Fabbricazione di lingua della matrice extracellulare e la ricostituzione di Carcinoma di cellule Squamous Tongue In Vitro

Riepilogo

Qui viene mostrato un metodo per la preparazione della matrice extracellulare (TEM) di lingua con decellularizzazione efficiente. Il TEM utilizzabile come funzionale scaffold per la ricostruzione di un modello di carcinoma di cellule squamous (TSCC) lingua in condizioni di coltura statica o agitata.

Abstract

Al fine di costruire un modello efficace e realistico per lingua cellule squamose carcinoma (TSCC) in vitro, i metodi sono stati creati per produrre decellularized lingua extracellulare (TEM) che fornisce funzionale ponteggi per edilizia TSCC. TEM fornisce una nicchia in vitro per la crescita cellulare, differenziazione e migrazione cellulare. Le microstrutture del nativo della matrice extracellulare (ECM) e biochimici composizioni conservate nella matrice decellularizzata forniscono tessuto-specifiche nicchie per l'ancoraggio di cellule. La fabbricazione di TEM può essere realizzata tramite digestione deossiribonucleasi (DNase) accompagnata con una seria di pretrattamento organico o inorganico. Questo protocollo è facile da usare ed assicura l'alta efficienza per il decellularizzati. Il TEM ha mostrato citocompatibilità favorevole per le celle TSCC in condizioni di coltura statica o agitata, che permette la costruzione del modello TSCC. Un bioreattore self-made è stato utilizzato anche per la persistente condizione agitata per la coltura cellulare. TSCC ricostruito utilizzando TEM ha mostrato le caratteristiche e le proprietà che assomiglia l'istopatologia clinica di TSCC, suggerente il potenziale della ricerca TSCC.

Introduzione

La lingua ha varie funzioni importanti, come la deglutizione, articolazione e degustazione. Quindi, il danno della funzione di lingua ha grande impatto il patients' qualità di vita¹. La malignità più comune nella cavità orale è carcinoma di cellule squamous lingua (TSCC), che di solito si verifica nelle persone che bere alcolici o fumano tabacco².

Negli ultimi anni, scarsi progressi compiuti nella ricerca fondamentale sulla TSCC. La mancanza di efficienti in vitro ricerca modelli resti per essere uno dei maggiori problemi. Così, la matrice extracellulare (ECM) scopre di essere una potenziale soluzione. Poiché l'ECM è un frame di rete complessa composto da componenti della matrice altamente organizzata, impalcatura materiali aventi un ECM-come la struttura e la composizione sarebbe competente per la ricerca sul cancro. ECM decellularizzati perfettamente è in grado di fornire la nicchia per le cellule dallo stesso origine in vitro, che risulta per essere il vantaggio più significativo di ECM.

ECM può essere mantenuto con componenti cellulari per essere rimosso dal tessuti attraverso il decellularizzazione utilizzando detergenti ed enzimi. Vari componenti della MEC, tra cui collagene, fibronectina e laminina nella matrice decellularizzati forniscono un microambiente nativo-tessuto-come per le cellule coltivate, promuovendo la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione delle cellule³. Inoltre, l'immunogenicità per trapianto può essere ridotto a un livello minimo con l'assenza di componenti cellulari in ECM.

Finora, sono stati provati metodi di fabbricazione per decellularizzati ECM in diversi tessuti e organi, quali cuore^4,5,6,7, fegato^{8,9,10 ,11}, polmone^{12,13,14,15,16,17}e rene^{18,19 , 20}. Tuttavia, nessuna ricerca pertinente ha si trova su un lavoro simile nella linguetta al meglio della nostra conoscenza.

In questo studio, matrice extracellulare decellularizzati lingua (TEM) è stata fabbricata sia in modo efficiente ed economicamente da una serie di trattamento fisico, chimico ed enzimatico. Quindi il TEM è stato utilizzato per ricapitolare TSCC in vitro, mostrando una simulazione appropriata per TSCC comportamento e sviluppo. TEM ha buona biocompatibilità, nonché la capacità di guidare le cellule alla nicchia di tessuto-specifica, che indica che la TEM può avere grande potenziale in TSCC ricerca³. Il protocollo illustrato di seguito fornisce una scelta per i ricercatori che studiano su patogenesi o clinica delle terapie di TSCC.

Protocollo

Tutto il lavoro animale era eseguito in conformità con legge di benessere degli animali, le linee guida istituzionali e approvato dal comitato di uso, Sun Yat-sen University e istituzionali Animal Care.

