Un argento che macchia protocollo attivazione semplice e veloce ed efficiente rilevamento di marcatori SSR utilizzando un Non-denaturante del Gel di poliacrilammide

Riepilogo

Qui, segnaliamo un argento semplice e a basso costo che macchia protocollo che richiede solo tre reagenti e 7 min di trattamento ed è adatto per la generazione veloce di dati di alta qualità SSR nell'analisi genetica.

Abstract

Semplice sequenza ripetere (SSR) è uno degli indicatori più efficaci utilizzati in programmi di allevamento molecolare e ricerca genetica vegetale e animale. Macchiatura d'argento è un metodo ampiamente usato per l'individuazione di marcatori SSR in un gel di poliacrilammide. Tuttavia, protocolli convenzionali per la macchiatura d'argento sono tecnicamente impegnativo e richiede tempo. Come molti altri laboratorio biologico tecniche, argento che macchia i protocolli sono stati costantemente ottimizzati per migliorare l'efficienza di rivelazione. Qui, segnaliamo un semplificato argento che macchia il metodo che significativamente riduce i costi di reagente e migliora la chiarezza di rilevamento ad alta risoluzione e foto. Il nuovo metodo richiede due passaggi principali (impregnazione e sviluppo) e tre reagenti (nitrato d'argento, idrossido di sodio e formaldeide) e solo 7 min di elaborazione per un non-denaturante del gel di poliacrilammide. Rispetto ai protocolli precedentemente segnalati, questo nuovo metodo è più facile, più veloce e utilizza meno reagenti chimici per il rilevamento di SSR. Pertanto, questo argento semplice, basso costo ed efficace protocollo di colorazione trarranno beneficio mappatura genetica e riproduzione assistita da una rapida generazione di dati marcatore SSR.

Introduzione

Lo sviluppo di marcatori basati sulla PCR ha rivoluzionato la scienza della genetica vegetale e allevamento¹. Indicatori di sequenza semplice ripetizione (SSR) sono tra i marcatori di DNA più versatili e più comunemente utilizzati. Loro genoma ampia copertura, abbondanza, specificità del genoma e ripetibilità sono solo alcuni dei meriti di marcatori SSR oltre alla loro eredità codominante per l'individuazione di genotipi eterozigoti². Parecchi studi hanno utilizzato i marcatori SSR per indagare la diversità genetica, tenere traccia di ascendenza, costruire mappe di collegamento genetico e mappare geni per tratti economicamente importanti^3,4.

I prodotti di PCR di marcatori SSR comunemente sono separati mediante elettroforesi dell'agarosi o gel di poliacrilammide e poi visualizzati con la macchiatura d'argento o sotto luce UV dopo colorazione con bromuro di etidio. Macchiatura d'argento di frammenti di DNA in gel di poliacrilammide è più sensibile rispetto al altri colorazione metodi^5,6 ed è stato ampiamente utilizzata per rilevare i frammenti di DNA ad esempio SSR marcatori⁷.

Come molte tecniche di laboratorio biologico, macchiatura d'argento del gel di poliacrilammide è costantemente migliorato dal suo primo segnalato come una tecnica di visualizzazione frammento nel 1979⁸. La tecnica è stata inizialmente modificata per il rilevamento dei frammenti del DNA da Bassam et al. ⁶ nel 1991 e poi migliorato da Sanguinetti e colleghe⁹ nel 1994. Il metodo è stato ulteriormente ottimizzato nelle ultime pochi decenni^{6,7,9,10,11,12,13,14 , 15}. Tuttavia, la maggior parte di queste versioni aggiornate dei protocolli hanno ancora alcuni svantaggi, come alta richiesta tecnica e lungo tempo per la fissazione di elaborazione e montaggio⁶, che limitano l'applicazione di questi protocolli^{7, 11}. Un protocollo ottimale che combina basso costo ad alta efficienza di rilevazione del frammento del DNA è urgente per applicazioni di routine d'argento che macchia nella ricerca biologica.

Inoltre, gel di poliacrilammide può essere diviso in gel di poliacrilammide denaturante e non-denaturante, ed entrambi possono essere utilizzati per l'individuazione di marcatori SSR usando l'argento che macchia il metodo. L'effetto e la risoluzione delle quali non differiscono significativamente, ma non-denaturante del gel di poliacrilammide sono più facile da processo e prendere meno tempo¹⁶.

