Elettricamente conduttivo impalcatura di modulare e fornire cellule staminali

Riepilogo

Questo protocollo descrive la realizzazione di un sistema di coltura cellulare per consentire la semina delle cellule staminali su un'impalcatura polimero conduttivo per elettrostimolazione in vitro e successive in vivo l'impianto della cellula formativa-seminato impalcatura utilizzando un tecnica mininvasiva.

Abstract

Terapia con cellule staminali è emerso come un'eccitante corsa terapeutica, ma il metodo di consegna ottimale rimane poco chiaro. Mentre la tecnica di microiniezione è stata utilizzata per decenni per fornire cellule staminali in modelli di ictus, questa tecnica è limitata dalla mancanza di capacità di manipolare le cellule staminali prima dell'iniezione. Questa carta descrive in dettaglio un metodo di utilizzo di un'impalcatura polimero conduttivo per la consegna di cellule staminali. La stimolazione elettrica delle cellule staminali utilizzando un'impalcatura polimero conduttivo altera geni di cellule staminali coinvolti nella sopravvivenza delle cellule, la risposta infiammatoria e rimodellamento sinaptico. Dopo precondizionamento elettrici, le cellule staminali sul patibolo sono trapiantate intracranially in un modello del ratto di occlusione dell'arteria cerebrale centrale distale. Questo protocollo descrive una tecnica potente per manipolare le cellule staminali tramite un'impalcatura polimero conduttivo e crea un nuovo strumento per sviluppare ulteriormente la terapia a base di cellule staminali.

Introduzione

Il colpo è la seconda causa di morte nel mondo e la quinta causa di morte negli Stati Uniti. Nonostante questi alti tassi di mortalità, trattamenti per tempi di recupero attualmente rimangono una sfida con nessun valide opzioni mediche attualmente disponibili¹. Ci sono attualmente circa 300 test clinici a che fare con colpi ischemici, di cui solo 40 utilizzare cellule staminali. Gli studi precedenti hanno dimostrato che le terapie con cellule staminali hanno un effetto benefico sulla corsa riparazione^2,3. Fattori paracrini come fattore neurotrophic cervello-derivato (BDNF) e trombospondina-1 (THBS-1) rilasciati dalle cellule progenitrici neurali umane trapiantate (hNPCs) hanno mostrato una migliore recupero funzionale attraverso meccanismi associati con un aumento Synapse formazione, angiogenesi, ramificazioni dendritiche e nuove proiezioni assonali, come pure di modulazione del sistema immunitario^4,5,6. Tuttavia, i metodi di consegna ottimale delle cellule staminali rimangono sfuggenti.

Consegna di successo sulle cellule staminali al cervello rimane una sfida. Attualmente, idrogel iniettabili e sistemi di ponteggio polimerici sono stati introdotti per fornire cellule staminali. Questi metodi di consegna proteggono le cellule staminali durante il trapianto, nonché offrono protezione da ambienti post-ictus tra cui risposta infiammatoria dell'ospite e condizioni ipossiche^{7,8,9 , 10}. Tuttavia, i materiali più comunemente usati sono inerti, che limita l'uso della modulazione continua (cioè, stimolazione elettrica) delle cellule¹¹. La stimolazione elettrica è uno spunto che influenza la differenziazione, densità di canali ionici e neuriti delle cellule staminali¹². Rispetto ai polimeri inerti, polimeri conduttivi possono trasportare una corrente che consente per la stimolazione elettrica e la manipolazione di cellule staminali². Tuttavia, il meccanismo preciso con cui stimolazione elettrica modula il rilascio di fattore neurotrophic (cioè, BDNF e THBS-1) è ancora non completamente esplorato.

In questo protocollo, descriviamo i passaggi per costruire un sistema di coltura cellulare che consiste di uno scaffold polimerici, polipirrolo (PPy), che permette per la stimolazione elettrica in vitro . A causa del modo in cui è realizzato il sistema di coltura cellulare, è possibile impianto successivo dell'impalcatura della cellula formativa-seminato sulla corteccia del peri-infarto. Per questo sistema, abbiamo presupposto elettricamente le cellule staminali sul patibolo per un breve periodo di tempo prima dell'impianto. A seguito di stimolazione elettrica, lo scaffold polimerici che trasportano le cellule è impiantato con successo intracranially utilizzando un metodo come minimo dilagante.