1. preparazione del TEM

1. Eseguire topi di dislocazione cervicale e rimuovere le lingue utilizzando pinzette e forbici chirurgiche sterili.
2. Immergere le linguette in etanolo di 75% per 3 minuti, poi mettere ogni lingua in un 1,5 mL tubo Eppendorf (EP) con 1 mL di 10 millimetri di fosfato sterile tamponata (PBS).
   Nota: La concentrazione di PBS in tutti i passaggi seguenti è lo stessa come la concentrazione in questo passaggio.
3. Lisi della cellula da disgelo: congelare le linguette in tubi EP a-80 ° C per 1 h e poi scongelare le lingue a temperatura ambiente per 45 min per 3 cicli.
4. Caricare ogni lingua su un pezzo di sutura chirurgica utilizzando un ago chirurgico e avvolgere l'estremità della sutura con un piccolo pezzo di carta stagnola sterile. Eseguire l'operazione in una piastra di coltura 3,5 cm o 6 cm contenente etanolo di 75% in condizioni sterili.
   Nota: La lunghezza appropriata di ogni pezzo di sutura chirurgica è di circa 20 cm, e la dimensione appropriata di ogni pezzo di carta stagnola è circa 0,3 cm² (1 cm × 0,3 cm). La lingua deve essere caricata vicino la carta stagnola.
5. Sciacquare ogni linguetta con 3 mL di PBS sterile in una piastra di coltura 3,5 cm o 6 cm per 30 s. eseguire questa operazione in condizioni sterili.
6. Lavare le linguette con acqua ultrapura: aggiungere ampicilin in una bottiglia di bocca larga con 250 mL di acqua distillata sterile ad una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Mettere le lingue al flacone contenente una barra per l'agitazione. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
   Nota: Fino a 5 lingue possono essere messo nella stessa bottiglia in considerazione twining della sutura. La carta stagnola è all'estremità della sutura in bottiglia per evitare che la lingua scivoli fuori. Le lingue devono trovarsi 2 cm di altezza dal fondo della bottiglia, regolando la lunghezza della sutura rimanendo all'interno della bottiglia. Questa nota è anche per la procedura 1.8, 1.10, 1.12 e 1.16.
7. Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 12 h.
8. Lavare le linguette con NaCl: aggiungere ampicilin in una bottiglia di bocca larga con 250 mL di sterile 1 M di NaCl a una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
9. Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 24 h.
10. Lisi di Triton X-100 di cella: aggiungere ampicilin a una concentrazione finale di 90 µ g/mL in una bottiglia a bocca larga con 250 mL di sterile 2% Triton X-100 in PBS. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
11. Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 48 h.
12. Lavare le linguette con CaCl₂/MgCl₂: Aggiungi ampicilin in una bottiglia di bocca larga con 250 mL di sterile 5 mM CaCl₂/MgCl₂ a una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
13. Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 24 h.
14. Digestione di dnasi: aggiungere 1 mL di Hank equilibrata soluzione salina (HBSS) a ciascuna provetta di EP. Aggiungere la dnasi in HBSS rispettivamente a una concentrazione finale di 300 µM. muovere ogni lingua in ogni provetta di EP, con parte della sutura all'esterno del tubo. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
    Nota: Assicurarsi che la parte della sutura che rimane all'interno delle bottiglie nei passaggi precedenti rimane anche all'interno del tubo di EP in questo passaggio e assicurarsi che la parte della sutura che rimane di fuori delle bottiglie nei passaggi precedenti rimane anche all'esterno del tubo di EP in questo passaggio.
15. Incubare le linguette in tubi EP a 37 ° C per 24 h.
16. Lavare le linguette con PBS: aggiungere ampicilin in una bottiglia a bocca larga con 250 mL di PBS sterile ad una concentrazione finale di 90 µ g/mL. Spostare le lingue e l'ancoretta nella bottiglia. Stringere il tappo di bottiglia con parte della sutura rimanendo all'esterno della bottiglia. Eseguire questa operazione in condizioni sterili.
17. Mettere la bottiglia su un agitatore magnetico per 24 h.
18. Conservare il TEM preparato in PBS sterile a 4 ° C fino all'utilizzo.

