Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

Riepilogo

In questo studio, nanomateriali antimicrobici sono stati sintetizzati da ossidazione acida di nanotubi di carbonio e riduttiva successiva deposizione di nanoparticelle d'argento. Test di citotossicità ed attività antimicrobica sono stati effettuati con i nanomateriali come preparato.

Abstract

In questo studio, nanotubi di carbonio multi-parete (MWCNT) sono stati trattati con una soluzione acquosa di acido solforico per formare un gruppo funzionale di base di ossigeno. MWCNT d'argento sono stati preparati dalla deposizione riduttiva di argento da una soluzione acquosa di AgNO₃ sulla MWCNT ossidato. Dato il colore unico del CNT, non era possibile applicarli alla concentrazione minima inibente o saggi di tossicità mitocondriale per valutare la tossicità e proprietà antibatteriche, poiché potrebbe interferire con i dosaggi. La zona di inibizione e la concentrazione minima battericida per l'Ag-MWCNT sono stati misurati e Live/Dead e saggi di Trypan Blue sono stati usati per misurare le proprietà antibatteriche e tossicità senza interferire con il colore del CNT.

Introduzione

L'obiettivo finale di questo studio è di rendere ecologici nanomateriali antibatterici che possono inibire la crescita di batteri che forma biofilm. Questi nanomateriali antibatterici hanno il potenziale per superare i problemi di resistenza di tossicità e Antibiotico di antibiotici composti chimici o di prodotti chimici comunemente usati. Un biofilm è una sostanza polimerica extracellulare idratata (EPS) che è composta da polisaccaridi, proteine, acidi nucleici e lipidi^1,2. Biofilm impediscono l'intrusione di sostanze estranee e aiutano i batteri crescono vigorosamente^3,4. Biofilm causano odori e malattie infettive croniche^5,6. Methylobacterium spp., ad esempio, cresce aderendo ai luoghi dove l'acqua è sempre presente o dove è difficile garantire l'eradicazione batterica su una base continua, come scambiatori di calore del condizionatore d'aria, bagni con doccia e dispositivi medici. Questi tipi di biofilm causano odori e malattie infettive croniche^5,6.

In genere, prodotti chimici o antibiotici composti chimici vengono utilizzati per inibire la crescita di batteri che formano biofilm. La comparsa di batteri resistenti agli antibiotici e le preoccupazioni circa sicurezza in vivo delle sostanze chimiche stanno determinando l'esigenza di sviluppare nuovi materiali per prevenire la formazione di biofilm e di inibire la crescita di batteri.

In questo studio, antimicrobici nanomateriali sono sintetizzati che sono esenti da tossicità e resistenza agli antibiotico. L'argento è una sostanza antimicrobica ben nota, e recenti sviluppi nella nanoscienza e nanotecnologia hanno portato alla ricerca attiva in effetti antimicrobici di nanoparticelle metalliche^7,8. Studi recenti hanno riferito che le dimensioni ridotte e l'elevato rapporto superficie-volume delle nanoparticelle di provocare una maggiore attività antibatterica^9,10,11.

I nanomateriali presentati qui combinano le nanoparticelle d'argento con maggiore proprietà antimicrobiche e nanotubi di carbonio con un alto allungamento, aumentando così la superficie per unità di volume. Il composito di nanotubi fabbricato delle nanoparticelle d'argento-carbonio esibisce notevoli proprietà antimicrobiche e minima tossicità per le cellule umane e animali. I processi sintetici negli studi precedenti utilizzano pericolosi agenti riducenti quali NaBH₄, formammide, dimetilformammide e idrazina. Il processo è complicato, pericoloso e richiede molto tempo. Il processo sintetico segnalato qui utilizza l'etanolo come agente riduttore significativamente meno pericoloso.

L'area di inibizione e la concentrazione minima battericida (MBC) per l'Ag-MWCNT sono stati misurati; Live/Dead e saggi di Trypan Blue sono stati usati per misurare la tossicità e proprietà antibatteriche. Concentrazione inibitoria minima (MIC) e saggi di tossicità mitocondriale (MTT) non sono stati effettuati a causa del colore insolito i nanotubi di carbonio che avrebbe interferito con i dosaggi. Infine, è stata determinata la concentrazione minima per prevenire la crescita di Methylobacterium spp senza influire sulle cellule di mammiferi.