Protocollo

Tutte le cellule staminali e procedure degli animali sono state approvate dal comitato di supervisione di ricerca sulle cellule staminali di Stanford e dal pannello di amministrazione dell'Università di Stanford su Laboratory Animal Care (SCRO-616 e APLAC-31909).

1. incisione del vetro di ITO

1. Preparare l'ossido della latta dell'indio (ITO)-vetrino coperto inserendo un agente mascherante sopra il lato conduttivo del vetro.
   Nota: Nastri trasparenti più commerciali possono essere utilizzati come un agente mascherante.
   1. Rimuovere la maschera in eccesso utilizzando una lama, lasciando solo la forma desiderata del progetto definitivo ITO coperto sul vetro.
2. Combinare il 5% (v/v) di acido nitrico e 45% (v/v) di HCl in un becher di vetro all'interno di una cappa aspirante per preparare la soluzione di incisione.
   1. Utilizzare un piatto caldo e un termometro per garantire che la temperatura della soluzione di incisione è mantenuta a 70 ° C.
3. Una volta che la soluzione di acquaforte raggiunge i 70 ° C, immergere il vetrino mascherato-ITO vetro nella soluzione per 2 minuti per rimuovere lo strato di ITO in eccesso.
   Nota: La mascheratura nastro protegge lo strato di ITO dall'esposizione a soluzione acida.
4. Rimuovere il vetrino dalla soluzione e sciacquare con deionizzata (DI) H₂O.
5. Rimuovere con cautela la maschera e misura la resistenza utilizzando un multimetro per garantire che il restante ITO è intatto. Letture dell'area desiderata acidato dovrebbero essere circa 0 Ω.

2. preparazione della soluzione di pirrolo

1. In una bottiglia di vetro da 1000 mL, sciogliere 70 g di sodio dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) in 600 mL DI H₂O.
2. Una volta che il NaDBS è sciolto, aggiungere 14 mL di 0,2 M pirrolo e 386 mL DI H₂O alla soluzione.
3. Coprire la soluzione con foglio di alluminio e conservare a 4 ° C.

3. placcatura elettrolitica di polipirrolo su vetro di ITO

1. Riscaldare la soluzione di pirrolo a temperatura ambiente fino a quando NaDBS è completamente ridisciolto.
   Nota: Questo richiede circa 15-20 minuti.
2. Versare 25 mL della soluzione di pirrolo in un becher.
3. Collegare il vetro acidato ITO di un multimetro e immergere il vetrino nella soluzione di pirrolo.
   1. Assicurarsi che il lato con 0 resistenza Ω è rivolto verso l'elettrodo di riferimento di mesh platino.
4. Applicare una corrente elettrica per avviare Galvanotecnica di PPy sulla superficie ITO utilizzando un multimetro (corrente controllata a 3 mA/cm² per 4 ore).
5. Rimuovere il vetro ITO dal multimetro e lavare elettrolitico-PPy in DI H₂O per rimuovere residui dell'agente tensioattivo.
6. Staccare delicatamente la piastra elettrolitica-PPy i vetro di ITO con una lama di rasoio.
   1. Conservare la piastra PPy a temperatura ambiente.

4. preparazione di polidimetilsilossano (PDMS)

1. Utilizzando una spatola e un piatto di pesatura, mescolare 18 g di agente base con 2 g di agente indurente e versare il composto in stampi di vetro due 10 x 8 cm.
2. Rimuovere le bolle dagli stampi utilizzando una camera a vuoto per 15-20 minuti.
3. Posizionare gli stampi in forno a 70 ° C per 3 h.
4. Una volta raffreddato, è possibile utilizzare una spatola piatta per rimuovere il PDMS dagli stampi.

