Rapida In Vivo valutazione della funzionalità di generazione i linfociti T citotossici di adiuvante per lo sviluppo di vaccini

Riepilogo

Qui presentiamo un'applicazione per una tecnica immunologica standard (CFSE macchiato OT-ho proliferazione) destinato a monitorare rapidamente adiuvante-mediata di linfociti T citotossici (CTL) generazione in vivo. Questa veloce stima delle capacità CTL è utile per lo sviluppo di vaccini profilattici contro patogeni intracellulari, come pure i vaccini terapeutici del cancro.

Abstract

La valutazione dei vaccini moderni sottounità rivela che la generazione di anticorpi neutralizzanti è importante ma non sufficiente per la selezione di adiuvante. Di conseguenza, adiuvanti con capacità immuno-stimolante sia umorali e cellulari che sono in grado di promuovere le risposte citotossiche (CTL) di linfociti di T sono urgentemente necessari. Quindi, monitoraggio fedele dei candidati adiuvante che inducono cross-priming e successivamente migliorano CTL generazione rappresenta un passo cruciale nello sviluppo del vaccino. Qui vi presentiamo un'applicazione per un metodo che utilizza SIINFEKL specifici (OT-ho) cellule di T per monitorare la cross-presentazione del modello antigene ovoalbumina (uova) in vivo in presenza di candidati diversi adiuvante. Questo metodo rappresenta un test rapido per selezionare adiuvanti con le migliori funzionalità di cross-priming. La proliferazione di CD8⁺ T cellule è l'indicazione più preziosa di cross-priming ed è anche considerato come un correlato di indotta da adiuvante cross-presentazione. Questa funzionalità può essere valutata in differenti organi immuni come i linfonodi e la milza. Nella misura della generazione CTL possa anche essere monitorata, dando intuizioni sulla natura di un locale (svuotamento linfonodale principalmente) o una risposta sistemica (linfonodi a distanza e/o milza). Ulteriormente questa tecnica permette modifiche multiple per testare i farmaci che possono inibire specifiche vie di cross-presentazione e offre anche la possibilità di essere utilizzato in diversi ceppi di topi convenzionali e geneticamente modificati. In sintesi, l'applicazione che vi presentiamo qui sarà utile per i laboratori di vaccino nell'industria o academia che sviluppano o modificare coadiuvanti chimici per vaccino ricerca e sviluppo.

Introduzione

Linfociti T citotossici (CTL) che inducono i vaccini sono fondamentali interventi terapeutici che sono stati sviluppati per combattere alcuni tipi di cancro¹. CTL sono anche importanti per vaccini profilattici contro patogeni intracellulari². Inoltre, CTL sono uno dei meccanismi di difesa immunitario pochi funzionalmente attivi in popolazioni a rischio come neonati^3,4 quali dipendono anche CTL per combattere infezioni di vita iniziali⁵. A questo proposito, i vaccini contro il Virus respiratorio sinciziale (RSV) che sono stati sviluppati con un adiuvante che non suscitare le risposte CTL (allume) ha provocato un completo fallimento del vaccino che porta a gravi complicazioni su infezioni in infanti⁶. Questi effetti negativi della vaccinazione possono essere invertiti da un CD8⁺ di risposta delle cellule T⁷. Precedentemente abbiamo dimostrato che le principali citochine (interferoni di tipo I) suscitate da alcuni stimolatore di agonisti di geni (STING) di interferone sono essenziali per le risposte CTL generate da questi adiuvanti⁸, in parte misurando la proliferazione delle OT-I T cellule dopo vaccinazione e utilizzando questi risultati come una misura di CTL inducendo capacità osservata in esteso vaccinazione orari⁹. La misurazione della proliferazione di OT-ho CD8⁺ T cells in un mouse di destinatario C57BL/6 wild type (WT) di tintura di carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) diluizione è una stima robusta della capacità dell'adiuvante di un vaccino per generare cross-priming di SIINFEKL, (il peptide di immuno-dominante di ovoalbumina, uova). Variazioni di questa tecnica sono ampiamente utilizzati per la valutazione della proliferazione di OT-ho CD8⁺ e OT-II CD4⁺ T cellule. Ad esempio, esso è stato utilizzato in assenza delle citochine selezionate (topi KO) o per misurare l'efficacia del vaccino dopo il richiamo dell'antigene negli animali WT. Abbiamo messo a punto un protocollo breve (4 giorni esperimento) in cui dopo il trasferimento passivo di CFSE-macchiato OT-ho CD8⁺ T cells, una sottocutanea immunizzazione (s.c.) che consiste di una dose di 50 µ g di ovuli privo di endotossina completati con adiuvanti di prova viene somministrata (Figura 1). Il follow-up dei risultati 48 h dopo la vaccinazione fornisce una prova affidabile della capacità dell'adiuvante per generare risposte CTL. Da questa strategia, è possibile valutare la potenza della risposta immunitaria locale nel linfonodo drenante dopo immunizzazione, nonché l'entità della risposta misurando l'attività CTL nella milza (o linfonodi a distanza).