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Protocollo

1. MWCNT ossidazione

1. Misura 30-50 mg di MWCNT in un flaconcino da 50 mL. Lentamente aggiungere 8 mL di H₂così₄: HNO₃ soluzione (90% concentrazione iniziale, 3:1 vol/vol) di pipetta con puntali per pipette da 1 mL.
   Attenzione: Questa preparazione deve essere condotta in una cappa chimica.
   1. Consentire 30 min per la reazione esotermica completare.
2. Sonicare la soluzione a 60-80 ° C e 160 W per 1 h fino a MWCNT si deposita nella parte inferiore della fiala.
   Attenzione: Il livello dell'acqua nel sonicatore dovrebbe essere inferiore rispetto alla parte superiore della fiala affinché l'acqua non verrà introdotto nel flaconcino.
3. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga.
   1. Con una micropipetta, aggiungere 30 mL di acqua distillata goccia a goccia la soluzione di MWCNT-COOH.
      Attenzione: Una forte reazione esotermica si verifica durante l'aggiunta di acqua distillata. Aggiungere acqua distillata lentamente e lasciare il tempo per il raffreddamento.
4. Centrifughi la soluzione MWCNT-COOH a 12.000 x g e a temperatura ambiente per 15 min.
   Attenzione: Quando si opera una centrifuga, accertarsi che la centrifuga rimane equilibrata inserendo un tubo con lo stesso peso di fronte la provetta del campione.
5. Rimuovere il surnatante con una pipetta e la punta della pipetta da 1 mL. Aggiungere 5 mL di etanolo con una pipetta e la punta della pipetta da 1 mL. Sciacquare le pareti del flaconcino con etanolo pipettato aggiuntiva. Centrifughi la soluzione a 12.000 x g e a temperatura ambiente per 15 min.
   1. Determinare il pH del surnatante con carta pH. Ripetere il lavaggio e la centrifugazione fino a quando il surnatante pH è neutro.
6. Rimuovere il surnatante tutti. Aggiungere 1 mL di acqua distillata per precipitare e disperdere uniformemente MWCNT-COOH in soluzione. Liofilizza la soluzione a-60 ° C sotto vuoto fino a secco.

2. argento nanoparticelle deposizione su MWCNT

1. Porre in una provetta conica da 50 mL 10 mg di MWCNT-COOH e diluire con 30 mL di acqua distillata. Sonicare soluzione a 60 ° C e 160 W per 1 h.
2. Posto 6 mL di 0,1 N AgNO₃ in una provetta conica da 50 mL e diluire con 18 mL di acqua distillata. Sonicare soluzione a 60 ° C e 160 W per 1 h.
   Attenzione: Aggiungere AgNO₃ in proporzione la massa totale di MWCNT tale che la massa totale di Ag non superi il 20%.
3. Aggiungere la soluzione di AgNO₃ goccia a goccia alla soluzione di MWCNT con una pipetta e la punta della pipetta 1ml mentre sonicating la miscela a 60 ° C e 160 w. continua sonicating per 1 h dopo l'aggiunta della AgNO₃.
4. Centrifughi la soluzione a 12.000 x g e a temperatura ambiente per 15 minuti e rimuovere il surnatante. Centrifugare la soluzione e rimuovere il surnatante due volte.
5. Aggiungere 1 mL di acqua distillata per la miscela di Ag-MWCNT e disperdere il precipitato in modo uniforme nella soluzione. Aggiungere 5 mL di etanolo e lasciare che la reazione di procedere a temperatura ambiente per 1 h.
6. Centrifughi la soluzione a 12.000 x g e a temperatura ambiente per 15 minuti e rimuovere il surnatante.
7. Determinare il pH del surnatante con carta pH. Ripetere il lavaggio e la centrifugazione fino a quando il surnatante pH è neutro.
8. Aggiungere 1 mL di acqua distillata a Ag-MWCNT e disperdere uniformemente nella soluzione. Liofilizzare la soluzione a-70 ° C sotto vuoto per 24 h.

