluppare le proprie applicazioni per anni. Nei nostri studi in corso, abbiamo sviluppato anticorpi monoclonali contro baicalin16, puerarin17, acido glicirrizico18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121e molte altre piccole molecole. I nostri protocolli di ELISA basati su questi anticorpi monoclonali sono stati utilizzati in una serie di studi per valutare la farmacocinetica di queste piccole molecole, come pure le loro interazioni con altri composti bioattivi. Inoltre, usando questi mAbs, abbiamo anche sviluppato metodi di cromatografia di immunoaffinità per la separazione di analoghi strutturali, inclusi epimers. Recentemente, abbiamo preparato un immunoassay di flusso laterale utilizzando il nostro mAb anti-puerarin che è stato successivamente utilizzato per il rilevamento rapido, in loco di questo composto. I nostri risultati indicano che la nostra analisi di mAb-based sono strumenti indispensabili e conveniente per studiare la biologia e la qualità dei composti naturali-prodotto-derivati, in particolare quelli utilizzati nelle medicine cinesi tradizionali.

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Protocollo

Tutte le procedure animale effettuate in questo studio sono state approvate dal comitato di revisione etica presso l'Università di Pechino di medicina cinese (approvazione numero 2016BZYYL00109).

Nota: Topi BALB/c femmina (8 settimane) sono stati immunizzati con aptene-carrier proteico coniugati. Quando usato da solo, una piccola molecola (< Da 1.000) non può suscitare una risposta immunitaria. Tuttavia, coniugando la piccola molecola un risultati di macromolecola di vettore in sintesi di antigene. In questo contesto, la piccola molecola è etichettata un aptene. Coniugazione di aptene è una strategia necessaria ed efficace per la produzione di mAb. Per evitare la cross-reattività, due elementi portanti differenti della proteina, come albumina di siero bovino (BSA) e ovoalbumina (uova) o emocianina di keyhole limpet (KLH) e BSA, deve essere utilizzato come immunogeni (per l'immunizzazione degli animali) e gli antigeni di rivestimento (per rivestire la piastra per anti-siero rilevamento). BSA e gli ovuli vengono utilizzati come esempio nel presente protocollo.

1. preparazione dell'immunogeno e rivestimento antigene

Nota: Per sintesi artificiale dell'antigene, utilizzare il gruppo funzionale appropriato (ad esempio, dell'idrossile, solfidrilico carbossilico acido, o amminico) come il braccio laterale per il legame covalente con la proteina carrier. La coniugazione metodi includono Periodato di ossidazione, il metodo di carbodiimide, una reazione mista anidridi, una reazione di glutaraldeide e il metodo di succinato. Questo protocollo utilizza un glicoside del flavanone ben noto, la naringina (NAR), come un composto di esempio. NAR è un piccolo complesso (Da 581) presente in agrumi, nonché varie medicine cinesi tradizionali.

  1. Utilizzare una procedura di ossidazione periodate per sintetizzare coniugati NAR-BSA e NAR-OVA.
    1. Sciogliere 50 mg di NAR in acqua ad una concentrazione finale di 1mg/mL22.
    2. Aggiungere 100 µ l di sodio preparata al momento periodato soluzione (0,1 M) a 5 mL della soluzione NAR. Lavorare l'impasto a temperatura ambiente per 1 h.
  2. Sciogliere 4 mg di BSA e ovuli in 2,0 mL di tampone di carbonato 50 mM (pH 9,6). Aggiungere questa proteina soluzione al NAR/Sodio Metaperiodato miscela di reazione.
  3. Regolare la miscela a pH 9 con soluzione 1 M Na2CO3 e mescolare a temperatura ambiente per 6-8 h.
  4. Dializzare la miscela di reazione in tampone fosfato salino (PBS) utilizzando una membrana di dialisi (MWCO 10 kDa) per 3 giorni per lo scambio della CBS.
  5. Analizzare il coniugato aptene-carrier utilizzando matrix assistita laser desorbimento/ionizzazione tempo di volo (MALDI-TOF)-MS.
    1. Mescolare 1-10 pmol del coniugato con un 103-piegare eccesso molare di Acido sinapico in una soluzione acquosa contenente 0,15% acido trifluoroacetico (TFA). Asciugare il composto su un piatto di campione in aria.
    2. Eseguire l'analisi utilizzando un MALDI-TOF spettrometro di massa dotato di un laser pulsato azoto operati a 337 nm. Acquisire spettri di massa MALDI ioni positivi in modo lineare all'interno della gamma di massa (m/z) di 15.000-100.000 come descritto precedentemente22.