Sulla base della precedente ricerca¹⁵, lo scopo di questo studio è di descrivere un argento ottimizzato protocollo dettagliatamente per rilevazione veloce, facile e basso costo di SSR markers in un non-denaturante del gel di poliacrilammide di colorazione.

Protocollo

1. preparazione dei prodotti PCR di marcatori SSR

1. Preparare tutti i prodotti chimici e reagenti per reazioni di PCR, compreso il modello DNA (30 ng / µ l), 2 × mix PCR master (contenente 2 × PCR tampone, 0,4 mM di ogni dNTP, 3mm di MgCl₂, 0,1 U / µ l di Taq DNA polimerasi e coloranti), 10 µM di ciascuno avanti e indietro gli iniettori e acqua distillata o deionizzata (dH₂O).
   Nota: I marcatori SSR utilizzati nel presente studio sono stati PT51333 (trasmettere la sequenza primer: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' e sequenza inversa primer: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') e PT50903 (trasmettere la sequenza primer: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' e invertire la sequenza primer: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') per il tabacco e CX-43 (trasmettere la sequenza primer: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' e reverse primer sequenza: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') e CX-157 (trasmettere la sequenza primer: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' e invertire la sequenza primer: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') per fioritura cavolo cinese.
2. Preparare 10 µ l di miscela di PCR per l'amplificazione aggiungendo 2 µ l di DNA campione, 5 µ l di 2 × PCR master mix, 0,2 µ l di ogni primer forward e reverse primer e 2,6 µ l di dH₂O.
3. Eseguire la reazione di amplificazione di PCR in un termociclatore con un passo iniziale di 94 ° C per 5 min, seguite da 38 cicli di 45 s a 94 ° C per denaturazione, 45 s a 55 ° C per la ricottura di primer e 1 min a 72 ° C per estensione e un passo di estensione finale di 10 min a 72 ° C; quindi memorizzare i prodotti di PCR a 4 ° C per un uso successivo.

2. preparazione di soluzioni per poliacrilammide gel Casting

1. Preparare 1 L di buffer TBE 5 × 54 g di Tris base e 27,5 g di acido borico in dH₂O di dissoluzione, aggiungendo 20 mL di EDTA 0.5 M (pH 8.0) e regolando la soluzione ad un volume finale di 1, 000 mL con dH₂O.
   Nota: Tampone TBE può essere conservato a temperatura ambiente per mesi.
2. Preparare 2 L di buffer di TBE 0,5 × aggiungendo 200 mL di buffer TBE × 5 dH₂O ad un volume finale di 2 L e conservare a temperatura ambiente.
3. Preparare una soluzione al 6% non-denaturante del gel di poliacrilammide sciogliendo 29 g di biologia molecolare grado acrilamide e 1 g di biologia molecolare grado N, N'-methylenebisacrylamide nel buffer TBE × 0,5 ad un volume finale di 500 mL. Coprire il flacone della soluzione con foglio di alluminio e conservare a 4 ° C per un uso successivo.
   Attenzione: Acrilamide è considerato una potente neurotossina e deve essere maneggiato con cura. Indossare sempre i guanti quando pesatura polveri e soluzioni per la movimentazione che lo contengono.
4. Preparare una soluzione di 20% ammonio persolfato (APS) sciogliendo 2 g di APS con dH₂O ad un volume finale di 10 mL. Esso può essere conservato a-20 ° C per mesi.
   Nota: Per comodità, 10 mL di soluzione al 20% APS può essere aliquotati in 1,5 mL o 2 mL di provette da centrifuga per conservazione a-20 ° C. Scongelare e mescolare bene prima dell'uso.
5. Preparare una soluzione diluita di bind-Silano sciogliendo 3 µ l di binding-Silano in 0,997 mL di etanolo al 95% contenente 0.5% di acido acetico. Esso può essere conservato a 4 ° C per settimane.
   Attenzione: Bind-Silano è tossico, indossare guanti per maneggiare la soluzione e mantenere la camera ventilata.

