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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Macchiatura di molecole di DNA per microscopia a fluorescenza permette uno scienziato per visualizzarli durante un esperimento. Nel metodo presentato qui, molecole di DNA sono pre-colorati con coloranti fluorescenti e digeriti con metilazione ed enzimi di restrizione sensibili non-metilazione.

Abstract

Visualizzazione del DNA per la microscopia di fluorescenza utilizza una varietà di coloranti come cianina coloranti. Questi coloranti sono utilizzati a causa della loro alta affinità e sensibilità per il DNA. Al fine di determinare se le molecole di DNA sono integrale dopo il completamento dell'esperimento, è necessario un metodo per determinare se le molecole macchiate sono integrale dalla digestione del DNA con enzimi di restrizione. Tuttavia, macchiato DNA può inibire gli enzimi, quindi è necessario un metodo per determinare quali enzimi si potrebbe utilizzare per fluorocromo macchiato del DNA. In questo metodo, il DNA è macchiato con una tintura di cianina durante la notte per consentire la tintura e il DNA per equilibrare. Prossimo, tinto il DNA è digerito con un enzima di restrizione, caricato in un gel ed electrophoresed. La band di digerire DNA sperimentali vengono confrontate con un digest in silico per determinare l'attività degli enzimi di limitazione. Se c'è lo stesso numero di bande come previsto, la reazione è completa. Più del previsto indicare digestione parziale e meno bande indicano la digestione incompleta. Il vantaggio di questo metodo è la sua semplicità e utilizza attrezzature che uno scienziato avrebbe bisogno per un enzima di limitazione di analisi e di elettroforesi del gel. Una limitazione di questo metodo è che gli enzimi disponibili per la maggior parte degli scienziati sono enzimi commercialmente disponibili; Tuttavia, potrebbe essere utilizzati qualsiasi enzimi di restrizione.

Introduzione

La serie TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 e BOBO-3; Tabella 1) è utilizzata in un'ampia varietà di esperimenti dove la visualizzazione del DNA è richiesto1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la famiglia di dimero cianina è ampiamente usata a causa del loro rendimento quantico, sensibilità e alta affinità per il DNA molecole18,19,20. Cianina dimero tinture hanno grande selettività per il DNA a doppio filamento e quando intercalate hanno un aumento di 100 a 1000 volte di fluorescenza21. Piridinio coloranti (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 e TOTO-3) hanno una lunghezza d'onda di emissione che loro quinolium tingere (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 e POPO-3) controparti (tabella 1)22. Inoltre, è alto il rendimento quantico per dimeri cianina intercalato nel DNA (0.2 - 0.6)22. Tuttavia, usando un enzima per determinare il profilo di metilazione di una molecola di DNA2 o tratto23 di una molecola di DNA già macchiata con colorante fluorescente richiede un metodo per determinare quali enzimi saranno digerire DNA macchiato. Qualsiasi tipo di colorante che si intercala nel DNA o qualsiasi enzima che dà un modello distinguibile del substrato del DNA può essere utilizzato per questo metodo.

Meng et al. in primo luogo determinato il tasso di digestione del DNA precolorato attraverso elettroforesi del gel usando una varietà di differenti tinture24. Maschmann et al ha ricercato nel più profondo di guardare la famiglia TOTO di coloranti. Sia determinato il tasso di digestione del DNA macchiato per vedere se DNA tinto con un colorante specifico potrebbe essere digerito con un enzima di restrizione25. Altri metodi di studio effetti vincolanti di coloranti intercalate con DNA usando la pinzetta ottica26 o NMR27. Entrambi i metodi richiede attrezzature specializzate; mentre questo metodo consente di apparecchiature che hanno maggior parte dei laboratori di biologia molecolare per determinare se un colorante interferisce con una digestione degli enzimi di limitazione.

Inoltre, in altri metodi per misurare la lunghezza di una data molecola, mappatura ottico ha molecole di DNA non colorati su una superficie di forma allungata e digerito il DNA per determinare il tratto e le dimensioni dei frammenti. Intercalazione di tintura ha dimostrato di aumentare la lunghezza del contorno di molecole di DNA fluorescente macchiati e a seconda del colorante usato, le lunghezze di contorno sono diversi21. Questo metodo è stato utilizzato in una varietà di genomi1,3,4,6,13,28,29,30, 31. Tuttavia, se le molecole sono state pre-tinto, a seconda del colorante e l'enzima, l'enzima può non essere in grado di tagliare il DNA colorato con un colorante specifico. Pertanto, questo metodo determina se DNA tinto con un colorante specifico può essere digerito con un enzima. Inoltre, a seconda della concentrazione del colorante e la tintura utilizzata, la mobilità del DNA bande in un gel migrerà più lentamente del DNA nativo a causa lo svolgimento parziale della spina dorsale del DNA per fare spazio per la tintura da inserire tra coppie di basi32 .