5. fabbricazione di vano di stimolazione elettrica In Vitro

1. Sterilizzare in autoclave il flusso e piastre di metallo (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) valvole a 120 ° C per 1 ora.
2. Utilizzando una diapositiva di camera come un modello, tagliare due pezzi di PDMS.
   Nota: Un pezzo di PDMS serve come il perimetro della camera cellulare con ritagli di due piazze contigue all'interno della camera di cella. L'altro pezzo PDMS è un contorno del perimetro della camera.
   1. Tagliare l'interno camera di cella che è quadrato a forma di e corrisponde alla forma dell'alloggiamento delle cellule. Assicurarsi che la forma complessiva di entrambe le parti di PDMS è rettangolare e corrisponde a quello della diapositiva da camera.
3. I materiali di strato come segue dal basso verso l'alto: (1) metallo piatto, (2) PDMS (senza aperture), (3) PPy piastra (perpendicolare alla PDMS), (4) PDMS (con ritagli) e camera (5) delle cellule.
4. Bloccare l'apparato insieme una volta che completamente è allineato.
5. Tagliare due pezzi di 60 cm di un filo metallico e utilizzare pasta d'argento per collegare un filo ad ogni estremità della piastra PPy che sporge dalla parte esterna della camera. Assicurarsi che i cavi siano abbastanza a lungo per estendere dall'apparecchio verso l'esterno di un incubatore.
6. Una volta che la pasta d'argento è guarita, rafforzare e sigillare il collegamento del filo con resina epossidica.
   1. Registrare la resistenza utilizzando un multimetro per assicurarsi che il campo applicato è lo stesso in ogni camera.
   2. Per l'impianto, rimuovere i fili; sbloccare gli alloggiamenti di cella e PDMS e poi li separano dal patibolo conduttivo. La dimensione delle impalcature impiantate è circa 1 x 3 x 0,25 mm.

6. cellule progenitrici neurali umane (hNPCs) su PPy di placcatura

1. Sterilizzare gli alloggiamenti assemblati sotto luce UV per 2 ore.
   1. Dopo 1 ora, ruotare l'assemblato chambers 90°.
2. Dopo la sterilizzazione, rivestire la superficie di PPy nella parte inferiore della camera con 800 µ l di un substrato di rivestimento e consentire il substrato solidificare il PPy piastra in un incubatore a 37 ° C 5% CO₂ per 1 h.
3. Dopo 1 ora, rimuovere il surnatante dalle camere e risciacquare delicatamente con 1 mL di DPBS + Ca + Mg per bene.
   Nota: Evitare di lavare la superficie di PPy con forza come questo farà sì che il distacco del substrato rivestimento.
4. Utilizzando supporti di cellule fresche, meccanicamente dissociare le cellule coltivate per uso con gli alloggiamenti da una piastra di coltura del tessuto con delicato pipettaggio.
   Nota: Le cellule dovrebbero essere 90-100% confluenti sulla dissociazione.
5. Raccogliere hNPC pellet utilizzando una centrifuga a 8000 x g per 5 minuti.
6. Utilizzando un emocitometro, contare e risospendere le cellule in un volume di 100.000 cellule/cm².
7. Piastra di 100.000 cellule in ogni camera ben (100.000 cellule/cm² in 1 mL di media).
8. Tornare chambers incubatore a 37 ° C 5% CO_2.

7. elettrostimolazione del hNPCs

1. Un giorno dopo la semina le cellule su chambers, utilizzare un generatore di forme d'onda per applicare la stimolazione elettrica alle celle.
2. Prima stimolazione, rimuovere i vecchi media da ogni camera ben e saziatevi con 800 µ l di media fresco.
3. Dopo avere modificato i media, inserire nuovamente gli alloggiamenti dell'incubatrice, estendere i cavi dall'incubatrice e allegarli a un generatore di forme d'onda
4. Applicare la stimolazione delle cellule con un segnale ad onda quadra a ± 400 mV con 100 Hz per 1 h.
5. Dopo la stimolazione, rimuovere i fili e incubare gli alloggiamenti per un altro giorno in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂.
6. Eseguire successiva analisi biologiche tra cui la vitalità cellulare e reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR) seguendo il protocollo del produttore.

