Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti

Riepilogo

Attraverso un'ampia varietà di indicazioni di malattia, modelli più fisiologicamente rilevanti sono in corso programmi di scoperta della droga sviluppata e implementata in. Il nuovo modello di sistema descritto qui di seguito viene illustrato come tridimensionale del tumore sferoidi possono essere coltivate e proiettati in un sistema basato su piastra 1536 pozzetti ad alta produttività per la ricerca di nuovi farmaci oncologici.

Abstract

Le cellule tumorali hanno state coltivate ordinariamente in due dimensioni (2D) su una superficie di plastica. Questa tecnica, tuttavia, manca il vero ambiente un tumore massa è esposto a in vivo. Tumori solidi non come un foglio allegato al plastica crescono, ma invece come un insieme di cellule clonali in un tridimensionale (3D) spazio interagendo con i loro vicini e con proprietà distinte spaziali quali la rottura della polarità cellulare normale. Queste interazioni inducono le cellule coltivate in 3D di acquisire caratteristiche morfologiche e cellulari che sono più rilevanti per i tumori in vivo . Inoltre, un tumore massa è a diretto contatto con altri tipi cellulari come cellule stromale ed immuni, come pure la matrice extracellulare da tutti gli altri tipi di cella. La matrice depositata è composto da macromolecole come collagene e fibronectina.

Nel tentativo di aumentare la traduzione dei risultati della ricerca in oncologia dal banco al capezzale, molti gruppi hanno iniziato a studiare l'uso di sistemi di modello 3D nelle loro strategie di sviluppo della droga. Questi sistemi sono pensati per essere più fisiologicamente rilevanti perché tentano di ricapitolare l'ambiente complesso ed eterogeneo di un tumore. Questi sistemi, tuttavia, possono essere molto complessi, e, anche se suscettibili di crescita a 96 pozzetti formati e alcuni ora anche nel 384, che offrono alcune scelte per la crescita su larga scala e lo screening. Questo osservato gap ha portato allo sviluppo dei metodi descritti qui in dettaglio per cultura tumore sferoidi in una capacità di alto-rendimento in 1536 pozzetti. Questi metodi rappresentano un compromesso ai sistemi basati su matrice altamente complessi, che sono difficili da schermo e le analisi 2D convenzionale. Una varietà di linee cellulari del cancro che harboring le mutazioni genetiche differenti vengono proiettati con successo, esaminando l'efficacia composto utilizzando una libreria a cura di composti targeting pathway della chinasi di proteina mitogen o MAPK. Le risposte di cultura sferoide sono quindi confrontate con la risposta delle cellule coltivate in 2D, e attività differenziale sono segnalati. Questi metodi forniscono un protocollo unico per il test composto attività in un ambiente 3D di alto-rendimento.

Introduzione

Nell'ultimo decennio, sempre più studi hanno implementato l'utilizzo di modelli di coltura cellulare 3D a capire concetti che non sono completamente ricapitolati coltivando cellule in 2D su plastica. Esempi di questi concetti includono le alternanze in normale delle cellule epiteliali polarit๠dove vengono perse l'orientamento spaziale degli strati apicali e basali delle cellule, come pure il ruolo della matrice extracellulare nella regolazione della sopravvivenza e il destino della cellula. Ricerca oncologica, in particolare, ha utilizzato modelli 3D per capire la biologia delle cellule tumorali e le differenze tra 2D e 3D cell culture sistemi^3,4. Lo sviluppo delle più sofisticate tecniche di coltura cellulare e loro ulteriore adattamento a formati multi-pozzetto ha permesso la ricerca di nuovi farmaci in impostazioni 3D. Contrariamente alle cellule coltivate in condizioni 2D, modelli 3D di fascia di tumori nella complessità da sistemi cellulari stratificati⁵ per singolo-cellula-tipo sfere di diverse dimensioni, a complessi multi-cell-tipo sfere^{6,7, 8}. la scoperta di nuovi composti o biologics che potente inducono la morte delle cellule in questi sistemi di modello 3D è, pertanto, di grande interesse in campagne di sviluppo della droga. Endpoint di queste analisi sono spesso identiche a quelle eseguite in 2D culture per valutare i cambiamenti nella proliferazione delle cellule, ma quando condotto in un ambiente più fisiologicamente rilevante, possono rivelare il vero livello di dipendenza del gene bersaglio o via essendo interrogato.