3. preparazione di gel di poliacrilammide per elettroforesi

1. Lavare una serie di lastre di vetro e distanziali con detergente in acqua di rubinetto, seguito da un risciacquo completo con dH₂O. aria a secco le piastre impostandoli in una piastra stendino.
2. Disperdere 1 mL di soluzione di bind-silano sulla superficie interna di una lastra di vetro rettangolare e secco per 5 min.
   Nota: Se la soluzione di bind-silano non si diffonde uniformemente sulla superficie della piastra, il gel può essere staccata durante la colorazione e provocare un effetto di colorazione insoddisfacente.
3. 1 mL di respingere-silano sulla superficie interna di una lastra di vetro dentellata con un tampone di disperdere, pulire respingere-Silano in eccesso con una velina e aria secca per 5 min.
   Nota: Se il repellere-silano non uniformemente rivestire la superficie della lastra di vetro, ciò potrebbe danneggiare il gel spelando parzialmente.
4. Montare le lastre di vetro con distanziali con la piastra dentata sulla parte superiore ed entrambi i lati dell'Assemblea con casting morsetti di serraggio.
5. Versare la quantità appropriata (40 mL) di soluzione non-denaturante gel di poliacrilammide al 6% in un bicchiere per il set di piatto di larghezza di 33 cm × 10 cm di altezza e distanziale spessore 1,5 mm, aggiungere 20 µ l di tetrametiletilendiammina (TEMED) e 200 µLfresh 20% APS e mescolare delicatamente.
   Nota: La quantità appropriata (40 mL) di soluzione di gel è stata calcolata dal volume interno delle due piastre con uno spessore di distanziali (30 cm × 8,5 cm × 0.15 cm). Per quanto riguarda la quantità di TEMED e APS per la polimerizzazione del gel, c'è in un formato standard della soluzione di gel di TEMED e APS basato sul riferimento¹⁷. La soluzione di gel sopra descritta è conservata a 4° C. Se la soluzione di gel è conservato a temperatura ambiente, 20 µ l di TEMED e 100 µ l del 20% APS deve essere utilizzato. Mescolare delicatamente la miscela di soluzione di gel con un bastoncino di vetro per evitare bolle d'aria nella soluzione.
6. Versare la soluzione immediatamente e accuratamente nelle lastre di vetro assemblate lungo il bordo della piastra dentellata, riempire lo spazio quasi al top e inserire il pettine. Aggiungere un piccolo volume di soluzione di gel sopra il pettine.
   Nota: Tenere le piastre di vetro orizzontale per impedire la fuoriuscita del gel. Rimuovere tutte le bolle con un gancio di bolla, se necessario.
7. Lasciare che il gel da impostare per 30 min a temperatura ambiente.
   Nota: Il tempo di polimerizzazione cambiano le temperature della soluzione di gel e ambiente.
8. Dopo il gel è completamente polimerizzazione, rimuovere i morsetti di colata e posizionare la piastra impostata nella centralina di carro armato di elettroforesi con il piatto dentellato rivolto verso il serbatoio tampone superiore e usate grande fascette per fissare la piastra con impostazione in serbatoio.
9. Versare 1 L di 0,5 × TBE buffer in ciascuna della tomaia e le camere inferiori. Togliere il pettine e lavare abbondantemente tutti i pozzetti con buffer utilizzando una pipetta o siringa.
   Nota: Assicurarsi che il sandwich di gel nella parte inferiore della piastra è completamente imbevuto nel buffer senza eventuali bolle.

4. running gel

1. Caricare circa 1 µ l di prodotto di PCR in ogni pozzetto del gel di poliacrilammide. Caricare una scaletta di formato di DNA ad entrambi i lati del gel insieme con i campioni dei prodotti di PCR. Fissare il coperchio di sicurezza per l'alloggiamento superiore del buffer.
2. Collegare i cavi dell'alimentazione, di corrispondenza il codice colore rosso con rosso e nero al nero. Esegua il gel a una tensione costante di 110 V, fino a quando il colorante raggiunge una posizione definita, normalmente per ~ 70 min.
   Nota: Il tempo di tensione e corrente può essere regolato in base alle dimensioni dei prodotti di PCR.

