Microdissection di segmenti di tessuto renale primario e incorporazione con tecnologia romanzo costrutto senza impalcatura

Riepilogo

Tessutale renale costrutti forniscono una soluzione per la carenza di organi e deleteri effetti della dialisi. Qui, descriviamo un protocollo a micro sezionare murini reni per isolamento di segmenti cortico-midollare. Questi segmenti sono impiantati nei costrutti senza impalcatura cellulare, formando organoids renale.

Abstract

Trapianto di rene è ora una terapia tradizionale per la malattia renale di stadio finale. Tuttavia, con circa 96.000 persone sulla lista d'attesa e solo un quarto di questi pazienti che hanno raggiunto il trapianto, c'è un disperato bisogno di alternative per quelli con mancanza di organi. Al fine di ridurre le conseguenze dannose di dialisi nonché i costi nel complesso sanitari che sostiene, indagine attiva è in corso in cerca di soluzioni alternative al trapianto d'organo. Impiantabili tessutale renale costrutti cellulari sono un tale approccio fattibile per sostituire la perdita di funzionalità renale. Qui, descritto per la prima volta, è il microdissection dei reni murini per l'isolamento di vivere corticomedullary renale segmenti. Questi segmenti sono capaci di rapida incorporazione all'interno senza impalcatura endoteliale-fibroblasto costrutti che consentono rapidi collegamenti con vasculature host una volta impiantato. Reni di topo adulto sono stati prelevati da donatori viventi, seguiti da stereoscopio microdissection ottenere segmenti renale 200-300 µm di diametro. Più costrutti renale furono fabbricati usando segmenti renale primarie raccolte da un solo rene. Questo metodo viene illustrata una procedura che potrebbe salvare il tessuto funzionale renale da organi che altrimenti sarebbe da scartare.

Introduzione

Malattia renale cronica (CKD) è una delle attuali sfide importante di sanità pubblica in tutto il mondo¹. La prevalenza di CKD negli Stati Uniti è oltre il 14% della popolazione totale, con oltre 600.000 americani soffrono la forma più grave, stadio finale malattia renale (ESRD)². Le attuali opzioni di trattamento disponibili per quelli con ESRD includono dialisi e trapianto renale. Anche se circa 25.000 pazienti sottopongono a trapianto renale ogni anno, un numero significativo di pazienti vengono aggiunti ogni anno portando a una grande disparità tra quelli in attesa di un organo salva-vita e quelli riceventi trapianto³. Oltre ai suoi effetti negativi gravi sulla longevità e qualità della vita, la dialisi sono associato con un onere finanziario sorprendente. Nel 2014, Medicare pagato crediti ammontano a oltre $ 30 miliardi per ESRD pazienti². Con un rifornimento limitato dell'organo e nessuna tendenza al ribasso apparente in pazienti che necessitano di dialisi, gli sforzi di ricerca finalizzati ad individuare soluzioni alternative alla dialisi e trapianto sono sempre importanti. Anche un relativamente breve ritardo nella necessità di dialisi aumenta sostanzialmente numero di un paziente di anni di vita di qualità-regolato e produttività mentre rinviando alla dialisi costi^4,5,6.

Soluzioni per la perdita di tessuto funzionale, come quella in ESRD, sono attualmente allo studio in ingegneria tissutale e medicina rigenerativa laboratori, con approcci vari ampiamente da basati su impalcatura organoid fabbricazione a organo intero ingegneria utilizzando decellularized strutture dell'organo per l'impianto cellulare^7,8,9,10,11. Ricapitolare complesse strutture renali dai reni marginali o scartati solo parzialmente è stato studiato. Infatti, quasi il 20% dei reni procurati per trapianto vengono scartati per vari motivi^12,13. Il tessuto renale funzionale da questi presunti innesti potrebbe essere utilizzato e incorporato in uno o molti costrutti tessutale. Studi precedenti hanno dimostrato la fattibilità di lavorare con questi organi scartati, che utilizzano i reni per la matrice extra-cellulare per tessuto ingegneria fini^14,15. Tuttavia, pochi hanno utilizzato il tessuto primario nephronal da reni sani per l'ingegneria dei tessuti fini^16,17,18.

