Valutazione Lysosomal alcalinizzazione l' intestino di Live Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Una guida dettagliata per sondare la perdita di acidità lysosomal nell'intestino di c. elegans usando il colorante vitale sensibili al pH 6 - carboxy - 2', 7'-diclorofluoresceina diacetato (cDCFDA)

Abstract

Il nematode Caenorhabditis elegans (c. elegans) è un sistema di modello che è ampiamente usato per studiare la longevità e le vie dello sviluppo. Tali studi sono facilitati dalla trasparenza dell'animale, la capacità di avanti e indietro le analisi genetiche, la relativa facilità di generare proteine fluorescente contrassegnati e l'uso di coloranti fluorescenti che possono sia essere microiniettati in anticipo embrione o incorporati in suo cibo (e. coli ceppo OP50) per etichettare gli organelli cellulari (ad es. 9-diethylamino-5h-benzo (a) phenoxazine-5-one e (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Qui, presentiamo l'uso di un colorante fluorescente pH sensibili che macchie intestinali lisosomi, fornendo una lettura visiva dei cambiamenti dinamici, fisiologici acidità lisosomiale in vermi vivi. Questo protocollo non misurare pH lisosomiale, ma piuttosto mira a stabilire un metodo affidabile di valutazione fisiologiche varianti pertinenti lysosomal acidità. cDCFDA è un cellulare-permeante composto che viene convertito il fluoroforo fluorescente 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) su idrolisi dalle esterasi intracellulari. Protonazione all'interno dei lisosomi trappole cDCF in questi organelli, dove si accumula. A causa del suo basso pKa di 4.8, questo colorante è stato utilizzato come un sensore di pH in lievito. Qui descriviamo l'uso di cDCFDA come integratore alimentare per valutare l'acidità dei lisosomi intestinali in elegans del c. Questa tecnica consente il rilevamento dei lisosomi alcalinizzante in animali vivi, e ha una vasta gamma di applicazioni sperimentali tra cui studi sull'invecchiamento, autophagy e biogenesi lisosomiale.

Introduzione

L'aspetto di aggregati proteici ampiamente è accettato per essere un marchio di garanzia di invecchiamento in cellule eucariotiche^1,2,3e la formazione di cui è pensato per essere tra i piloti di principio di senescenza cellulare^{4 , 5 , 6 , 7}. sta coltivando la prova che come cellule età, catabolismo proteico è alterato, portando ad un aumento di aggregazione proteica. Il crollo di proteolisi in cellule di invecchiamento comporta un danno dell'autofagia⁸ , così come di degradazione proteasome-mediata della proteina⁹. Infine, ossidazione irreversibile della proteina è aumentata in cellule vecchie, compromettendo ulteriormente proteina catabolismo¹⁰.

L'autofagia è stato inizialmente pensato per essere un processo non-selettivi per la degradazione della massa di proteine danneggiate, ma recenti studi hanno indicato che l'autofagia è altamente selettivo per il catabolismo di aggregati di proteine e organelli disfunzionali che non sono suscettibili di degradazione tramite altri meccanismi di clearance proteina¹¹. Durante il processo di autofagia, proteine danneggiate e aggregate sono sequestrate in una vescicola di doppia membrana chiamata autofagosoma. Quindi questo autofagosoma si fonde con gli acidi organelli chiamati lisosomi, che porta alla degradazione dell'autofagosoma carico¹². I lisosomi rappresentano il punto finale del pathway autofagico e partecipano a diversi processi cellulari come la riparazione della membrana, controllo trascrizionale e rilevamento dei nutrienti; evidenziando il loro ruolo centralizzato nell'omeostasi cellulare (rivisto in rif. 13). Parecchi studi hanno indicato un'associazione tra una diminuzione età-dipendente nella funzione lisosomiale e vari disordini di neurodegenerative¹³. Coerentemente, ristabilimento della funzione lysosomal in cellule anziani può ritardare l'insorgenza di relazione con l'invecchiamento fenotipi^14,15. Gli studi della composizione del milieu mancata suggeriscono che il collasso della funzione lysosomal in cellule anziani non è a causa di una riduzione della produzione di proteasi lisosomiali¹⁶. In alternativa, è stato proposto che perdita di acidità intralysosomal, un requisito fondamentale della sua attività enzimatica, può essere alla base il calo di proteolisi lisosoma-mediata¹⁷. Per essere in grado di esplorare questa ipotesi, è essenziale sviluppare reagenti e protocolli per sondare i cambiamenti dinamici nel pH lisosomiale in cellule vive in maniera coerenza e replicabile.