Come introdotto sopra, una varietà di sistemi di modello sono stati sviluppati per lo studio delle risposte farmacologiche in sistemi di coltura 3D, ma la maggior parte utilizza entrambi piastre di microtitolazione 96 o 384 pozzetti e non è facilmente adattabile ai formati high throughput screening (HTS) spesso usati in campagne di screening scoperta della droga. Tali sistemi prevedono l'utilizzo di tecnologie di goccia, culture sferoide, palpitazione cellule con particelle magnetiche per indurre la levitazione e culture che incorporano gel naturali o sintetici, quali collagene, Matrigel o polietilenglicole (PEG)^{2 per appendere} . Qui, presentiamo i metodi dettagliati di una tecnica precedentemente sviluppata per produrre colture di sferoide 3D da linee cellulari di cancro stabilito in un formato di 1536 pozzetti. In questo protocollo, viene utilizzato un mezzo altamente definito che impedisce l'attacco di cellulari normalmente aderenti linee⁹. Questo sistema presenta limitazioni (vale a dire, essa non può ricapitolare completamente un sistema complesso modello di cancro), ma ciò nonostante, queste analisi permettono uno screening ad alta resa di grandi collezioni di piccole molecole e traverso comparazioni di risposta ai farmaci tra 2D e 3D culture contro una varietà di linee cellulari e composti.

Le linee cellulari selezionati per illustrare i metodi in questo articolo tutte le porto mutazioni in geni correlati per il via, una via che è altamente dysregulated in cancro, di segnalazione MAPK e per cui molte terapie sono disponibili. Molte delle linee hanno attivazione mutazioni oncogeniche in Kirsten Rat Sarcoma virus indicato anche come KRAS, il RAS di Neuroblastoma o ANR, oncogene del virus Harvey Rat Sarcoma o HRA e le chinasi associate rapidamente accelerato Fibrosarcomas, conosciuto anche come RAFs. Letteratura recente suggerisce che gli inibitori di diversi nodi di questa via sono univocamente più efficaci in un sottoinsieme delle linee cellulari quando coltivate in condizioni 3D^9,10. Uno studio ha trovato che quando le cellule tumorali con RAS attivo sono state coltivate in 3D, ha dimostrato una maggiore sensibilità agli inibitori MAPK e inoltre, che questo approccio potrebbe identificare vie e inibitori che potrebbero essere perso in 2D tradizionale e mirata l'impostazione. L'obiettivo di questo studio è di presentare i metodi utilizzati per la coltura di queste linee cellulari, e ulteriormente, per dimostrare il differenziale risposte a questi inibitori che possono essere osservati solo quando si utilizza 3D delle cellule sistemi di coltura.