Un metodo precedentemente descritto da Kim et al. prevede isolamento di renale "segmenti" da reni sani del ratto, che poi sono stati seminati su impalcature di (PGA) acide poliglicolico per costrutto fabbricazione¹⁶. Tuttavia, poche informazioni sono dato per quanto riguarda la metodologia esatta dissezione e segmenti sono stati ottenuti da una combinazione di filtrazione e tritare bene. Descriviamo una modifica del presente protocollo, che analogamente produce segmenti discreti renale con architettura nephronal intatto, ma si basa invece sulle tecniche di microdissezione. Nefrectomie vengono eseguiti su topi adulti viventi, dopo di che i reni sono trasferiti il microscopio di dissezione dove la capsula renale è rimosso, e il tessuto è ulteriormente sezionato. Piccolo calibro 30½ G aghi sono usati come strumenti da taglio e anche come guide aiutando nella dissezione, come l'ago diametro è uguale al diametro del bersaglio dei segmenti renali. I segmenti isolati, in questo caso murini, renali mantengono vitalità nella cultura e incorporano con costrutti cellulari senza impalcatura endoteliale-fibroblasto¹⁹. Questi costrutti sono stati utilizzati precedentemente per altri organi, tra cui un pancreas artificiale bio²⁰l'ingegnere.

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Protocollo

Tutte le procedure chirurgiche degli animali descritte di seguito sono state approvate dal istituzionale Animal Care e utilizzare Committee (IACUC) presso Medical University of South Carolina, prima di qualsiasi animali ambulatori o uso di qualsiasi tessuti animali.

1. murino nefrectomia

1. Indossi una maschera chirurgica e protezione bouffant per ridurre al minimo il rischio di contaminazione. Mantenere la sterilità durante il set-up dell'area chirurgica.
   1. Posto non fenestrate telini chirurgici sul tavolo operatorio.
   2. Aprire il pacchetto di strumenti sterilizzati nell'autoclave su teli sterili. Gli strumenti necessari per il nephrectomy sono 3 piccoli emostatiche, belle forcipe con i denti, una pinzetta senza denti e forbici iris dritto.
   3. Posizionare un altro telo chirurgico non fenestrate al centro del tavolo operatorio.
   4. Preparare 5 mL di Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) con calcio e magnesio, completati con 1% di penicillina/streptomicina in una provetta conica sterile 15 mL. Posto questa soluzione sul ghiaccio accanto al tavolo operatorio.
2. Ottenere un mouse C57BL/6 di 8-12 settimane vecchio (maschio o femmina) dal complesso di stabulazione degli animali.
3. Posizionare il mouse all'interno di una camera di induzione di anestesia e indurre con 3,5% inalato isoflurano. Posizionare un cono di naso del mouse, utilizzando 2% isoflurane per anestesia di manutenzione.
   1. Monitor per un'adeguata profondità di anestesia periodicamente durante la procedura chirurgica valutando per pedale reflex (pizzico di punta costante).
4. Rimuovere tutti i capelli dal torso ventrale utilizzando la crema depilatoria. Sciacquare la zona con acqua distillata per garantire che tutti i capelli sono stato rimosso dall'addome.
5. Trasferire il mouse al tavolo operatorio sterile in posizione supina sotto il telo non fenestrate superiore. Tagliare una finestratura² 2 x 2 cm nel drappo solo che ricopre l'addome del mouse.
6. Applicare povidone-iodio seguito da etanolo al 70% all'addome usando le sfere di cotone o garza sterile.
7. Utilizzando una pinzetta con denti e iris forbici, fare un'incisione della pelle addominale verticale di 3-4 cm parallela alla linea mediana, 0,5 cm a sinistra della linea mediana
   Nota: Se il tentativo di rimuovere il rene di destra, questo sarà un'incisione 0,5 cm a destra della linea mediana.
   1. Afferrare il peritoneo con una pinzetta senza denti e incise con forbici iris di entrare nella cavità addominale. Applicare emostatiche ai bordi laterali superiori ed inferiori della pelle e del peritoneo per posizionare lateralmente tensione e migliorare l'esposizione.
   2. Spostare delicatamente il contenuto intestinale verso il lato destro dell'addome per esporre il rene di sinistra. Posizionare delicatamente la trazione sul rene per elevarlo fuori l'addome.
   3. Posizionare una pinza emostatica attraverso l'ILO del rene di sinistra. Utilizzare forbici iris al transetto l'uretere e i vasi renali.
   4. Posizionare il rene di sinistra nel 1% soluzione DPBS penicillina/streptomicina sul ghiaccio.
   5. Trasferimento nella provetta contenente il rene per la cappa di sterili per coltura. Trasferire il rene dalla provetta conica 15 mL per una capsula di Petri 60mm (Figura 1). Sciacquare due volte con 5 mL DPBS con calcio e magnesio. Mantenere il rene sospeso in 5 mL di DPBS nel piatto 60 mm.
      1. Preparare un piatto di petri di ulteriori 60 mm con 5 mL DPBS da usarsi durante il protocollo di microdissection.
   6. Eutanasia il mouse dal thoracotomy e dissanguamento dopo l'acquisizione del rene, secondo un protocollo approvato di animali IACUC.