Tuttavia, a volte questi coloranti possono parzialmente o completamente per inibire l'azione di alcuni enzimi di restrizione7,24. Ciò è probabilmente dovuto ad un cambiamento strutturale nel DNA causato tramite il collegamento della tintura fluorescente, che può impedire l'enzima di riconoscere la sua sequenza specifica. Comprendere come queste tinture influenzano gli enzimi di limitazione può aiutare negli esperimenti dove è richiesto il profilo di metilazione o il tratto di DNA macchiato.

Nel nostro metodo, DNA è stato macchiato con un fluorocromo di interesse e si digerisce con un enzima di restrizione. Quindi il DNA è stato electrophoresed su un gel, imaging, ed è stato misurato il tasso di digestione degli enzimi di limitazione. Gli enzimi di restrizione sono stati scelti in base al modello di taglio su un gel. Troppe fasce causato sovrapposizione delle bande di DNA e troppo poche band non ha dato un quadro completo della molecola del DNA. C'è un posto dolce per essere in grado di determinare il profilo della molecola del DNA digerito; Pertanto, essa dipenderà il DNA usato e l'enzima. Un vantaggio di questo metodo è la sua semplicità; richiede solo attrezzature utilizzate in una restrizione digestione ed elettroforesi su gel.

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Protocollo

1. preparazione di coloranti, buffer e Gel di agarosio

  1. Preparare le seguenti soluzioni per la colorazione del DNA o la digestione del DNA macchiato.
    1. Preparare 1 x TE (Tris-HCl e acido etilendiamminotetraacetico acido; Soluzione tampone dell'EDTA) con 10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA in un cilindro graduato o matraccio tarato. Conservare a temperatura ambiente (18-25 ° C).
    2. Rendere le aliquote di ogni tintura: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabella 1). 4 µ l di colorante di 1 mM in ambra scuro o 1,5 mL tubo nero e 36 µ l di 1 x TE, mescolare con la pipetta; Questa concentrazione rende una soluzione di tintura di 100 µM (40 µ l totale). Completare questo passaggio per ogni colorante. Conservare a 4 ° C.
      Nota: Evitare di esporre la tintura alla luce per prevenire photobleaching o degradazione del colorante.
    3. Preparare il tampone 1 utilizzando Bis-Tris-propano-HCl 10 mM, 10 mM MgCl2e 100 µ g/mL di sieroalbumina bovina (BSA). Preparare 2 utilizzando 50 mM NaCl, tampone Tris-HCl 10 mM, 10 mM MgCl2e 100 µ g/mL BSA. Preparare il tampone 3 utilizzando 50 mM acetato di potassio, 20 mM Tris-acetato, acetato di magnesio 10 mM e 100 µ g/mL BSA. Ogni enzima avrà bisogno di uno di questi buffer specifici per funzionare.
  2. Preparare le seguenti soluzioni per elettroforesi del gel.
    1. Fare un 6x loading dye combinando bromofenolo 0,25% blu, 0,25% xilene cianolo, 15% Ficoll in dH2O. Store a temperatura ambiente.
    2. Per rendere un'agarosi 0,7% gel, pesare 0,07 g di agarosio gelificante alta di temperatura (HGT) in un matraccio di Erlenmeyer, aggiungere 100 mL di 1 x TAE tampone e porre un becher invertito in cima al pallone.
      1. Riscaldare la soluzione su un piatto caldo fino a quando le bolle cominciano a formarsi sul fondo della boccetta e galleggiante verso l'alto.
      2. Rimuovere la soluzione da piastra calda, lasciare raffreddare la soluzione fino a quando il pallone può essere toccato con una mano nuda e poi versare il gel in uno stampo di gel 24,5 cm x 21,8 cm con un pettine di gel per creare pozzi.
      3. Rimuovere le bolle vicino il pettine o sulla superficie del gel dal popping loro con un puntale e lasciare che il gel a solidificare per almeno 15 minuti. Questo può essere memorizzato in un frigorifero (4 ° C) avvolto in involucro di plastica per 1 settimana evitare l'essiccazione del gel o contaminazione. Per ulteriori informazioni su come eseguire un gel riferirsi a Lee et al. 33 .
        Nota: Utilizzare un pettine di gel con 30 singoli pozzetti. Beh ognuno dovrebbe essere 4,5 mm di larghezza con una profondità di 2 mm. L'altezza del pozzo dipenderà la quantità di gel versato nella casella.
    3. Preparare 1 tampone x TAE (Tris - acetato - EDTA) utilizzando 40 mM Tris-HCl, acido acetico 20 mM e 1 mM EDTA. Conservare a temperatura ambiente (18-25 ° C).