2. immunizzazione

Nota: Un totale di 5 topi femminili di BALB/c (8 settimane) sono stati utilizzati: 4 per NAR coniugato immunizzazione e 1 per l'immunizzazione di controllo (PBS).

  1. Per la prima vaccinazione, mescolare 50 µ g di coniugato (diluito in 100 µ l di PBS) con un volume uguale di adiuvante completo di Freund (CFA) ed emulsionare completamente. Amministrare 100 µ l di questa miscela per ogni mouse via dorsale iniezione sottocutanea.
  2. Due settimane più tardi, consegnare un booster vaccinazione (100 µ l) tramite iniezione sottocutanea con la stessa quantità di coniugato mescolato con adiuvante incompleto (IFA).
  3. Estratto di 200 µ l di sangue dalla vena della coda di ogni mouse 7 giorni più tardi per ottenere siero.
    1. Centrifugare il sangue a 3.000 x g per 10 min. trasferire il siero surnatante in una nuova provetta.
    2. Analizzare il siero usando un ELISA come descritto in precedenza21. Scegliere il mouse con il più alto titolo del siero da utilizzare per la fusione delle cellule.
  4. In preparazione per la fusione cellulare, amministrare un'immunizzazione pulsata per il mouse selezionate tramite l'iniezione intraperitoneale di 50 µ g del coniugato a 300 µ l di PBS senza adiuvante 3 giorni prima della fusione.
    Nota: Questo passaggio può essere omesso se il titolo è abbastanza alto.

3. preparazione per la fusione delle cellule

  1. Preparazione delle cellule di fusione media
    1. Per il terreno selettivo di ipoxantina-aminopterina-timidina (cappello): sciogliere 50 x supplemento di media di cappello in 10 mL di RPMI-1640 e aggiungere questa miscela a 500 mL di RPMI-1640 che contiene 20% FBS.
      Nota: Quando 10 mL di concentrato 50x sono diluiti in 500 mL di terreno di coltura, le concentrazioni finali di ipoxantina, aminopterina e timidina sono 100 µM, 0,4 µM e 16 µM, rispettivamente.
    2. Per i media di ipoxantina-timidina (HT): sciogliere 50 x supplemento di media HT in 10 mL di RPMI-1640 e aggiungere questa miscela a 500 mL di RPMI-1640 che contiene 20% FBS. Le concentrazioni finali di ipoxantina e timidina sono 100 µM e 16 µM, rispettivamente.
  2. Coltura le cellule Sp2/0-Ag14.
    1. Almeno 7 giorni prima della fusione, scongelare rapidamente una fiala di cellule di mieloma SP2/0-Ag14 del congelato in azoto liquide in acqua tiepida.
    2. Trasferire la soluzione di cella in 5 mL di terreno di coltura fresco (RPMI-1640) e centrifugare per 10 minuti a 1000 x g.
    3. Dopo la centrifugazione, rimuovere il terreno di coltura e risospendere le cellule in RPMI-1640 fresco completati con 10% siero bovino fetale (FBS).
    4. Trasferire le cellule e le medie in un matraccio da2 di 25cm e incubare a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO2.
    5. Espandere le celle a 3 o matracci2 4 75 cm prima della fusione.
  3. Preparazione delle cellule strato alimentatore addominale
    1. Sacrificare un mouse ICR 12-settimana-vecchio albino di dislocazione cervicale 1 giorno prima della fusione cellulare e immergerlo in etanolo di 75%.
    2. Dopo aver rimosso il pelo dall'addome con pinze emostatiche, disinfettare la zona con etanolo al 75%. Tagliare la pelle esterna per esporre la cavità addominale. Iniettare 3 mL di mezzo di RPMI-1640 sterile nell'addome e massaggiare l'addome per staccare le cellule supplementari nella soluzione. Aspirare la sospensione di cellule di alimentatore in una provetta da centrifuga da 15 mL.
    3. Dopo centrifugazione la sospensione cellulare per 10 minuti a 1000 x g, scartare il surnatante e risospendere le cellule di alimentatore in 20 mL di terreno selettivo HAT.
    4. Trasferire le cellule in piastre per colture cellulari di 96 pozzetti (100 µ l/pozzetto). Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C, 5% CO2.

