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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo è centrato sull'analisi quantitativa della complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila, che può essere utilizzato per gli studi della morfogenesi dendritica.

Abstract

Dendriti sono le proiezioni ramificate di un neurone e morfologia dentritica riflette l'organizzazione sinaptica durante lo sviluppo del sistema nervoso. Drosophila larvale arborization dentritico neuronale (da) è un modello ideale per studiare la morfogenesi di dendriti neurali e funzione del gene nello sviluppo del sistema nervoso. Ci sono quattro classi di neuroni da. Classe IV è la più complessa con un modello di ramificazione che copre quasi l'intera superficie della parete del corpo larvale. Precedentemente abbiamo caratterizzato l'effetto di mettere a tacere l'ortologo di Drosophila di SOX5 classe di complessità di un neurone arborization dentritico IV (NDAC) utilizzando quattro parametri: la lunghezza dei dendriti, l'area della superficie di copertura dendrite, il numero totale di rami e la struttura ad albero. Questo protocollo presenta il flusso di lavoro di analisi quantitativa NDAC, composto da dissezione larvale, microscopia confocale e procedure di analisi di immagine utilizzando il software ImageJ. Ulteriore comprensione da sviluppo neuronale e dei suoi meccanismi sottostanti migliorerà la comprensione della funzione di un neurone e fornire indizi circa le cause fondamentali di neurologici e disturbi dello sviluppo neurologico.

Introduzione

Dendriti, che sono le proiezioni ramificate di un neurone, coprono il settore che comprende ingressi di neurone sensoriale sinaptica da altri neuroni1,2. Dendriti sono una componente importante della formazione della sinapsi e svolgono un ruolo critico nella integrazione sinaptici ingressi, così come la stimolazione elettrochimica in un neurone di moltiplicazione. Arborization dentritico (da) è un processo mediante il quale i neuroni formano nuovi alberi dendritiche e rami per creare nuove sinapsi. Lo sviluppo e la morfologia da, come la densità di ramo e modelli di raggruppamento, risultato di processi biologici multi-step e sono altamente correlati alla funzione di un neurone. L'obiettivo del presente protocollo è fornire un metodo per l'analisi quantitativa di complessità arborization neuronale dendritric in Drosophila.

La complessità dei dendrites determina i tipi di sinaptici, connettività e gli input dai neuroni di partner. Modelli di ramificazione e la densità dei dendriti sono coinvolti nell'elaborazione dei segnali che convergono sul campo dendritiche3,4. Dendriti hanno la flessibilità per la regolazione in fase di sviluppo. Per esempio, segnalazione sinaptica ha un effetto sull'organizzazione di dendrite nel neurone somatosensory durante la fase di sviluppo e nel sistema nervoso maturo5. L'istituzione di un neurone connettività si basa sulla morfogenesi e la maturazione dei dendrites. Malformazione dei dendriti è associato con alterata funzione di un neurone. Gli studi hanno indicato che l'anomalia della morfogenesi del neurone da potrebbe contribuire alle eziologie multiple malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD), e morbo di Gehrig / Sclerosi laterale amiotrofica (ALS)6,7,8. Le alterazioni sinaptiche appaiono nella fase iniziale dell'annuncio, in concerto con il declino ed il danno del neurone funzione7,8. Tuttavia, le specifiche di come patologia dendrite contribuisce alla patogenesi di queste malattie neurodegenerative resta sfuggente.

Lo sviluppo dei dendriti è regolato da geni che codificano una complessa rete di autorità di regolamentazione, come la famiglia di Wnt di proteine9,10, fattori di trascrizione e ligandi su cellule recettori di superficie11,12 . Neuroni da Drosophila sono costituiti da quattro classi (classe I, II, III, IV), del quale classe IV da neuroni sono i più complessi modelli di ramificazioni e sono stati impiegati come un potente sistema sperimentale per migliore comprensione morfogenesi13, 14. Durante la morfogenesi precoce, overespressione o RNAi silenziamento di geni in neuroni di classe IV da provocare i cambiamenti nei modelli di ramificazione e dendrite potatura13. È importante sviluppare un metodo pratico per l'analisi quantitativa del arborization dentritico neuronale.

Precedentemente abbiamo indicato che il silenziamento dell'ortologo di Drosophila di SOX5, Sox102F, ha portato alla più brevi dendriti dei neuroni da e ridurre la complessità in classe IV da neuroni15. Qui, presentiamo la procedura di analisi quantitativa per la complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila. Questo protocollo, adattato dalla precedente metodologia descritta, fornisce un metodo breve per analizzare lo sviluppo dei neuroni sensoriali da. Illustra l'etichettatura immagine robusta e il neurone nel terzo instar larvale corpo muro16,17,18,19. È un protocollo prezioso per i ricercatori che desiderano studiare la NDAC e differenze inerenti allo sviluppo in vivo.

