Un ratto di modello di affaticamento centrale utilizzando una versione modificata più piattaforma metodo

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per introdurre un modello del ratto di affaticamento centrale utilizzando la modifica metodo di piattaforma multiplo (MMPM).

Abstract

In questo articolo, abbiamo introdotto un modello del ratto di affaticamento centrale utilizzando la modifica metodo di piattaforma multiplo (MMPM). La casella più piattaforma è stata progettata come un serbatoio di acqua con piattaforme strette sul fondo. I ratti di modello sono state inserire nel serbatoio e levato in piedi sulle piattaforme per 14 h (18:00-08:00) al giorno per 21 giorni consecutivi, con un gruppo di controllo vuoto impostato per contrasto. Alla fine della modellazione, ratti nel gruppo modello hanno mostrato un'evidente aspetto affaticato. Per valutare il modello, abbiamo effettuato numerosi test comportamentali, tra cui il campo aperto test (OFT), l'elevato plus prova del labirinto (EPM) e la prova di nuoto esaustivo (ES). I risultati hanno mostrato quell'ansia, compromissione della cognizione spaziale, performance muscolare povero e rifiutato attività volontaria presentata nei ratti di modello confermano la diagnosi di affaticamento centrale. Modifiche dei neurotrasmettitori centrali inoltre verificato il risultato. In conclusione, il modello simulato con successo centrale fatica, e lo studio futuro con il modello può aiutare a rivelare il meccanismo patologico della malattia.

Introduzione

La fatica è uno dei fattori principali che minacciano la salute umana¹. Negli ultimi decenni, varie ricerche hanno dimostrato che la stanchezza è marginalmente-triggered ma centrale-driven e sempre accompagnato con disturbi emotivi e cognitivi. Fisiologo italiano r. Mosso inizialmente proposto la parola fatica centrale². È generalmente definito come attività volontaria limitata e cognizione danno dovuto disfunzione della trasmissione degli impulsi nel sistema nervoso centrale (SNC)³. Confrontato con affaticamento muscolare periferico, affaticamento centrale sottolinea cambiamenti nel SNC, nonché il conseguenti disturbi emozionali/comportamentistici, tra cui depressione, ansia, cognizione danno e perdita di memoria. Uno studio mostra che molti fattori possono indurre fatica centrale, tra cui un'eccessiva attività fisica e lo stress mentale sono abbastanza indispensabile⁴. Per quanto riguarda la patogenesi, le teorie come il triptofano-kynurenine pathway ipotesi⁵ spiegano i cambiamenti in determinate vie; Tuttavia, studi più approfonditi sono comunque tenuti a rivelare le correlazioni di centrale-periferico di affaticamento centrale.

Poiché il meccanismo di fondo di affaticamento centrale è ancora chiaro, un modello animale efficace è molto importante per ulteriori ricerche. I modelli esistenti di affaticamento sono per lo più indotta da esercizio fisico eccessivo, come tapis roulant⁶ e nuoto peso caricato⁷, con poca preoccupazione su fattori mentali. Per meglio simulare lo sviluppo di affaticamento centrale, il nostro gruppo ha sviluppato un modello del ratto con la MMPM. Durante il processo di modellazione, ratti rimangono in piedi sulle piattaforme strette nella casella piattaforma Multiple per lunghe ore, tra cui parte del tempo di sonno. Diverso dai modelli di esercizio fisico eccessivo, il modello MMPM utilizza privazione parziale di sonno come un fattore mentale in considerazione la patogenesi complessa di affaticamento centrale.

Per la valutazione del modello, usiamo i test OFT ed EPM per determinare ansia umore e attività di volontariato. Il test di ES viene eseguito per misurare le prestazioni dei muscoli periferici. Inoltre, prendiamo del cervello del ratto e rilevare la dopamina (DA) / contenuto di serotonina (5-HT) in entrambi hypothalamuses per osservare le differenze di neurotrasmettitore centrale.