2. murino rene Microdissection per l'isolamento del segmento renale

1. Continuare ad usare una tecnica sterile per questa parte del protocollo, inclusi i guanti sterili, mascherina chirurgica e bouffant per minimizzare il rischio di contaminazione.
   1. Luogo sterile tende sulla piattaforma microscopio stereo anche per quanto riguarda le aree appena a sinistra e destra del microscopio per avere un campo sterile per strumenti. Inserire fogli di plastica adesive sulle manopole di messa a fuoco del microscopio e spruzzare con etanolo al 70%. Accendere l'Illuminatore doppio collo d'oca per illuminare il palco.
   2. Apri strumenti sterilizzati (forcipe fine senza denti, manico per bisturi, lama per bisturi #15, due emostatiche dritti, due 30½ hollow-foro aghi di calibro) su teli sterili. Posto la #15 lama sul bisturi ora di gestire e collegare una pinza emostatica per ogni adattatore/mozzo dell'ago per creare strumenti per la dissezione dell'ago per un uso successivo, come mostrato nella Figura 1.
2. Spostare i piatti petri-60mm, uno contenente il rene in DPBS e l'altri DPBS unica, dalla coltura del tessuto cappa alla zona di microscopio.
   1. Porre la capsula di petri 60 mm sotto l'obiettivo e rimuovere il coperchio per esporre il rene. Lasciare il piatto contenenti DPBS al lato sul campo sterile per un uso successivo.
   2. Spostare il piatto in modo che solo la superficie anteriore o posteriore del rene è in vista (vale a dire, la faccia piatta grande del rene, con l'altra faccia toccare il fondo del piatto). Zoom a 3.2-4x per questa parte della procedura. Usando la mano non dominante, utilizzare una pinzetta senza denti per perforare e pin il rene contro il piatto vicino ai poli inferiori e superiori del rene.
   3. Mantenere la mano non dominante sul posto per appuntare il rene. Con la mano dominante, è necessario utilizzare la lama #15 per rimuovere lo strato capsulare fibroso traslucido da superficie esposta. Radere la più superficiale 0.5 mm dalla superficie esposta del rene per rimuovere il resto della capsula.
   4. Usare la lama #15 di sezionare una piramide rovesciata del tessuto dall'area decapsulato, circa 2 mm³ dimensioni. Recuperare la capsula 60 mm solo DPBS e porre la piramide del tessuto nel piatto pulito. Scartare il resto del rene.
   5. Diminuire l'ingrandimento di 1.5-2.0 X per il resto della dissezione. Utilizzando due strumenti emostato-ago come strumenti da taglio, affettare il frammento di tessuto in pezzi progressivamente più piccoli fino a quando i segmenti di tessuto sono minore o uguale al diametro delle punte dell'ago. Una di 2 mm di tessuto renale³ dimensioni produrrà più di 50 segmenti una volta completamente sezionati.
   6. Spostare il piatto di 60 mm con segmenti renale alla cappa di coltura del tessuto. Rimuovere DPBS con 1000 µ l pipette. Aggiungere 5 mL DMEM, completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina.
   7. Cultura per 3 giorni a 37 ° C in un incubatore o impianto in costrutti cellulari immediatamente.