4. fusione cellulare

  1. Dopo il prescelto immunizzati mouse è stato preparato per fusione cellulare (Vedi punto 2.4), somministrare un'iniezione intraperitoneale dell'10% cloralio idrato (anestetico) e sacrificare il mouse immunizzato tramite dislocazione cervicale.
  2. Raccogliere ulteriori sangue dal cuore (1 mL) e preparare il siero come descritto al punto 2.3.1 da utilizzare come controllo positivo durante la selezione dell'ibridoma.
  3. Rimuovere il tessuto della pelle e del muscolo, usando le forbici per esporre la milza.
  4. Isolare la milza con pinzette accuratamente e lavare la milza con RPMI-1640. Tagliate la milza a pezzi e lentamente Libbra della milza per triturare. Preparare una sospensione di cellule di milza premendo il tessuto della milza attraverso un colino di cella 800 maglia in una provetta da centrifuga 50 mL.
  5. Lavare la sospensione delle cellule della milza con medium RPMI-1640. Raccogliere le cellule di milza mediante centrifugazione (1000 x g, 10 min e a 4 ° C) e poi scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte.
  6. Rimuovere le cellule di mieloma coltivata e amplificato dall'incubatrice e delicatamente rubinetto/agitare le beute per ottenere una sospensione cellulare. Lavare questa sospensione con medium RPMI-1640 volte per rimuovere il FBS.
    Nota: Questo è un passo essenziale come FBS può influenzare la fusione cellulare.
  7. Contare le celle e regolare la concentrazione prima della miscelazione con le cellule della milza. Il rapporto finale delle cellule della milza a cellule di mieloma dovrebbe essere tra 1:5 e 01:10.
  8. Mescolare la cellula della milza cellule sospensione e mieloma. Centrifugare la miscela delle cellule (1000 x g, 10 min e a 4 ° C) e rimuovere il surnatante.
  9. Aggiungere 1 mL di soluzione di 50% glicole polietilenico (PEG) alle cellule e mescolare delicatamente a 37 ° C per 1 min. Lasciate riposare per 30 s.
    Nota: La soluzione di PEG impiegata in questa fase dovrebbe contenere 50% (p/v) di polietilenglicole 1500 e 10% (v/v) solfossido dimetilico (DMSO) in PBS senza calcio (Ca2 +).
  10. Aggiungere 2 mL di terreno RPMI-1640 per 2 min terminare la reazione. Aggiungere un ulteriore 2 mL di medium RPMI-1640 per un altro 1 min e quindi aggiungere un ulteriore 10 mL di medium RPMI-1640.
  11. Centrifugare le cellule a 800 x g per 10 min. Dopo aver scartato il supernatante, aggiungere la soluzione HAT e continuare a coltivare le cellule. Aggiungere 100 µ l di sospensione cellulare in tutti i pozzetti delle piastre strato dell'alimentatore, quindi incubare le piastre per 7 giorni a 37 ° C, 5% CO2.
    Nota: In queste condizioni, le cellule di mieloma unfused morirà mentre le cellule di ibridoma continuerà a crescere nel mezzo di cappello. Dopo 7 giorni, Ibridoma monoclonale formerà come un singolo cluster di cellule nel pozzo, mentre pozzetti contenenti policlonale ibridoma avrà più mazzi delle cellule.
  12. Aspirare il supernatante per analisi e sostituire il mezzo con il mezzo di HT.
    Nota: Assicurarsi di sostituire il mezzo di cappello con HT medio primo come passare direttamente a mezzo senza aggiunte è dannosa per l'ibridoma.

5. indiretta ELISA competitivo (icELISA)

  1. Ricoprire una piastra a 96 pozzetti con NAR-OVA (1 µ g/mL, 100 µ l/pozzetto) e incubare per 1h a 37 ° C o una notte a 4 ° C.
  2. Bloccare la piastra con 300 µ l di GPBS (PBS contenente gelatina di 1% m/v) per 1 h a 37 ° C per impedire l'adsorbimento non specifico.
  3. Lavare la piastra tre volte con TPBS (PBS contenente 0,05% v/v Tween-20).
  4. Diluire NAR non coniugata in una serie di concentrazioni con 10% metanolo. Aggiungere 50 µ l di queste diluizioni per pozzetti separati. In altri pozzi, aggiungere 50 µ l di antisiero o ibridomi surnatante (contenente anticorpi monoclonali). Incubare la piastra per 1h a 37 ° C.
  5. Aggiungere 100 μL di marcato con perossidasi anti-IgG di topo in ogni pozzetto e incubare per 1 h.
  6. Dopo aver lavato la piastra tre volte con TPBS, aggiungere 100 µ l di soluzione substrato (0,1 M citrato tampone (pH 4) contiene 0.015% v/v H2O2 e 2 mg/mL di 3, 3', 5, 5'-tetrametil benzidina (TMB)) a ciascun pozzetto ed incubare per 15 min.
  7. Fermare la reazione aggiungendo 50 µ l di 1 M H2così4 in ciascun pozzetto.
  8. Misurare l'assorbanza utilizzando un lettore di micropiastre a 450 nm. Scegliere gli ibridomi che secreto le più alte concentrazioni di anticorpi NAR in loro surnatante per ulteriore preparazione.