2. preparazione del DNA macchiato

  1. Macchia del DNA di lambda (300-800 ng) utilizzando differenti aliquote di coloranti. Ogni tintura (tabella 1) avrà sei differenti concentrazioni testate, per un totale di 48 reazioni a enzimi di limitazione. Il processo seguente delinea un set up per 1 reazione (Figura 1).
    1. Diluire il DNA di lambda usando 1 x TE a 100 ng / µ l. Conservare a 4 ° C. Fare una soluzione con un volume totale di 300 µ l.
    2. Macchia del DNA di lambda non metilato. Per ogni banda previsto dal digest, stimare 75-100 ng/band. Aggiungere la quantità appropriata di tintura per produrre concentrazioni di 1,9 µM, 3,8 µM, 19,4 µM, 32,2 µM, 48,3 µM, 63,5 µM / 100 ng di DNA.
    3. Incubare per una notte (15h - 18h) a 4 ° C.
    4. Lasciare una reazione senza macchia per agire come un controllo25.
      Nota: Utilizzare non metilato del DNA per la reazione di digestione. Enzimi sensibili di metilazione non possono tagliare regioni metilate di DNA e daranno un aspetto di una digestione incompleta.

3. preparazione del dosaggio degli enzimi di limitazione

  1. Digest macchiato del DNA con un enzima di limitazione per determinare se questo enzima può digerire precolorato DNA (Figura 1).
    1. Il giorno seguente, aggiungere 20 U di enzima di restrizione, 3 µ l di buffer appropriato (tabella 2) e acqua distillata, acqua filtrata e sterilizzati in autoclave per un totale di 30 µ l. Per ogni reazione enzimatica, scegliere il buffer con la massima efficienza di taglio, che può essere trovata sul sito Web del produttore.
    2. Porre le reazioni in un bagno di acqua alla temperatura di attività enzimatica ottimale, elencati nella tabella 2 per 6 enzimi utilizzati nella Maschmann et al., per 2-4 h (tabella 2)25.
    3. Fermare la reazione aggiungendo 2 µ l di 0,5 M EDTA, pH 8.0.

4. Electroeluting macchiato del DNA in un Gel di agarosio

  1. Rimuovere i lati dallo stampo gel 24,5 cm x 21,8 cm (punto 1.2.2) e inserire la vaschetta di elettroforesi del gel il gel. Versare 2,5 L di 1 x TAE tampone nella casella. Rimuovere attentamente il pettine di gel il gel, così i pozzi sono accessibili33.
  2. Pipettare le reazioni degli enzimi di limitazione su una pellicola di plastica e combinare ogni reazione con 6x loading dye. Per ogni soluzione di reazione, aggiungere 1 µ l di 6x loading dye per 5-6 µ l di soluzione di DNA (1x). Pipettare quindi le reazioni (contenente la tintura di caricamento, < 18 µ l) nei pozzetti.
  3. Mescolare 1 µ l di 1 kb ladder, 9 µ l di 1 x TE e 2 µ l di 6x loading dye. Caricare la soluzione nei pozzetti che fiancheggiano le altre soluzioni.
  4. Coprire la vaschetta del gel con carta scura blu o nero o tessuto. Collegare la vaschetta del gel alla rete di alimentazione, impostare l'alimentazione a 30 V ed eseguirlo durante la notte (15-20 h). Spegnere le luci, mentre il gel è in esecuzione, per evitare photocleavage del DNA con etichettato.
  5. La mattina successiva disattivare l'alimentazione. Prendere il gel utilizzando il vassoio e trasferirlo in un contenitore con 45 il bromuro di etidio µ l e 1 L di 1 x TAE tampone. Conservare il contenitore a temperatura ambiente al buio o copertina in carta stagnola per evitare l'esposizione alla luce. Lasciate che la macchia per almeno 45 minuti a temperatura ambiente in gel.
    Attenzione: Utilizzare il bromuro di etidio con guanti e occhiali di protezione. Quando si pulisce il contenitore contenente soluzione di bromuro di etidio e gettando via il gel, consultare le linee guida di smaltimento tuo stati per determinare come trattare con bromuro di etidio usati; Inoltre, altre macchie possono essere utilizzati invece di bromuro di etidio.