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Protocollo

1. coltura di sferoidi tumore 1536 pozzetti 3D

1. Preparare un gambo fresco 3D tumore sferoide media (medium cellulare + sostituzione del siero knockout + insulina-transferrina-selenio) aggiungendo i seguenti reagenti a 500 mL di mezzo di aquile per volta di Dulbecco (DMEM/F12): 1 x penicillina/streptomicina, 10 ng/mL di umani fattore di crescita di base del fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL di umano fattore di crescita epidermico (EGF), 0,4% albumina di siero bovino (BSA) (frazione V), 1 x insulina-transferrina-selenio e sostituzione del siero 1% knockout (KO) (non gelività).
2. Filtro-sterilizzare l'intero mezzo con i supplementi attraverso un sistema di filtro bottiglia-top 0,4 µm.
3. Scollegare le linee cellulari di cancro, che sono in crescita in base alle condizioni di coltura sistematica consigliati, dai palloni coltura cellulare tradizionale lavandole 3x con fosfato 1x tampone salino (PBS) e aggiungendo una quantità appropriata di 0,25% tripsina (1 mL a 5 cm²) per 5 min creare uno strato sottile sulle celle. Neutralizzare la tripsina con 5 volte l'importo del mezzo che contiene il siero e procedere per contare le celle. Ad esempio, è possibile utilizzare 25 mL di terreno per 5 mL di tripsina.
4. Regolare la concentrazione della soluzione cella a 62,5 x 10⁴ cellule/mL per un totale di 500 cellule per pozzetto in 8 µ l di terreno di sferoide di semi nelle piastre 1536 pozzetti tessuto-cultura-trattati.
5. In una cappa di sicurezza biologica, seme le celle utilizzando una cassetta con punta in acciaio inossidabile sterilizzata, piccola con un sistema basato su pompa peristaltica. Tra diverse linee cellulari, svuotare il tubo della cassetta con 1x PBS e 70% etanolo per 10 s.
6. In alternativa, seme le celle utilizzando un gestore di liquido che si trova all'interno di una camera HEPA-filtrati utilizzando una cassetta con punta in acciaio inossidabile sterilizzata, piccola e una pompa peristaltica o una pompa siringa collegata, a seconda del numero di piastre per cella riga necessaria.
7. Sigillare le piastre utilizzando una guarnizione targhetta adesiva traspirante sia manualmente o utilizzando un foglio sigillante.
8. Posizionare le piastre in un'incubatrice di filatura fissato a 10 giri/min e 37 ° C con 5% di anidride carbonica (CO₂) e 95% di umidità relativa. Consentire gli sferoidi al form per 3 d.

2. coltura delle linee 2D 1536 pozzetti del cancro

Nota: Le linee di cancro 2D 1536 pozzetti devono essere coltivate 24 h prima dell'aggiunta del composto per le piastre 3D.

1. Preparare un supporto di cellule di cancro 2D aggiungendo i seguenti reagenti a 500 mL di un mezzo di crescita appropriata per le righe selezionate: 1x penicillina/streptomicina e 10% siero bovino fetale (FBS).
2. Filtro-sterilizzare l'intero mezzo con i supplementi attraverso un sistema di filtro bottiglia-top 0,4 µm.
3. Scollegare le linee cellulari di cancro, che sono in crescita in base alle condizioni di coltura sistematica consigliati, dai palloni coltura cellulare tradizionale lavandole 3x con 1x PBS e aggiungendo una quantità appropriata di 0,25% tripsina (1 mL / 5cm²) per 5 min per creare uno strato sottile sulle celle. Neutralizzare la tripsina con 5 volte l'importo del mezzo che contiene il siero e procedere per contare le celle. Ad esempio, è possibile utilizzare 25 mL di terreno per 5 mL di tripsina.
4. Regolare la concentrazione della soluzione cella a 62,5 x 10⁴ cellule/mL per un totale di 500 cellule per pozzetto in 8 µ l di terreno completo di semi in tessuto-cultura-trattati in 1536 pozzetti.
5. In una cappa di sicurezza biologica, seme le celle utilizzando una cassetta con punta in acciaio inossidabile sterilizzata, piccola con un sistema basato su pompa peristaltica. Tra le diverse linee cellulari, svuotare il tubo della cassetta con 1x PBS sterile e 70% etanolo per 10 s.
6. In alternativa, seme le celle utilizzando un gestore di liquido che si trova all'interno di una camera di robotica filtrata HEPA utilizzando una cassetta con punta in acciaio inossidabile sterilizzata, piccola e una pompa peristaltica o la pompa siringa collegata, a seconda del volume delle piastre per cella linea necessari.
7. Sigillare le piastre utilizzando una guarnizione targhetta adesiva traspirante sia manualmente o utilizzando un foglio sigillante.
8. Posizionare le piastre in un'incubatrice di filatura fissato a 10 giri/min e 37 ° C per 24 h prima dell'aggiunta di composto, con 5% CO_2% e 95% di umidità relativa.