3. renale segmento cellulare costrutto Fabrication

1. Fibroblasti cutanei umani normali cultura (NHDF) e cellule endoteliali microvascolari adipose umane (HAMEC) per diverse settimane ottenere 7,2 x 10⁵ fibroblasti e 1,8 x 10⁵ cellule endoteliali per costrutto desiderato. Nella cappa di coltura tissutale, seme il rapporto appropriato dei fibroblasti alle cellule endoteliali (4:1) in pozzetti, asta-a forma di in stampi di agarosio per formare senza impalcatura pre-vascolare endoteliale-fibroblasto costrutti (SPEC) come precedentemente descritti da Czajka et al. ¹⁹.
2. Ottenere un emostato sterilizzato, ago 30½ G e una spatola sterile con estremità piatta.
   1. Rimuovere la maggior parte dei media dalla piastra 60 mm contenenti segmenti renale, facendo attenzione a non aspirare e rimuovere i segmenti renali.
   2. Dotare le lenti di ingrandimento chirurgiche per visualizzare l'impianto dei segmenti.
   3. Raschiare la fine della spatola delicatamente lungo la parte inferiore del piatto 60 mm per ottenere 10-15 segmenti, stendere in modo uniforme lungo la punta della spatola. Posizionare la punta della spatola più vicino possibile al labbro del pozzo dove è stato seminato la SPEC.
   4. Usare uno strumento di ago di pinza emostatica-30½ G in altra mano per spostare ogni singolo segmento dalla punta spatola sul bordo del pozzo. Abbassare delicatamente ogni segmento nel bene usando la punta dell'ago fino a quando leggermente sommerso la sospensione cellulare precedentemente seminato.
   5. Cultura renale segmento-SPEC in 2:1:1 rapporto di mezzo MGF-2/EGM-2/DMEM (2,5 mL di volume totale). Cambiare ogni 24 ore di coltura per 3 giorni. Rimuovere i costrutti dagli stampi a 72 h e difficoltà o flash-blocco per l'elaborazione.

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Risultati

Il protocollo descritto produce circa 50 segmenti renale per ogni sezione³ mm 2 piramidale del tessuto renale. I segmenti renali che sono stati elaborati e stampati hanno componenti tubolari e glomerulare in diverse proporzioni (Vedi Figura 2). I segmenti intatti sono stati sottoposti ad un test per determinare la redditività dei diversi segmenti una volta ogni 24 ore per tre giorni. Verde fluorescente calceina-AM è presente con attività dell'es...

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Discussione

Metodi utilizzati per tessuto renale vivente costrutti variano notevolmente per quanto riguarda sia il tipo delle cellule e biomateriali utilizzati e in molti casi, l'ingegnere sono obsoleti o non ben caratterizzati in letteratura⁷. Mentre molti stanno usando cellule staminali approcci o ricapitolare i singoli componenti dell'architettura renale in isolamento, è la prospettiva di ricreare artificialmente un intero organo con oltre 26 tipi differenti delle cellule differenziate da sospensioni cell...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Non-fenestrated Sterile Field	Busse Hospital Disposables	696
Fenestrated Sterile Field	Busse Hospital Disposables	697
Halsted Mosquito Forceps 5 Curved	Miltex	Mil-7-4	"Hemostat" in manuscript
Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth	Fine Science Tools	11155-10	Fine forceps with teeth
Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth)	Fine Science Tools	11152-10	Fine forceps without teeth
Fine Scissors - Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09	Iris Scissors
Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5%	Purdue Products L.P.	67618-151-17
Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4")	Fisher Healthcare	22-415-469
Dulbecco's Phosphate Buffered Solution	Corning	21-030-CV
Penicillin/Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-Cl
Isoflurane, USP	Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson	2254845
Nair Hair Remover	Nair	22600-23307	Hair Removal Cream in text
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2705	Diluted to 70% Ethanol Solution
BioLite 60mm Tissue Culture Dish	Themo-Scientific	130181
Press'n Seal	Glad	12587-70441	Applied to Stereoscope
SZX16 Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Illuminator	Cole Parmer	41720-20
Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck	Cole Parmer	EW-41720-60
Scalpel Handle #3	Miltex	Mil-4-7
Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15	Bard-Parker	371115
31 1/2 Gauge Needle	ThermoFisher Scientific	14-826F	Becton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-017-CV
Fetal Select 100% Bovine Serum	Atlas Biologicals	FS-0500-AD
Normal Human Dermal Fibroblasts	Lonza	CC-2511
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells	Sciencell Research Laboratories	7200
Surgical Loupes (2.5x)	Orascoptic	(N/A) Custom Order
FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added)	Lonza	CC-3131, CC-4126
EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added)	Lonza	CC-3156, CC-4176
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells	ThermoFisher Scientific	L3224
Anti-Cytokeratin-18 Antibody	Abcam	ab668
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633	ThermoFisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546	ThermoFisher Scientific	A-11010
Anti-Von Willebrand Factor Antibody	Abcam	ab6994
Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate	Sigma Aldrich	A9771-50MG
Hoescht 33342	BD Pharmingen	561908
Background Buster	Innovex Biosciences	NB306