Il protocollo presentato di seguito è progettato per affaticamento centrale modello indotto da ripetute attività fisica e la mancanza di sonno, che imita una condizione comune nella vita umana. Tuttavia, regolando la durata del modello, può essere utilizzato in molti altri campi, come negli studi di osservazione e lo stress di sonno. In futuro ricerca, speriamo che questo modello vi aiuterà a scoprire altre CNS cambiamenti e la loro connessione con il sistema periferico, per rivelare il meccanismo di patogenesi di affaticamento centrale.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati mantenuti in conformità con le linee guida dalla legislazione cinese sull'uso etico e cura degli animali di laboratorio.

1. pre-modellazione preparazione

1. Preparazione in laboratorio
   1. Eseguire la lampada UV per almeno 30 min prima dell'esperimento.
   2. Controllo della temperatura di laboratorio a 25 ± 3 ° C e umidità relativa 30% circa.
   3. Accendere il luce alle 06:00 laboratorio e spegnerlo alle 18:00 per stabilire un ciclo luce/buio di 12 h/12 h.
2. Costruzione di box piattaforma multiple
   1. Costruire un serbatoio di plastica opaco senza una copertura di 110 × 60 × 40 cm³.
   2. Difficoltà quindici piattaforme circolari (h = 8 cm, d = 6,5 cm) sul fondo del serbatoio, quale inserviente distribuire in tre righe e cinque colonne. Lasciare spazio sufficiente tra ogni piattaforma, circa 10 cm tra colonne e 13 cm tra le righe.
   3. Impostare una presa di acqua sulla parte laterale del serbatoio e installare un rubinetto.
   4. Fare un coperchio di ferro-rete metallica per il carro armato con una scatola di cibo appesi su di esso.
3. Raggruppamento e ratti di alloggiamento
   Nota: I ratti maschii di Wistar di 8 settimane di vita, peso di circa 200-210 g, sono utilizzati nell'esperimento. I ratti vivono in gruppi durante il processo di modellazione.
   1. Numero di radici di coda dei ratti con un pennarello.
   2. Pesare i ratti, escludere l'estremamente leggeri o pesanti e dividere il resto in modo casuale nei gruppi modello e controllo.
   3. Mettere delicatamente i ratti in gabbie pulite e consentire loro di ambientarsi al laboratorio per almeno 3 giorni. Fornire acqua sufficiente e approvvigionamento di generi alimentari.

2. modellazione con MMPM

Nota: Il processo inizia alle 18:00 e finisce alle 08:00 del giorno successivo, per un totale di 14 h al giorno, per 21 giorni. Per evitare i fattori di interferenza, la stessa persona è tenuta ad effettuare l'intero esperimento, mentre indossa il cappotto del laboratorio stesso. 10 ratti Wistar sono usati nell'esperimento.

1. Appoggiate il serbatoio su una superficie piana, ad esempio, il piano. Quindi riempire il serbatoio con circa 7 cm di acqua tiepida (25 ± 3 ° C), circa 1 cm sotto la piattaforma piana.
2. Preparare abbastanza cibo e bevande per tutti i ratti nel serbatoio per 1 giorni. Messo di foraggio e acqua nel contenitore di cibo e appenderlo sulla copertina.
   Nota: Alcuni ratti intelligenti imparano a riposare sulla casella di cibo. Se è così, li guida nel serbatoio.
3. Prendere i ratti del gruppo modello fuori dalla gabbia, li afferra per la coda e metterli delicatamente nel serbatoio. Avviare tutti i ratti nell'acqua invece le piattaforme per motivare la loro paura dell'acqua. Assicurarsi che ogni ratto ottiene una piattaforma per stare su, mentre ratti del gruppo di controllo rimangono nelle loro gabbie originale con cibo e acqua sufficienti.
4. Coprire il serbatoio. Monitorare i ratti per evitare lesioni accidentali. Se un ratto rimane in acqua per più di 1 ora senza salire sulla piattaforma, prenderlo dal serbatoio e rimuoverlo dal test.
5. Dopo 14h, prendere i ratti di modello dal serbatoio e asciugare i capelli con un phon. Re-mark code dei ratti se si affievolisce. Restituire i ratti a loro gabbie originale e fornire loro cibo e acqua sufficienti.
6. Lavare ogni angolo della vasca. Elevare un lato del carro armato e aprire il rubinetto per il liquame di deflusso.
7. Disinfettare il serbatoio con uno spray di etanolo 75% ed esporlo alla luce UV.