Protocollo

Tutti i topi utilizzati in questo studio erano dallo sfondo C57BL/6. Tutti gli animali erano tenuti in condizioni esenti da patogeni. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo la normativa della legge tedesca di protezione animale (TierSchG BGBl. I S 1105; 25.05.1998) e sono stati approvati dal Comitato Bassa Sassonia l'etica di esperimenti di animale e l'ufficio statale (Bassa Sassonia stato ufficio della protezione dei consumatori e la sicurezza alimentare), sotto il numero di permesso 33,4-42502-04-13/1281 e 162280.

1. CFSE macchiatura di OT-I T cellule e trasferimento adottivo

Nota: OT-I topi sono animali transgenically generati che esprimono un recettore delle cellule T (TCR) con fisso α e β catene che insieme riconoscono il peptide di immuno-dominante di ovuli, SIINFEKL^10,11. Di conseguenza, questi topi hanno un numero considerevolmente elevato di CD8 specifici SIINFEKL⁺ T cellule (97%)¹² rispetto ai topi normali o OVA-vaccinati (≤ 1%)¹³.

1. Isolamento di CD8 tracciabili⁺ T cellule da OT-I topi che esprimono specifici del linfocita T Thy1^un (Thy1.1) allele:
   1. Eutanasia 6-9 settimane vecchio OT-I topi da inalazione di CO₂ seguirono da dislocazione cervicale¹⁴. Sezionare la milza e linfonodi principali (solo per coppie di inguinale, ascellare e cervicale) tagliando la pelle con forbici chirurgiche, staccando la pelle dal corpo con l'aiuto di pinze chirurgiche e forcipe e metterli in capsule di Petri (60 x 15 mm) ognuno dei quali contiene un 100 µm poro maglia Coppa per rilascio di macinazione e delle cellule del tessuto.
   2. Mantenere di Petri (ciascuno con una mesh Coppa) in 3-5 mL di terreno RPMI completo (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL penicillina, 50 µ g/mL di streptomicina) tenuta su ghiaccio.
   3. Schiacciare gli organi con l'aiuto di un stantuffo della siringa o un analogo strumento sterile (previo taglio non è necessario) e raccogliere la sospensione singola cella risultante in provette per centrifuga da 15 mL.
   4. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. Lavare le cellule in 10 mL di PBS freddo mediante centrifugazione e lisare gli eritrociti dalla milza sospendendo nuovamente il pellet in 1 mL/milza del cloruro di ammonio buffer (buffer di ACK, disponibili in commercio). Incubare le cellule per 1,5 min sul ghiaccio e successivamente lavare le cellule con 10 mL di PBS freddo mediante centrifugazione (come fatto in precedenza).
   5. Risospendere il pellet nello stesso tubo in 1 mL di PBS (pH 7,2) contenente 5% di siero bovino fetale per isolamento magnetico.
2. Per eseguire l'isolamento magnetico, procedere alla selezione negativa di CD8⁺ T cellule utilizzando un kit di isolamento magnetico secondo le istruzioni del produttore o pubblicato protocolli¹⁵.
3. Per eseguire la colorazione di CFSE, prima di contare il numero di CD8⁺ T cellule ottenute da OT-I topi utilizzando un contatore di cellule automatizzato (contatore di particelle). 1-5 di macchia x 10⁷ cellule/mL in un volume di 1-5 mL con 5 µM CFSE in PBS per 7 min a 37 ° C, al riparo dalla luce in un tubo falcon di 15 ml.
4. Placare la macchiatura CFSE aggiungendo lo stesso volume (1:1) di siero bovino fetale alle cellule e li Incubare per ulteriori 7 min a 37 ° C al riparo dalla luce. Lavare le cellule con 10 mL di PBS due volte.
5. Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Impostare il numero di cellulare da 3-5 x 10⁷ cellule/mL di PBS al fine di iniettare 3-5 x 10⁶ cellule/mouse in 100 µ l per via endovenosa (i.v.) tramite vena caudale.
6. Per eseguire iniezioni della vena della coda, immobilizzare i topi in dispositivi appropriati. Scaldare la zona posteriore e la coda dei topi da iniettare utilizzando una lampada di luce rossa, posizionata tra 20 a 25 centimetri lontano i topi per 1-3 minuti consentire la vasodilatazione della vena della coda.
   Nota: Questo consente alla facilità della vena rilevamento e all'amministrazione della sospensione delle cellule.
7. Garantire (con la mano appoggiata tra i topi e la lampada) che non è troppo caldo per i topi e quando le vene di coda sono chiaramente visibili, procedere all'iniezione. Iniettare le cellule nella vena caudale laterale o dorsale utilizzando una siringa da 1mL con un ago calibro 25¹⁶.