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Protocollo

1. preparazione sperimentale

  1. Preparare i seguenti reagenti: tampone fosfato di Dulbecco (PBS); Triton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldeide (PFA), diluita in 4% prima dell'uso; base di elastomero di silicone e dell'agente indurente; mezzo di montaggio Antifade (ad es., prolungare oro); e smalto per unghie.
  2. Preparare la seguente attrezzatura: microscopio di dissezione, due taglienti forcipe e un paio di forbici per microdissezione, un numero di pin per microdissezione, una capsula di Petri per fare il piatto di dissezione, vetrini da microscopio e coprioggetto, un microscopio confocale e un computer con installato il software ImageJ Fiji.

2. larve collezione

  1. Compagno UAS-Sox102F-RNAi mosche con UAS-GFP, ppk-GAL4 o W1118 selvaggio tipo mosche, rispettivamente. Mosche di cultura in condizioni standard a 25 ° C.
  2. ~ 5-6 giorni, raccogliere le larve instar terza dell'UAS-Sox102F-RNAi / ppk-GAL4, UAS-GFP o UAS-GFP e ppk-GAL4 / + controllo attentamente con pinze per dissezione.

3. dissezione delle larve

Nota: Tutte le procedure in questa sezione sono funzionate sotto un microscopio di microdissection. L'ingrandimento è fino agli investigatori. Provare a regolare la visualizzazione ottimale vista. ~ 4-6 ingrandimenti sono raccomandato.

  1. Posto una larva su un piatto di dissezione realizzata in elastomero di silicone base e una cultura di tessuto di Petri.
  2. Appuntare il gancio di bocca della larva per consentire il lato dorsale a faccia in su, e poi pin la coda della larva. Posizionare il lato dorsale in mezzo il più possibile per esporre la linea mediana, che sarà il marcatore di aprirsi.
  3. Aggiungere 200 µ l di PBS alla larva di mantenere l'umidità del corpo.
  4. Fare un taglio con un paio di forbici lungo la linea mediana dorsale tra la due trachee, da caudale al rostrale. Fare un piccolo taglio in ciascuno dei quattro angoli del corpo della larva.
  5. Mettete un perno a ciascuno dei quattro angoli del corpo, così il corpo giace piatto.
  6. Difficoltà la parete del corpo della larva in 4% PFA per 25 min a temperatura ambiente.
  7. Lavare in PBST per 5 min, ripetere altre due volte.
  8. Rimuovere i perni dal tessuto. Quindi trasferire il tessuto su una lastra di vetro, coprire con mezzo di montaggio antifade e montare con un vetrino coprioggetto. Aria secca per 1 h e sigillare i bordi con smalto per unghie.

4. elaborazione di imaging

Nota: Le immagini sono state scattate utilizzando un sistema di microscopio confocale rovesciato. L'utente può fotografare l'esempio utilizzando un obiettivo X 20 (consigliato).

  1. Catturare immagini di serie Z. Aprire la finestra di dialogo "Capture serie Z" nel software microscopio confocale. Determinare l'intervallo per catturare le immagini di serie Z.
    1. Fare clic sul pulsante "Top and Bottom". Determinare la parte superiore e inferiore di posizione e i valori di input "fondo:" e "Top:" caselle. Impostare il "passaggio" nella finestra di dialogo "Catturare serie Z" come 0,5 µm. Fare clic sul pulsante "Esegui ora" per acquisire le immagini di serie Z.
  2. Salvare le immagini ottenute come file TIFF o *.nd2.
  3. Riporre le diapositive in un buio a 4 ° C dopo formazione immagine.

5. dendrite valutazione

Nota: La proteina GFP è stato co-sovraespresso in UAS-GFP e ppk-GAL4 vola nei neuroni da per analisi di imaging di fluorescenza di GFP. La lunghezza, ramificazione e la struttura dei neuroni da nelle larve instar terzo sono stati quantificati. Parametri di analisi includono la lunghezza dei dendriti (µm), superficie (µm2), numero totale di rami e la struttura ad albero (%). La figura 1 Mostra i parametri di analisi in dettaglio.