3. modello di valutazione: Test comportamentali

Nota: Tutte le prove sono eseguite in laboratorio comportamentale. Rumore e luce supplementare non consentiti durante la prova per evitare disturbi. Se possibile, utilizzare la stessa persona (e) per condurre ogni test. Un cappotto scuro e guanti sono necessari per il riconoscimento di scala di grigi nell'elaborazione dell'immagine. Eseguire l'OFT prima come ha il minimo effetto sul comportamento del ratto.

1. OFT
   1. Controllare il registratore sulla casella campo aperto per assicurarsi che esso sia collegato correttamente alla workstation e copre ogni angolo della scatola. Regolare l'illuminazione per eliminare le ombre nella casella.
   2. Spostare i ratti in laboratorio comportamentale nelle loro gabbie originale. Consentire loro di acclimatare per almeno 1 h prima del test.
   3. Pulire e disinfettare la casella con etanolo al 75% per garantire che non c'è nessun escremento o odore lasciato da esperimento precedente.
   4. Rimuovere un ratto dalla gabbia con il suo schienale e inserirlo delicatamente l'area centrale della finestra. Ritirarsi rapidamente le braccia dalla casella per non bloccare il tiro.
   5. Inserire il numero del ratto e avviare la registrazione. Contare e registrare la frequenza di attività verticali del ratto, tra cui l'allevamento e l'arrampicata.
   6. Dopo 5 min, interrompere la registrazione, prendere il topo fuori dalla scatola e restituirlo alla gabbia.
   7. Ripetere i passaggi da 3.1.3 - 3.1.6 finché tutti i ratti hanno terminato il test.
2. EPM
   1. Eseguire la procedura di verifica preliminare e acclimatazione per quanto riguarda l'OFT (passaggi 3.1.1 - 3.1.2).
   2. Rimuovere un ratto dalla gabbia con il suo schienale e metterla delicatamente sulla parte di giunzione dei due bracci. Atterrare il topo verso il braccio sinistro aperto e lasciare in fretta per non bloccare il tiro.
   3. Inserire il numero del ratto e avviare la registrazione. Contare e registrare la frequenza delle entrate differenti del braccio. Se il ratto scende il labirinto nel test, pick up e rispedirlo a labirinto. Registrare informazioni dettagliate per l'analisi dei dati.
   4. Dopo 5 min, interrompere la registrazione, prendere il topo fuori e restituirlo alla gabbia.
   5. Rimuovere gli escrementi e pulire il labirinto con etanolo di 75% per eliminare l'odore del ratto ex.
   6. Ripetere i passaggi 3.2.2 - 3.2.5 finché tutti i ratti hanno terminato il test.
3. Test di ES
   1. Riempire il serbatoio di nuoto (70 × 30 × 110 cm³) con 80 centimetri di acqua calda (25 ± 3 ° C).
      Nota: Se c'è un termostato nel serbatoio, la temperatura dell'acqua dovrebbe essere impostata circa 37 ° C, che è simile alla temperatura corporea del ratto. In caso contrario, impostarlo a temperatura ambiente per mantenere costante.
   2. Fanno un carico per ogni ratto con perno grappoli e legarlo delicatamente sulla sua radice della coda. Il carico pesa 10% del peso del ratto.
   3. Afferrare un topo dalla coda e gettarlo nel carro armato di swimming. Se i ratti huddle o aggrappano alla parete, li contraddistingue e spingerli indietro nell'acqua.
   4. Avviare il cronometraggio al momento quando il ratto viene messo in acqua e i tempi di arresto quando è esaurita, che è dimostrato come il fallimento a lottare fuori dall'acqua con la bocca e il naso sotto l'acqua per più di 10 s.
      Nota: A volte, esaurimento e annegamento si verificano all'improvviso. Essere sicuri di avere abbastanza sperimentatori per registrare e salvare l'animale allo stesso tempo.
   5. Rimuovere i ratti esausti fuori dall'acqua senza interrompere gli altri. Asciugare i capelli, ri-contrassegnare i loro numeri e rimandarli a gabbia.
   6. Al termine di un gruppo, cambiare l'acqua nel serbatoio. Al termine di tutti i ratti, svuotare il serbatoio di nuoto e pulire e sterilizzarlo con etanolo e luce UV.