5. colorazione per la rilevazione di marcatori SSR in un Non-poliacrilammide Gel argento

1. Dopo l'elettroforesi, svuotare il buffer dalla camera superiore in un grande bicchiere tramite la valvola. Staccare i morsetti laterali, rimuovere le piastre dall'apparecchio, attentamente separare la lastra di vetro dentellata lungo un lato con una spatola e assicurarsi che i gel rimane attaccato a altra piastra di vetro rivestito con bind silano.
2. 1 L di soluzione di impregnazione fresco sciogliendo 1,5 g di AgNO₃ in 1 L di dH₂O. preparare 1 L di soluzione di sviluppo fresco sciogliendo 10 g di NaOH in 900 mL di dH₂O, aggiungere 1 mL di formaldeide al 37% e regolare ad un volume finale di 1 L utilizzo dH₂O.
   Nota: Indossare guanti e gestire i prodotti chimici e le soluzioni con cura sopra. Non è necessario mantenere le soluzioni e i passaggi corrispondenti con le soluzioni al buio.
3. Risciacquare accuratamente la piastra gel e vetro con ampio dH₂O per rimuovere il tampone di elettroforesi, quindi posizionare la piastra con il gel rivolto verso l'alto su un vassoio di plastica e immergere il gel in 1 L di soluzione di impregnazione. Reinserire il vassoio su un agitatore.
4. Agitare delicatamente il vassoio a 60 giri/min per 3-4 min.
   Nota: Tempo di agitazione può essere regolata secondo lo spessore del gel e la concentrazione di nitrato di argento nella soluzione di impregnazione.
5. Spostare la piastra dalla soluzione di impregnazione e metterlo su un altro vassoio. Risciacquare la soluzione residua impregnazione fuori dalla superficie della piastra e il gel utilizzando un ampio dH₂O due volte per 3-5 s ciascuno.
6. Posizionare la piastra con il gel rivolto verso l'alto su un altro vassoio, immergere la piastra in 1 L di soluzione di sviluppo, quindi agitare delicatamente il vassoio a 50 giri/min per un minimo di ~ 3 Monitor l'aspetto del DNA frammenti e fermare lo sviluppo quando il più alto rapporto del segnale del DNA frammenti al rumore di fondo è osservato (questo passaggio prende ~ 3 min).
7. Sciacquare la piastra e il gel con un ampio dH₂O due volte e asciugare la lastra di gel con una velina.
8. Scansione il gel utilizzando uno scanner appropriato. Una risoluzione di 300 dpi dà una chiara visualizzazione dei frammenti del DNA. Il gel può essere fotografato anche utilizzando una macchina fotografica.
9. Il disegno a strisce di marcatori SSR possa essere segnato basato su frammenti di DNA nell'immagine.

Risultati

Gli ampliconi PCR sono state prodotte utilizzando le corrispondenti coppie di primer SSR in fioritura cavolo cinese e tabacco. Dopo l'elettroforesi, il gel di poliacrilammide erano macchiate usando l'argento di cui sopra che macchia protocollo, che senza ambiguità rilevate i disegni a strisce di marcatori SSR (Figura 1).

Per confrontare l'efficienza di rivelazione d'argento diverso protocolli di co...

Discussione

Il lavaggio del gel dopo l'impregnazione è un passaggio fondamentale. Volume di tempo e acqua di lavaggio insufficiente può causare la rimozione incompleta di impregnazione soluzione sulla superficie della piastra e il gel e causare uno sfondo scuro. Il tempo di sviluppo appropriato è un altro passaggio chiave, eccesso di sviluppo può risultare in una priorità bassa scura con immagine a basso contrasto dei frammenti del DNA. Inoltre, il passaggio di impregnazione influenza in modo significativo l'efficienza colorazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR master mix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 DNA marker	Takara Bio Inc., Japan	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Boric acid	Sangon Biotech Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#6381-92-6
Acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Ammonium persulfate	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7727-54-0
Bind-silane	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#7761-88-8
Formaldehyde	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#50-00-0
NaOH	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#1310-73-2
Acetic acid	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-17-5
HNO3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#1787-61-7
Plastic tray	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China	-
TS-1 Shaker	Qilinbeter JiangSu, China	-
BenQ M800 Scanner	BenQ, China	-
DYY-6C Power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	-
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China	-