L'intestino di c. elegans è il tessuto metabolico principale in viti senza fine ed è un regolatore critico dell'omeostasi sistemica e durata della vita. Abbiamo sviluppato saggi per valutare i cambiamenti dell'acidità del lume intestinali lisosomi di vermi per determinare come lisosoma-mediata proteolisi contribuisce all'invecchiamento. Anche se fluorofori pH sensibili sono stati usati precedentemente in c. elegans per contrassegnare i lisosomi intestinali, ci non è stato ancora uno sforzo per stabilire un protocollo di successo in grado di rilevare piccoli aumenti in pH lisosomiale in vivo¹⁸. Qui, forniamo un protocollo che può essere utilizzato per rilevare la perdita di acidità lisosomiale nelle cellule intestinali di c. elegans utilizzando un protocollo di alimentazione semplice e conveniente che incorpora un fluoroforo pH sensibili (cDCFDA) in OP50 cibo.

Protocollo

1. coloranti e lisosomi intestinali di immagine

1. Piastre di coltura seme del nematode (NGM) con OP50
   1. Preparare piatti NGM secondo il protocollo raccomandato¹⁹ e lasciate asciugare per 2 giorni a temperatura ambiente le piastre chiuse.
   2. Inoculare i batteri OP50 in brodo di Luria brodo (LB) sterile e crescere in un'agitazione incubatore o bagnomaria a 37 ° C per 36 h o fino a quando il diametro esterno è compresa tra 0,2 e 0,4. Evitare l'uso di una coltura batterica con OD > 1 o OD < 0.2.
   3. Una volta piastre NGM sono asciutti, depositare una goccia (~ 30 µ l) di inoculo OP50 sul centro del piatto e quindi diffondere la goccia in una patch di circa 2 cm x 2 cm nel formato.
      Nota: Qualsiasi inoculo OP50 rimanente sono memorizzabili a 4 ° C per fino a un mese.
   4. Capovolgere le piastre OP50 quando l'inoculo si è asciugato (circa 10 o 15 min) e poi incubare le piastre a 37 ° C per 36 h.
   5. Dopo 36H, rimuovere le piastre dall'incubatore e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo successivo.
      Nota: Le piastre dovrebbero essere buone per fino a 1 mese a 4 ° C.
2. CDCFDA complemento per OP50
   1. Per integrare la cDCFDA sulle piastre OP50, preparare un brodo di lavoro di 10 mM cDCFDA in dimetilsolfossido (DMSO). Mantenere la soluzione di cDCFDA protette dalla luce e conservare a-20 ° C per un uso successivo.
   2. Posizionare delicatamente il 100 µ l di soluzione di cDCFDA di 10 mM sulla superficie del cerotto OP50 2 cm x 2 cm, tale che l'intero patch è uniformemente coperto con cDCFDA.
      Nota: È molto importante che l'intero patch di OP50 è coperto con cDCFDA. Se necessario, è possibile utilizzare fino a 150 µ l di cDCFDA per ogni piatto. Inoltre è indispensabile che la soluzione di cDCFDA non si estende oltre i bordi della patch OP50, poiché qualsiasi cDCFDA che scorre fuori la patch OP50 non verrà incorporata nell'alimento e si tradurrà in ridotta intensità di colorazione.
   3. Posizionare le piastre di OP50 in una casella scura sulla parte superiore del banco, fino a quando tutta la soluzione cDCFDA è assorbito nella patch batterica (solitamente circa 25-30 min).
3. Macchiatura worm utilizzando cDCFDA
   1. Una volta che il cDCFDA ha completamente permeato la patch OP50, inserire non più di 20 vermi per piastra e incubare le piastre invertite a 20 ° C per un minimo di 14 h.
      Nota: Si consiglia di posizionare le piastre di cDCFDA in una scatola opaca per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.
   2. Per controllare le differenze di assunzione tra esperimenti e per normalizzare i segnali cDCFDA, co-macchia con 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato) ((consigliato) difluoro) boro (2,5 µ l di una soluzione preparata 1 mM), un colorante di ammina debole acidotropic cui fluorescenza è in gran parte non di tipo variant su tutto lo spettro di pH acido (Vedi Tabella materiali per nomi comuni dei reagenti).
      Nota: Non si colorano vermi per meno di 14 h, poiché questo può fornire cDCFDA insufficiente intensità di colorazione e dare una falsa interpretazione del pH lisosomiale.
4. Preparare vetrini per microscopia
   1. Posizionare due strisce parallele di etichettatura nastro circa 3 pollici di distanza su una superficie liscia e piana, ad esempio uno specchio (Figura 1).
   2. Rivestire la superficie dello specchio con spray idrorepellente e asciugare il liquido in eccesso.
   3. Sciogliere agarosio al 2% (disciolto in acqua distillata H₂O) in un forno a microonde fino a quando completamente liquefatto, poi mettere una goccia di 50 µ l di agarosio tra le due strisce di nastro adesivo e rapidamente coprire la goccia con un vetrino da microscopio, tale che il vetrino sia perpendicolare alle strisce di nastro. Dopo l'agarosio è solidificato, formando un pad circolare sotto la diapositiva, capovolgere la diapositiva e aggiungere 10-15 µ l di 5mM sodio azide (NaN₃) sul blocchetto di agarosio.