2. tridimensionale (3D) ricostituzione di TSCC

1. Costruzione di modello statico TSCC
   1. Seme 1.0 x 10⁶ TSCC celluli (Cal27) in una piastra di coltura di 3,5 cm. Aggiungere 3 mL di Dulbecco modificato dell'Aquila medio/F12 (DF12) contenente 10% siero bovino fetale (FBS), ampicilin 90 µ g/mL e 90 kanamicina µ g/mL.
   2. Coltura le cellule Cal27 a 37 ° C per 2 o 3 giorni. Assicurarsi che le celle coprono almeno il 60% zona del fondo piatto.
   3. Caricare TEM sul strato monomolecolare del Cal27 nella piastra di coltura.
   4. Mettete la teglia in un incubatore a CO₂ a 37 ° C per 28 giorni.
   5. Aggiornare il terreno di coltura ogni giorno durante il processo di coltura delle cellule. La concentrazione di CO₂ nell'incubatrice è 5%.
2. Costruzione di modello TSCC agitata
   1. Preparazione di un self-made minibioreactor agitata
      1. Togliere lo stantuffo da una siringa da 10 mL.
      2. Scavare un foro (diametro di 1 cm) vicino il terminale inferiore dello stelo e caricare un ancoretta nel foro.
      3. Scavare un foro (diametro di 0,5 cm) al centro del tappo della bottiglia, una bottiglia di plastica in bocca larga e mettere l'asta del pistone attraverso il tappo.
      4. Tagliare metà di un tubo di centrifuga da 50 mL e saldarlo sul lato esterno del tappo della bottiglia.
      5. Collegare ami all'asta avvolgendo l'asta con linee di pesca che sono legati per l'ami.
         Nota: Fino a 4 ami possono essere collegati ad un bastone.
      6. Sterilizzare in autoclave il complesso self made prima dell'uso.
         Nota: Non sterilizzare in autoclave la bottiglia di plastica bocca larga. Utilizzare una nuova bottiglia di bocca larga di plastica sterile durante la coltura delle cellule.
3. Coltura cellulare dinamica
   1. Seme 1.0 x 10⁶ Cal27 unicellulari nella minibioreactor self-made. Aggiungere 150 mL di mezzo di DF12 che contiene 10% FBS, 90 µ g/mL ampicilin e kanamicina 90 µ g/mL.
   2. Caricare TEM sul minibioreactor utilizzando l'ami allegati all'asta.
   3. Stringere il tappo del flacone e mettere il minibioreactor su un agitatore magnetico. Attivare il minibioreactor a 200 rpm in un incubatore a CO₂ a 37 ° C per 7-14 giorni.
      Nota: La concentrazione di CO₂ nell'incubatore CO₂ è 5%.

Risultati

Questo protocollo per la preparazione di TEM risulta per essere efficiente e appropriato. Il TEM ha mostrato decellularizzazione perfetto rispetto ai tessuti di madrelingua. L'efficacia di decellularizzazione è stata confermata da ematossilina-eosina (HE) (Figura 1A-B). HE i risultati di macchiatura ha rivelato la scomparsa completa di macchiatura nucleare nel TEM (Figura 1B). Inoltre, contenuto...

Discussione

Un protocollo ben consolidato per la fabbricazione di ECM decellularizzati dovrebbe mantenere la composizione di ECM nativa durante la rimozione di componenti cellulari nei tessuti quasi completamente²¹. Nonostante i protocolli di decellularizzazione attualmente segnalati che richiedono perfusione attraverso il sistema vascolare per rimuovere materiali cellulari di trasporto convettivo, agitazione meccanica è stata adottata qui, conosciuto come un metodo semplice ed economico tradizionale

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57-BL/6J mice	Sun Yat-sen University Laboratory Animal Center
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory	HB15-GR-2.5L
Sodium chloride	Sangon Biotech	A501218
Potassium chloride	Sangon Biotech	A100395
Dibasic Sodium Phosphate	Guangzhou Chemical Reagent Factory	BE14-GR-500G
Potassium Phosphate Monobasic	Sangon Biotech	A501211
1.5 mL EP tube	Axygen	MCT-150-A
Ultra-low temperature freezer	Thermo Fisher Scientific
3.5 cm cell culture dish	Thermo Fisher Scientific	153066
6 cm cell culture dish	Greiner	628160
Triton X-100	Sigma-Aldrich	V900502
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	746495
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	449164
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Magnesium sulphate	Sangon Biotech	A601988
Glucose	Sigma-Aldrich	158968
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9393
Kanamycin	Sigma-Aldrich	PHR1487
Surgical suture	Shanghai Jinhuan
250 mL wide-mouth bottle	SHUNIU	1407
Magnetic stirrer	AS ONE	1-4602-32
CO2 incubator	SHEL LAB	SCO5A
10 mL syringe	Hunan Pingan
50 mL centrifuge tube	Greiner	227270
Cal27 cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Tongue squamous cell carcinoma cell line
U2OS cell	Chinese Academy of Science, Shanghai Cell Bank		Human osteosarcoma cell line
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D0547
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280
Hepes free acid	BBI	A600264
FBS	Hyclone	SH30084.03
4 °C fridge	Haier
Water purifier	ELGA
Hemocytometer	BLAU	717805