2. immunizzazione (Endo-libero OVA + /-adiuvante)

1. Posizionare i topi trapiantati con OT-ho cellule (passaggio 1.7, Figura 1) in una camera di anestesia e isoflurano in ossigeno per amministrare un anestesia macchina¹⁴.
2. Quando il mouse è completamente addormentato sotto anestesia, tirarla fuori dalla camera e radere il pelo del mouse sulla zona sopra gluteus superficialis (laterale bassa della schiena) utilizzando una macchina di taglio di capelli elettrico, al fine di eseguire un'iniezione pulito con una buona vista della zona di applicazione.
3. Iniettare 50 µ l del vaccino, s.c. in zona rasata utilizzando un ago di calibro 25.

3. isolamento dei linfociti e la macchiatura per analisi di citometria a flusso

1. Isolamento dei linfociti e splenocytes
   1. Eutanasia i topi vaccinati per inalazione di CO₂ seguita da dislocazione cervicale.
   2. Estrarre i linfonodi drenanti e distanti e milza e metterli in piatti separati di Petri contenente 100 µm poro maglia tazze per rilascio di macinazione e delle cellule del tessuto. Seguire i passaggi 1.1.2 attraverso 1.1.3.
   3. Decantare il supernatante dopo centrifugazione e risospendere il pellet cellulare nello stesso volume del residuo PBS (circa 100 µ l).
2. Macchiando per analisi di citometria a flusso
   1. In una provetta da 15 mL Centrifuga preparare un mix master contenenti gli anticorpi colorazione nelle concentrazioni illustrate nella tabella 1, producendo così un mix concentrato di colorazione di 2x. Preparare abbastanza volume di mix master di avere 100 µ l per campione. Mescolare le cellule e il mix master 1:1 e viene quindi incubato a 4° C per 30 min.
      Nota: Il volume finale di colorazione per campione dovrebbe essere 200 µ l (100 µ l di cella pellet + 100 µ l di mix master anticorpo).
   2. Lavare le cellule due volte mediante centrifugazione, come descritto in 1.1.3, aggiungere 10 mL di PBS, due volte.
   3. Risospendere le cellule marcate in 0,5-1 mL di PBS per acquisizione e trasferimento della sospensione per tubi cytometer di flusso. Sempre mantenere i campioni sul ghiaccio e al riparo dalla luce.