3. zona di inibizione Test

1. Mescolare 18,12 g di agar R2A e 1 L di acqua distillata in un fiasco. Sterilizzare la miscela in autoclave a 121 ° C per 15 min.
2. Lasciare il gel a raffreddare a temperatura ambiente. Mettere 10 mL di gel in capsule di Petri prima dell'indurimento per preparare il terreno solido.
3. Posto 100 µ l di batteri su terreno solido. Diffondere i batteri sul media solido utilizzando una spatola.
   Attenzione: Questa procedura deve essere svolta in una cappa chimica illuminata con una lampada di alcol.
4. Incubare le piastre a 30 ° C per 48 h.
5. Mescolare 3,12 g di brodo di R2A con 1 L di acqua distillata in un fiasco. Sterilizzare la miscela in autoclave a 121 ° C per 15 min.
6. Trasferire le colonie coltivate in un mezzo liquido usando un ciclo e l'ago e incubare in un incubatore a 180 giri/min e 30 ° C.
7. Registrare il valore di OD (densità ottica) mediante spettrofotometria UV a 600 nm su base oraria per misurare la crescita batterica.
   Nota: R2A agar è stato utilizzato in questo test, piuttosto che l'agar Mueller-Hinton standard, perché R2A è preferito agar per la crescita di Methylobacterium spp.
8. Posto 10 mL di preparato R2A agar in una capsula Petri per preparare un agar di fondo.
   1. Mescolare 3,12 g di brodo di R2A e 8 g di agar con 1 L di acqua distillata. Sterilizzare la miscela in autoclave a 121 ° C per 15 min Place 10 mL di questo gel sull'agar inferiore.
9. Caricare 50 µ l di soluzione di Ag-MWCNT su disco di carta sterile con una micropipetta.
   1. Asciugare e sterilizzare Ag-MWCNT campione in una camera a vuoto sotto luce UV per 30 min.
10. Posto Ag-MWCNT campione sull'agar.
11. Incubare la piastra di agar a 30 ° C per 48 h.
12. Zona di misura di inibizione¹².
    Nota: Le istruzioni per il software utilizzato sono inclusi nei riferimenti.

4. antibatterico Test

1. Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.7 per preparare la coltura batterica.
2. Al massimo OD, inoculare 100 µ l di batteri in 3 mL di terreno liquido fresco con una punta di pipetta micro pipetta e 100-µ l.
3. Preparare cinque campioni di 50 µ l della soluzione di controllo in provette coniche da 15 mL. Aggiungere quanto segue per ogni tubo: 1) metanolo; 2) 1000 µ g/mL MWCNT-COOH; 3) 50 µ g/mL Ag-MWCNT; 4) 40 µ g/mL Ag-MWMWCNTs; 5) 30 µ g/mL Ag-MWCNT.
4. Incubare a 180 giri/min e 30 ° C fino a quando il controllo è al massimo attivo come determinato mediante spettrofotometria UV come descritto sopra.
5. Misurare il valore di OD di ogni campione e calcolare la concentrazione di MIC. Il valore di OD è direttamente correlato al numero di cellule batteriche nel brodo del campione.
6. Diffondere i batteri coltivati su un terreno solido con una spatola.
7. Incubare la piastra a 30 ° C per 48 h.
8. Contare le colonie batteriche e i valori CFU di misura per determinare attività antibatterica¹².
   Nota: Le istruzioni per il software utilizzato sono inclusi nei riferimenti.