      Nota: NaN₃ è un inibitore del citocromo C che, se usato in concentrazioni basse, reversibilmente anestetizza vermi affinché essi non si sposti durante la formazione immagine.
   4. Prendono i vermi dalla piastra OP50 completati con cDCFDA e trasferirli in un piatto pulito di NGM senza qualsiasi OP50. Consentire i vermi di muoversi per alcuni secondi per consentire la maggior parte della OP50 per essere rimosso dalla superficie dei vermi e quindi trasferire i vermi per il pad di agarosio contenente 5 mM sodio azide.
   5. Coprire immediatamente il pad di agarosio con un vetrino coprioggetto. Assicurarsi di posizionare delicatamente il vetrino coprioggetto senza esercitare troppa pressione, poiché questo può provocare vermi scoppiando.
      Nota: I batteri OP50 completati con cDCFDA reagiscono in quando visualizzate da microscopia, quindi è importante pulire i vermi come miglior possibile prima della loro immissione sul pad di agarosio contenente sodio azide. Se durante la preparazione più di 6 ceppi di c. elegans (tra cui N2, controllo di tipo selvaggio), si consiglia di preparare i campioni in lotti di 6, in modo da garantire che i vermi non asciugarsi sul pad di agarosio. In alcuni ceppi, vulva inizia a rompersi dopo lunghi periodi di tempo a causa della pressione dal vetrino coprioggetto, quindi è importante pianificare di conseguenza.
5. Microscopia confocale
   Nota: Alcuni microscopi hanno una funzionalità incorporata che aumenta automaticamente l'intensità di fluorescenza per compensare i livelli variabili di fluorescenza. Tali microscopi non potrebbero funzionare bene per vermi macchiati con cDCFDA, in quanto intrinsecamente aumentano l'intensità della fluorescenza di campioni di imaging.
   1. Eseguire imaging su un microscopio confocale standard utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione impostata su 488/530 nm per cDCFDA. Prendere le immagini su un unico piano (non Z-stack) dei lisosomi intestinali e utilizzare solo i lisosomi che sono a fuoco (intensità di segnale massima) per la quantificazione di intensità.
      Nota: Forse a causa delle differenze nella disponibilità di tintura, i lisosomi delle cellule intestinali direttamente posteriore alla faringe mantengono cDCFDA intensità indipendentemente dal genotipo o età di colorazione, quindi cura deve essere preso per evitare i lisosomi in queste cellule di imaging.
   2. La diapositiva contenente 2 giorno vecchio selvaggio tipo che N2 worm prima della battuta. Mentre così facendo, regolare i parametri di imaging confocale come potenza laser, pinhole e aperture per garantire che l'intensità di colorazione di cDCFDA non è troppo saturi.
      Nota: Una volta impostate, queste impostazioni non modificarle per tutta la durata dell'imaging per quel giorno.
   3. Catturare immagini a 1024 x 1024 pixel di un unico piano dell'intestino (3 o 4 immagini al verme) utilizzando una lente di ingrandimento di 60x.
      Nota: Lo spettro di emissione di cDCFDA a worms produrrà un singolo picco prominente a 520 nm in coincidenza con i suoi segnalati fluorescenza spettro²⁰, fornendo una lettura segnale specifico che è distinta da autofluorescence intestinale (Figura 3).
   4. Esportare immagini confocal raw (file .lsm) come file TIFF per ogni canale.
   5. Quindi, aprire ImageJ e fare clic sul File | Aprire per aprire il file di immagine da quantificare. Una volta che l'immagine viene caricata, è possibile utilizzare lo strumento di selezione di forma ovale in ImageJ per selezionare una regione di interesse (ROI).
   6. Successivamente, fare clic su Analyze | Misura per quantificare l'intensità di fluorescenza per quel ROI. Selezionare 4 – 5 diversi lisosomi di messa a fuoco per ogni immagine e calcolare l'intensità di fluorescenza relativa media di ogni area di interesse (ROI).
   7. Per ogni immagine, misurare l'intensità di fluorescenza di fondo in una regione dell'intestino tra i lisosomi. Sottrarre i valori di intensità di fluorescenza di fondo dai valori di intensità di fluorescenza lisosomiale.
   8. In totale, raccogliere circa 30 a 50 singoli valori normalizzati per cDCFDA intensità (6-10 animali) per ogni sforzo in fase di test. Utilizzare questi valori per tracciare una casella e Baffo trama utilizzando qualsiasi software statistico appropriato.
      Nota: Colorazione può variare notevolmente a seconda di fattori come temperatura, tempo di incubazione e la salute/età complessiva degli animali tale che sono rilevanti all'interno del processo di campioni nello stesso esperimento colorazione solo i confronti di intensità di fluorescenza. Pertanto è importante elaborare controlli in ogni esperimento di colorazione. Calcolare le differenze statistiche (t-test) utilizzando qualsiasi software statistico appropriato.
   9. Immagine tutti i ceppi dallo stesso esperimento (macchiato lo stesso giorno) in sequenza, facendo attenzione a non per modificare i parametri di imaging.