5. il Gel di agarosio di imaging

  1. Collocare il gel su un transilluminatore luce blu, che emette la massima resa luminosa tra 400-500 nm. Scattare foto con la fotocamera collegata alla stazione.
    Attenzione: Assicurarsi di utilizzare il coperchio per l'illuminatore e indossare occhiali protettivi prima di attivare la sorgente di luce.
    Nota: Questo passaggio può essere completato anche utilizzando qualsiasi sorgente di luce UV o uno scanner standard del gel.
  2. Visualizza le immagini di ImageJ trascinando il file per la barra di stato di ImageJ e l'immagine si aprirà.
  3. Determinare il tasso di digestione per l'esperimento confrontando le bande sul gel per il modello di gel previsto in silico . Per determinare il tasso di digestione, il numero di band sperimentali è diviso per il numero atteso di DNA bande24,25. Se il modello di band DNA digerito sperimentale ha il modello previsto, il tasso di digestione è 1. Se il modello ha frammenti di più del previsto, il tasso di digestione è maggiore di 1. Se il modello ha meno frammenti del previsto, il tasso di digestione è minore di uno.

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Risultati

Al fine di determinare che se un colorante intercalante interesserà un enzima di restrizione digestione del DNA, l'ordine corretto delle operazioni deve essere seguita (Figura 1). Una volta che il DNA è macchiato e si digerisce con un enzima specifico, può essere scattata una foto del gel per determinare il numero di frammenti e la loro dimensione (Figura 2). Al fine di determinare l'efficienza di enzima, il numero totale di b...

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Discussione

Per digerire fluorescente contrassegnati del DNA (Figura 1), una serie di passaggi sono necessari. In primo luogo, il DNA è macchiato con un fluorocromo durante la notte. DNA può essere incubato con dimeri cianina per un breve periodo di tempo; Tuttavia, Carlsson et al trovato che DNA creato bands doppie per ogni dimensione del DNA a causa di colorazione incompleta20. Per risolvere questo problema, il DNA può essere macchiato durante la no...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata finanziata dall'Istituto nazionale per generale Medical Science (NIGMS) (5605100122001), un componente del National Institutes of Health (NIH), così come Università del Nebraska a Kearney (UNK) estate studente ricerca programma (SSRP) e UNK Borsa di ricerca dello studente non laureato (URF).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Unmethylated lambda DNANEBN3013S
YOYO-1ThermoFisher ScientificY3601
TOTO-1ThermoFisher ScientificT3600
POPO-1ThermoFisher ScientificP3580
BOBO-1ThermoFisher ScientificB3582
YOYO-3ThermoFisher ScientificY3606
TOTO-3ThermoFisher ScientificT3604
POPO-3ThermoFisher ScientificP3584
BamHINEBR0136S
PmlINEBR0532S
ScaINEBR3122S
EcoRI NEBR0101S
HindIIINEBR0104S
SmaINEBR0141S
TrisFisherBP152-1Irritant
EDTAFisherS316-212Toxic
HClFisherS25358Corrosive and irritant
Buffer 1NEBB7201SNEB 1.1
Buffer 2NEBB7202SNEB 2.1
Buffer 3NEBB7204SNEB Cutsmart
High gelling temperature agarose gelLonza50041
Acetic AcidFisherS25118Hazardous
Blue light transilluminatorDark ReaderDR196Wear correct eyewear 
Ethidium bromideFisher15585011Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.
Cannon EOS Rebel T3I cameraCannon
Apogee Model H4Biorad1704510
Power Pac Basic Power SupplyBiorad1645050 
FicollFisher ScientificBP525-25
Bromophenol blueFisher ScientificB-392
Xylene CyanolEastmenT1579

Riferimenti

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