5. attuabilità

1. Dopo la rimozione delle cellule di cultura da incubatrice, il mezzo di aspirazione e lavare tre volte con un lavaggio goccia a goccia di 5 mL di PBS.
2. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA in PBS per l'aspirazione e cella lavato dopo 1 min.
   1. Toccare la piastra per rimuovere cellule bloccate.
3. Aggiungere 5 mL di DMEM (Medium dell'Aquila di Dulbecco per volta) e quindi rimuovere le cellule. Centrifugare i campioni a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
   1. Aggiungere 1 mL di DPBS e mescolare.
   2. Contare le celle in 10 µ l della soluzione con una macchina automatica di conta cellulare.
      Nota: Le istruzioni per la macchina conta cellulare utilizzato sono inclusi nei riferimenti¹³.
4. Posto 1 × 10⁵ di AML12 cellule per pozzetto in una piastra di sei pozzetti contenenti soluzione DMEM. Il supporto contiene siero bovino fetale 10% (v/v) e 1% sterile antibiotico.
5. Incubare la piastra per 8-12 h a 37 ° C in un ambiente di aria 95% 5% CO₂.
6. Aspirare il surnatante da pozzi con un aspiratore.
   1. Aggiungere ciascun campione composto da controllo, NMS-DMSO (dimetilsolfossido) e 30-40 µ g/mL Ag-MWCNT a 1 mL di DMEM.
   2. Incubare a 37 ° C in un ambiente di aria 95% 5% CO₂per 8 h.
7. Rimuovere il surnatante e lavare campioni con 5 mL di PBS.
8. Aggiungere 1 mL di preparato live/dead kit (20 µ l di 2mm EthD-1 con 5 µ l di 4 mM in DMSO calceina in 10 mL di PBS) goccia a goccia alla cella.
9. Incubare a temperatura per 30-45 min o 37 ° C per 10 min. di fluorescenza misura con microscopia di fluorescenza standard a 100 X o 300 X.

6. tripan blu Assay

1. Preparare i campioni secondo passi 5.1 attraverso 5.6.2 sopra.
2. Rimuovere il surnatante.
3. Lavare la piastra con 1 mL di 1 x DPBS e decantare.
4. Aggiungere 1 mL di tripsina piastra e incubare per 3 min staccare le cellule dalla cultura. Utilizzare medium della coltura cellulare per lavare la piastra e raccogliere le cellule. Luogo raccolto le cellule in una provetta da 15 mL.
5. Centrifugare la provetta a 200 x g e a 4 ° C per 3 min.
6. Gettare il surnatante. Aggiungere 1 mL di terreno nuovo a pellet cellulare e ri-disperdere le cellule.
7. Aggiungere 10 µ l di trypan blu con 10 µ l di cellule disperse e contare le celle con una macchina automatica di conta cellulare.
   Nota: Le istruzioni per la macchina conta cellulare utilizzato sono inclusi nei riferimenti.

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Risultati

Immagini di microscopia elettronica (TEM) di trasmissione confermano la formazione di Ag-MWCNT (Figura 1A e 1B). Loro successo sintesi è stata confermata dal cambiamento in carica superficiale. È stata calcolata la dimensione delle particelle Ag depositato sul MWCNT (Figura 1). La dimensione media delle particelle era approssimativamente 3,83 nm. Il modello XRD di come sintetizzato Ag-MWCNT è illustrato nella...

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Discussione

Qui, segnaliamo un metodo semplice per la preparazione di MWCNT con nanoparticelle di Ag depositate. Questo nanomateriale contenenti argento dimostra notevole attività antibatterica e minimo potenziale di assorbimento incontrollato delle nanoparticelle d'argento nel corpo. Dimostriamo che 30 µ g/mL di sintetizzato Ag-MWCNT è un efficace livello di attività antibatterica contro le speci Methylobacterium con trascurabile citotossicità per le cellule di fegato dei mammiferi. Anche se ulteriori miglioramenti e ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 N silver nitrate	SIGMA-ALDRICH	1090811000
Carbon nanotube, multi-walled	Tokyo Chemical Industry Co., LTD	308068-56-6
R2A agar	MBcell	MB-R1129
R2A broth	MBcell	MB-R2230
Methylobacterium spp.	KCTC	12618	from Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cell imaging Kit	ThermoFisher SCIENTIFIC	R37601
AML12			from Chungnam University, Dajeon, Korea
human PBMC	ATCC	PCS-800-011
TEM	JEOL	JEM-2100F
XRD	Rigaku	D/MAX 2500	Cu K photon source (40kV, 100mA)
JuLI Br	NanoEnTek	JULI-BRSC