Risultati

cDCFDA macchie lysosomes in maniera dipendente dal pH, e il suo basso pKa e pronto assorbimento lisosomi rende un sensore di pH ideale²¹. cDCFDA intensità di colorazione è inversamente proporzionale al pH lisosomiale (cioè colorazione intensità aumenta con il diminuire del pH)^18,22. cDCFDA segnali sono costantemente deboli nei lisosomi di animali trattati con clorochina, un inibitore dell'acidi...

Discussione

Una varietà di eventi cellulari e molecolari contribuiscono all'invecchiamento, influenzato da tratti di storia di vita e fattori genetici. Nostro recente studio²² suggerisce che il ciclo riproduttivo svolge un ruolo importante nel controllare l'idoneità del soma attraverso la regolazione della dinamica di pH lisosomiale. Abbiamo mostrato che proteolisi lisosomiale-mediata sono promosso mentre gli animali si riproducono attivamente dal upregulation della trascrizione del v-atpasi, che a sua volt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
OP50 (E. coli)	Caenorhabditis Genetics Center		Order online at https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetate	ThermoFisher	C369	Commonly known as cDCFDA
9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron	ThermoFisher	L7528	Commonly known as Lysotracker Red
Confocal microscope (e.g. Zeiss LSM 510)
ImageJ			Download for free from https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB Broth powder	ThermoFisher	22700041
Bacto Agar	Sigma	A5306-1KG
NaCl	Sigma	S9888
Bacto Peptone	Fisher Scientific	S71604
Cholesterol powder	Sigma	C3045
CaCl2	Sigma	449709
MgSO4	Sigma	M7506
K3PO4	Sigma	P5629
Sodium Azide	Sigma	S2002
DMSO	Sigma	D8418
Microscope Slides	VWR	48311-703
Cover Slips	ThermoFisher	3406
Agarose	Sigma	A6013
Incubator
Mirror or other smooth flat surface