8. in Vivo PPy impianto

1. Eseguire modelli di ictus di occlusione dell'arteria cerebrale centrale distale (dMCA) su T cellula-carenti ratti nudi maschio adulto (NIH-RNU 230 ± 30g) come descritto in precedenza². Eseguire l'occlusione l'impianto una settimana post-dMCA.
2. Un giorno prima dell'intervento, dare ampicillina (1 mg/mL) per i ratti in loro acqua di gabbia.
3. Anestetizzare il ratto in una camera di induzione utilizzando 0,5 - 3% mg/kg di isoflurane somministrata tramite inalazione.
4. Confermare amputate del ratto da una mancanza di risposta riflessa di punta pizzico.
   1. Mentre l'animale è sotto anestesia, continuare a monitorare la sua membrana colore, pattern respiratorio e temperatura rettale ogni 15 minuti.
5. Una volta confermata la amputate, applicare le lacrime artificiali su occhi di topo per prevenire la secchezza.
6. Assicurare che una tecnica asettica è mantenuta durante questa procedura utilizzando guanti sterili e un telo chirurgico sterile¹³. Mantenere gli strumenti chirurgici sterili all'interno di un campo sterile.
7. Mentre il ratto è sotto anestesia, praticare un craniectomy sopra la corteccia sinistra. Aprire la dura madre.
   1. Rimuovere il mater di dura dal cervello utilizzando un ago chirurgico micro-sottile.
8. Impiantare le impalcature conduttive da sistema in vitro sulla corteccia del ratto.
   Nota: Per i nostri esperimenti, abbiamo impiantato impalcature da in vitro giorno 3 dopo il placcaggio di hNPC.
   1. Inserire l'impianto principalmente sulla corteccia penombra mediale alla lesione di colpo.
9. Dopo la messa il patibolo, è posto surgicel sopra l'impianto per impedire il movimento con la chiusura della pelle.
10. Suturare la ferita chiusa e iniettare per via sottocutanea i ratti con buprenorfina SR ad un dosaggio di 1 mg/kg per gestire il dolore associato con la chirurgia stereotassica e occlusione dMCA.
11. Posizionare il ratto in una gabbia di recupero come riprende conoscenza.
    1. Non lasciare mai l'animale incustodito mentre è incosciente.
    2. Non lasciare mai l'animale con gli altri fino a quando non si è pienamente guadagnato coscienza.
12. Monitorare gli animali ogni giorno per segni di dolore, compreso perdita di peso corporeo, assunzione di cibo/acqua in diminuzione, ridotta cappotto governare/spettinati, diminuito/aumentato attività spontanea, postura anormale, disidratazione/pelle tenting, gli occhi infossati, nascondersi, automutilazioni, respirazione rapida, respirazione a bocca aperta, spasmi muscolari, tremore, tremito e vocalizzazione.
    1. Monitorare gli animali ogni giorno fino a quando sembra che essi sono mangiare, bere, toelettatura e aumento di peso; e poi settimanalmente dopo aumento di peso.
13. Euthanization precoce tramite inalazione di CO₂ e una conferma secondaria di euthanization (tale da garantire l'animale non farà rivivere a causa di inalazione di ossigeno normale alimentazione post CO₂ ) si verificherà per qualsiasi animale che sembra essere non mangiare, bere e aumentare di peso dopo l'intervento chirurgico iniziale; appare nel dolore; o appare impossibile completare i test comportamentali a causa di un maggiore del previsto disavanzo corteccia motoria.

Risultati

Lo schema illustrato nella Figura 1 rappresenta il flusso di lavoro complessivo della stimolazione elettrica dei hNPCs e potenziali applicazioni a valle. Una limitazione corrente nella terapia con cellule staminali è che le cellule staminali sono esposti a un ambiente di post-trapianto duro tra cui l'infiammazione e condizioni ischemiche. Queste difficili condizioni probabilmente limitano la loro efficacia terapeutica^14,

Discussione

Crescenti evidenze ha dimostrato la promessa delle cellule staminali come terapia romanzo tratto. Questa promessa ha provocato un grande sforzo per avanzare terapeutica delle cellule staminali al capezzale con almeno 40 studi clinici in corso o completati. Patologia di corsa offre un unico disturbo neurologico che si presta a terapia con cellule staminali, perché dopo l'insulto acuto, non c'è nessun processo neurodegenerativo, impedendo così il recupero. Il meccanismo esatto di cellule staminali-aumentata tempi di rec...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706