4. modello di valutazione: Neurotrasmettitore centrale rilevazione

1. Anestetizzare il topo con l'iniezione intra-peritoneale di idrato di cloralio 10% (3 mL/kg) fino a quando è incosciente.
2. Decapita il ratto.
3. Fare un'incisione longitudinale lungo la linea post-mediale, aprire il cranio ad entrambi i lati ed esporre il cervello. Capovolgere il cranio, il cervello di rimuovere e mettere il cervello su un sacchetto di ghiaccio.
4. Separare e rimuovere l'ipotalamo, che è la zona a forma di diamante nella parte centrale della base del cervello che ha un chiaro confine con tessuti circostanti. Posto in una provetta sterile e congelarlo con azoto liquido. Conservare tutti i campioni in frigorifero-80 ° C.
5. Rilevare il contenuto di DA e 5-HT nell'ipotalamo mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)⁸.

Risultati

Descriviamo un modello del ratto di affaticamento centrale utilizzando MMPM. 24 ratti Wistar sono divisi a caso nel gruppo di controllo e il gruppo di modelli, con 12 ratti in ogni gruppo. L'apparato di modello è stato progettato come un serbatoio di acqua con piattaforme strette sul fondo (Figura 1). Ratti di modello stanno sulle piattaforme per 14 h al giorno, compreso il tempo parziale di sonno, per 21 giorni (Figura 2).

...

Discussione

Il MMPM è originariamente progettato per privazione di sonno⁹. Ratti sono lanciati in un serbatoio d'acqua con piattaforme fissate sul fondo. Spinti dalla paura istintiva di acqua, ratti rimangono in piedi sulle piattaforme e si verifica senza dormire. Lo studio dimostra che diverse ore di privazione di sonno conducono ai vari cambiamenti nel comportamento del ratto e dell'umore, tra cui riconoscimento danno¹⁰, emozioni negative¹¹e fatica centrale. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
multiple platform sleep deprivation water tank	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high
Wistar rats	Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company	license number SYXK (Beijing) 2016-0011	Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g)
Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph	Agilent	G1379A, G1311A, G1313A , G1316A	G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box
DECADE II SDC electrochemical detector	Dutch ANTEC company		glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge	HERAEUS
VCX130 ultrasonic fracturing instrument	SONICS
ACS-ZEAS electronic scale	Phos technology development, Beijing.		The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g.
Open Field Box	Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine		wooden box of open field  100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median.
Elevated Plus-maze	Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD.		The open arms and close  arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high.
rat swimming bucket.	Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China.		The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats.
Thermometer	Shiya instrument co., LTD., changzhou,China.		Control water temperature
Small water pump	Xincheng technology co., LTD., chengdu,China.		Used for water tank and swimming behavior.
Ethovition3.0 behavioral software.	Nuldus,Netherlands		Measurement analysis of rat behavior videos.