  1. Lunghezza dei dendriti
    Nota: La lunghezza dei dendriti è la somma di tutti i dendriti etichettati nel plugin di tracciante.
    1. Configurazione ed eseguire software20 ImageJ Fiji (https://fiji.sc/). Quindi dividere le immagini in canali separati, se esistono diversi canali delle immagini.
      Nota: L'immagine in questo protocollo ha solo un canale di GFP.
    2. Eseguire "immagine | Stack | Progetto Z"per ottenere una proiezione di Z; una nuova finestra apparirà con il nome 'Z-proiezione.' Fare clic su "intensità massima" per tipo di proiezione e organizzare i numeri tra fetta di start e stop a seconda fetta su preferenze individuali. Fare clic su "OK". Verrà visualizzata un'immagine di Z-proiezione che chiaramente presenta la proiezione di dendrite.
    3. Tracciare i neurites.
      1. Selezionare "plugin | Segmentazione | Semplice Neurites Tracer"nella finestra di rintracciare i dendrites. Trovare il soma del neurone e quindi fare clic su un punto a un dendrite a partire dal corpo cellulare e un altro punto all'estremità di questo dendrite.
        Nota: Il programma si collegherà i due punti con una linea blu.
      2. Premere "Y" nella finestra del plug-in, se il percorso è chiaro; fino a quando i punti finali del tracciato selezionato nelle immagini visibili è tracciato il percorso di dendrite. Fare clic su "percorso completo" sulla finestra del plugin stesso; il segmento è completato (Figura 2).
        Nota: Alcuni dendriti si è conclusa più lontano i punti di partenza, in cui il percorso è stato diviso in segmenti più piccoli. I segmenti sono stati combinati per fornire un percorso completo per il tracciante.
    4. Al termine di un percorso, tornare a un nuovo punto dove i rami sono. Il nuovo percorso può essere costruito su; la casella di finestra di "Tutti i percorsi" verranno visualizzati i valori di lunghezza di tutti i percorsi (Figura 3). Salvare il file di traccia e continuare con tracce incompiute, come mostrato nella Figura 2.
    5. Esportare i dati di lunghezza di dendrite cliccando, "File | Esporta come *.cvs"nella finestra 'Plugin'. Poi riassumere tutte le lunghezze di percorso ed esportare i dati ad un software di analisi/foglio di calcolo di dati. (Figura 3).
  2. Superficie dei neuroni da
    1. Selezionare lo strumento di disegno a mano libera nella finestra 'Fiji ImageJ'. Tracciare il percorso e quindi collegare l'endpoint. Dal menu 'Analizza', selezionare "Set misure | Area". Fare clic su "misura" dal menu 'Analizza'. Il risultato viene visualizzato in una nuova finestra con il valore per l'area selezionata (Figura 4). Copiare il software di analisi dati.
  3. Totale numero di sportelli e la struttura di ramificazione dei neuroni da
    1. Calcolare il numero totale di rami con l'apertura di "Analisi" e poi "Render | Analizzare i percorsi alleggeriti"nella finestra del plugin di tracciatura (Figura 5).
      Nota: La struttura dell'albero è la somma dei livelli dei rami. Il percorso è stato definito tra il corpo cellulare e i suggerimenti di dendrite e un percorso può includere più rami, come le pergole primari sono i dendriti dal corpo cellulare del neurone. Le pergole secondari sono rami dal primario e così via con le pergole di terziario, Quaternario e quinary. La struttura del dendrite ramificazione è separata a seconda dei livelli dei rami. Per esempio, il primario % è il numero di rami divisi dal numero totale di ramificazione e così via.

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Risultati

I dendriti dei neuroni da sono stati etichettati da co-overexpressing GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) da soma neurale e dendritiche pergole per analisi di imaging di fluorescenza di GFP. La morfologia dei dendriti del neurone da è stato ripreso da un microscopio confocale invertito (Figura 2).

I dendriti dei neuroni da sono stati rintracciati usando il software ImageJ Fiji. Il file è stato utilizzato per ...

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Discussione

Dendriti che innervano l'epidermide sono le regioni ingresso dei neuroni e loro morfologie determinano come informazioni viene ricevuti ed elaborati da singoli neuroni. Morfologia del dendrite di sviluppo riflette la modulazione genica dell'organizzazione di dendrite. Il Drosophila larvale da neurone del sistema nervoso periferico è un modello importante per studiare lo sviluppo di dendrite causa di: 1) la somiglianza funzionale con mammiferi11,12; 2) q...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare William A. Eimer per l'assistenza tecnica di imaging. Quest'opera è stata sostenuta da fondo cura morbo di Alzheimer [per R.E.T], il National Institute of Health [R01AG014713 e R01MH60009 a R.E.T; R03AR063271 e R15EB019704 di A.L.] e la National Science Foundation [NSF1455613 a A.L.].

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphate buffered saline(PBS)Gibco Life Sciences10010-023
TritonX-100Fisher Scientific9002-93-1
Paraformaldehyde(PFA)Electron Microscopy Sciences15714-S
Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agentDow Corning Corportation3097366-0516;3097358-1004
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36931
Fingernail polish CVS72180
Stereo microscopeNikonSMZ800
Confocal microscopeNikonEclipse Ti-E
Petri dishFalcon353001
ForcepsDumont11255-20
Scissors Roboz Surgical Instrument CoRS-5611
Insect Pins Roboz Surgical Instrument CoRS-6082-25
Microscope slides and cover slipsFisher Scientific15-188-52

Riferimenti

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