6. preparazione di ibridomi monoclonale

  1. Utilizzare il metodo di diluizione limitante per preparare gli ibridomi monoclonale.
    1. Dopo aver tolto il supporto HT gli ibridomi selezionati (cioè, quelli positivi per la secrezione dell'anticorpo NAR), risospendere le cellule in RPMI-1640 e contarli.
    2. Diluire le cellule ad una concentrazione di 1 cella, 2 celle e 4 cellule per pozzetto in 100 µ l di RPMI-1640 in una piastra a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C, 5% CO2.
    3. Dopo 7-10 giorni, è possibile rilevare gli anticorpi NAR nel surnatante mediante il protocollo icELISA (passo 5) della cultura. Trasferire le cellule da ibridomi che sono positivi per gli anticorpi NAR a 24 pozzetti, boccette2 25 cm e 75 cm2 boccette per coltivazione.
  2. Crioconservare gli ibridomi monoclonale.
    1. Raccogliere le cellule e trasferirli per provette da centrifuga.
    2. Dopo centrifugazione le cellule (800 x g, 10 min), rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in congelamento medio (RPMI-1640, 20% siero fetale del vitello (FCS) e 10% DMSO). Trasferire le sospensioni cellulari per provette per criogenia.
    3. Conservare le provette per criogenia in una scatola di raffreddamento gradiente a-80 ° C per 24 h. Quindi trasferire le provette per criogenia per azoto liquido per stoccaggio a lungo termine.

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Risultati

Generazione di ibridomi monoclonale

Il peso molecolare del coniugato aptene-carrier è stato confermato da analisi MALDI-TOF-MS. Come il peso molecolare di BSA e la NAR sono noti, potrebbe essere calcolato il numero di piccole molecole coniugate con BSA. La figura 1 Mostra i risultati rappresentativi spettrali per NAR-BSA22, che consente di...

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Discussione

Qui, presentiamo un protocollo per il successo della produzione di anticorpi monoclonali contro naturale prodotto derivato di piccole molecole. I passi essenziali nella procedura sono stati delineati, e abbiamo dimostrato l'utilità di questo protocollo utilizzando NAR come una piccola molecola di esempio. Gli spettri di esempio, analisi di reattività e icELISA risultati tutti mostrano rappresentante sperimentale e dati di controllo che viene ottenuti utilizzando questo protocollo. Immagini di esempio degli ibridomi for...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da National Natural Science Foundation of China (sovvenzione numeri 81573573, 81473338 e 81503344) e il classico Team di ricerca base prescrizione presso l'Università di Pechino di medicina cinese.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
800 mesh (40 μm nylon) filter FALCON352340
24 well culture plateNUNC119567
25 cm2 FlaskLabserv310109016
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB)Sigma Aldrich860336 1G
75 cm2 FlaskCorning430720
96 well culture plateNUNC117246
bovine serum albuminAMRESCO332
cell strainerFALCON352340
centrifuge tube 15 mLCorning430645
centrifuge tube 50 mLCorning430828
cryotubes, 1 mL Sigma AldrichV7384-1CS
cultivatorDRP-9082 Samsung
dialysis membrane (10kDa)Heng Hui45-10000D
dimethylsulfoxideSinopharm ChemicalDH105-10
electronic balance BS124-S Sartorius
ELISA plates, 96 wellNUNC655101
ethanol, 96%Sinopharm Chemical
Fetal bovine serumGibco16000-044
fetal calf serumInvitrogen10270106
Freund´s adjuvant, completeSigma AldrichSLBM2183V
Freund´s adjuvant, incompleteSigma AldrichSLBL0210V
GelatinAMRESCO9764-500g
Gradient cooler containerNalgene5100-0001
HAT media supplementSigma AldrichH0262-10VL
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibodyapplygenC1308
HT media supplementSigma AldrichH0137-10VL
Inverted MicroscopeIX73Olympus 
keyhole limpet hemocyaninSigma AldrichH8283
MALDI-TOF-MS Axima-CFR  plus  Axima 
Microplate ReaderBioTexELX-800 
mouseVital River BALB/c
ovalbuminBeijing BIODEE5008-25g
PEGSigma AldrichRNBC6325
Penicillin&Streptomycin solutionHycloneSV30010
Pipette 10 mLCOSTAR4488
Pipette 25 mLFALCON357525
RPMI 1640Corning10-040-CVR
skim milkapplygenP1622
sodium periodateSinopharm ChemicalBW-G0008
Sulfo-GMBSPerbio Science Germany22324
TipOne Tips 1,000 µLStarlabS1111-2021

Riferimenti

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Ristampe e Autorizzazioni

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