4. flusso Cytometry

1. Sempre pre-filtrare i campioni di cellule utilizzando filtri di 70-100 µm.
2. Preparare singola colorazione compensazione controlli per i fluorophores indicati nella tabella 1 (perline o celle).
   Nota: Compensazione dovrebbe essere eseguita nel citometro o analisi software^17,18,19 e applicato a tutti i campioni.
3. Seguire la strategia di gating rappresentata nella Figura 2. Brevemente, popolazioni di cancello in altezza di forward scatter vs zona di forward scatter (Figura 2A) e di nuovo a dispersione laterale ampia rispetto all'area di dispersione laterale (SSA, Figura 2B) al fine di escludere doppietti.
4. Porta la popolazione da Figura 2B tracciando BV 650 (auto-fluorescenza) vs FITC (CFSE) al fine di discriminare il vero CFSE macchiato le cellule dalle cellule auto-fluorescente alte. Sono perline o cellule colorate con anticorpo coniugato a BV 650 nei controlli di compensazione. Questa trama (Figura 2) del BV 650 vs FITC è usata per cancello l'OT-ho CFSE macchiato le cellule.
5. Al fine di distinguere le cellule derivate dal donatore vs topi destinatari del cancello la popolazione da Figura 2 C per Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8).
   Nota: Le cellule derivate da OT-I topi del donatore sono Thy1.1⁺ (CD90.1), mentre le cellule derivate da topi (C57BL/6, destinatario) WT sono Thy 1.2⁺ (CD90.2) (Figura 2D). Alcuni laboratori hanno OT-I topi in uno sfondo di Thy 1.2 e WT (C57BL/6) in un Thy1.1. In questo caso è necessario usare un anticorpo contro Thy 1.2 per OT-I cellulare gating.
6. Ri-cancello CD8 cellule di⁺ da Thy1.1⁺ popolazione tracciando su un cancello composto da 450 BV (CD4) vs APC (CD8) (Figura 2E).
7. Visualizzare la popolazione gated in Figura 2E utilizzando una visualizzazione dell'istogramma del CD8⁺ cellule che mostrano CFSE (FITC, 530/15 canale - laser blu-), cancello la popolazione proliferata includendo intensità da 10² fino al livello dove le popolazioni di controllo indivisa sono (intensità ~ 10⁵, a seconda l'efficacia di CFSE colorazione e l'impostazione della tensione sul citofluorimetro) (Figura 2F).
8. Fare un ulteriore cancello (non visibile in figura 2) tracciato marcatore FITC vs L/D (450/20 canale, UV laser) al fine di valutare le cellule morte in parallelo alla valutazione di proliferazione.
9. Acquisire almeno 5000 eventi per i controlli di compensazione e 10,000 eventi (cancello E, Figura 2) dai campioni presso un citometro a flusso. Eseguire il citometro a flusso di basso o medio (non superare le portate di 20.000 eventi/s).

Risultati

Al fine di testare i trattamenti utilizzando una diversa combinazione di adiuvanti (ADJ1 e ADJ2), abbiamo valutato la capacità di generazione di CTL misurando la proliferazione di passivamente trasferiti OT-ho CD8⁺ T cellule mediante citometria a flusso (Figura 2). Per questo, abbiamo precedentemente macchiato le cellule isolate dal drenante nei linfonodi e milza (tabella 1). Misurando la proliferazione di CD8⁺ T cellul...

Discussione

Moderni vaccini sono idealmente ospita l'antigene purificato e adiuvanti, con l'eventuale aggiunta di un sistema di consegna come liposomi, particelle virus-like, nanoparticelle o vettori dal vivo. Un aspetto fondamentale durante la progettazione di un vaccino è quello di scegliere il giusto adiuvante secondo le necessità cliniche. Parte dell'ambito potrebbe coinvolgere favorendo un umorale vs risposta immunitaria cellulare (o entrambi), l'elezione di un locale vs una risposta immunitaria sistemica (o entrambi) e il ti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer	BD	Special Order	Flow Cytometer
CFSE	Molecular Probes	C34554	Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit	Biolegend	480007	Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Molecular Probes	L23105	Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7	eBioscience	25-0900-82	antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody	BioLegend	100712	antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4	BD	740007	antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer	Beckman Coulter	9914591DA	Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg)	Hyglos(Germany)	321000	Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon	Corning	352360	Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials	Beckman Coulter	899366014	Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2)	Harlan (Rossdorf, Germany)		Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)	Harlan (Rossdorf, Germany)		Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes	Fischer (Corning)	14-959-5	Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes	Fischer (Corning)	05-527-90	Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL)	Fischer (Gibco)	20-012-027	Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp)	Dirk Rossmann GmbH (Germany)	405096	Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane)	Abbott Laboratories (USA)	5260.04-05.	Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber	Parkland Scientific	V3000PK	Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium	Gibco (distributed by ThermoFischer)	11-875-093	Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	15-140-148	Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	10082147	Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml)	Gibco (distributed by ThermoFischer)	A1049201	Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes	Nunc (distributed by ThermoFischer)	150340	60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter	CellTrics (Sysmex)	04-004-2317	CellTrics® 50 μm, sterile