3. aggiunta di composti

1. Preparare diluizioni di 8 punti, 3 volte seriale degli inibitori MAPK in 100% dimetilsolfossido (DMSO) su un robot di movimentazione di liquidi con una concentrazione superiore a 10 mM. L'inibitore del proteasoma Bortezomib viene utilizzato come controllo positivo per una cella completa uccidendo per determinare la gamma dinamica del dosaggio.
2. Rapido-spin tutti analisi di piastre e composto a 100 x g per raccogliere eventuali fenomeni di condensa. Rimuovere il sigillo adesivo da ogni piatto e mettere un piatto su un assetto acustico erogatore per aggiungere un totale di 8 nL di ogni composto/diluizione che rappresenta una concentrazione finale di 0,1% DMSO per pozzetto e una dose superiore composta di 10 µM.
3. Una volta completata l'aggiunta del composto, mettere un coperchio di cultura cellulare su misura, in acciaio inox che impedisce l'evaporazione sulla piastra e posizionare la piastra in un incubatore di filatura a 37 ° C per 5 d, con 5% CO_2% e 95% di umidità relativa.

4. aggiunta dei reagenti rilevamento e l'acquisizione dei dati grezzi

1. Pre-riscaldare un volume adeguato di un reagente di lisi delle cellule contenenti luciferina per rilevare variazioni di trifosfato (ATP) di adenina e, quindi, variazioni nella proliferazione delle cellule a temperatura ambiente o a bagnomaria a 37 ° C. Aggiungere un totale di 3 µ l di reagente di rivelazione ad ogni pozzetto utilizzando una pompa peristaltica e incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno 15 min.
2. Catturare la luminescenza su una piastra luminometro.

5. elaborazione dei dati

1. Estrarre i dati non elaborati dallo strumento e normalizzare tutti i campi contenenti composti di prova per la media di tutti i pozzetti contenenti DMSO da solo come il controllo del neutro. Da questo valore, è necessario calcolare l'inibizione della crescita delle percentuali di ciascun composto. Questo è completato con la funzione formula in Microsoft Excel dove f (x) = {(campione valore unità di luce relativa (RLU) / (DMSO valore RLU medio) * 100)}.
2. Generare le curve dose-risposta e IC50s inibitorio rappresentando graficamente i valori dei dati normalizzati dal passaggio 5.1 contro la concentrazione di composta utilizzando un programma di grafica.
   Nota: Abbiamo analizzato i dati utilizzando Helios, uno strumento di software NIBR interno. Per completare questa funzione, abbiamo scelto lo strumento di analisi non parametrica della curva.

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Risultati

Una varietà di cellula del cancro stabilito linee conosciute a crescere bene in condizioni di coltura 2D sono stati testati utilizzando i metodi descritti qui. Linee cellulari immagini rappresentative da una varietà di cancro mutante MAPK (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS e KNS-62:HRAS) sono visibili nella Figura 1. Queste immagini dimostrano che, anche se le linee cellulari hanno varie morfologie, ciascuno formato strutture 3D nelle piastre di d...

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Discussione

I metodi presentati qui dimostrano un protocollo dettagliato su come produrre sferoidi di tumore nel 1536 pozzetti per proiezioni su larga scala di composti. Questi metodi sono stati inizialmente adattati dal lavoro presso il National Cancer Institute dove sferoidi del tumore sono state coltivate in saggi di basso-velocità di trasmissione in 6 pozzetti e 96 pozzetti piastre per porre domande su dipendenze genetiche e sensibilità composto^{13, 14 ,}

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	ATCC	30-2006	Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12	Lonza	12-604F	Purchased as a prepared solution.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Lonza	12-115Q	Purchased as a prepared solution.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Seradigm	1500-500	Purchased as a prepared solution.
1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Hyclone	SH30042.01	Purchased as a prepared solution.
1x Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140	Purchased as a prepared solution.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)	Sigma	F0291	Resuspend in sterile water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma	E9644	Resuspend in sterile water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418	Resuspend in sterile PBS and filter.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)	Gibco	51500056
1% KnockOut (KO) Serum Replacement	Gibco	10828-028	Add fresh right before use.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	276855-100ML
CellTiter-Glo	Promega	G7573	Purchased as a prepared solution.
Consumables
Small Combi Cassette	ThermoFisher	24073295
Small Multiflow Cassette	BioTek	294085
1536-well sterile TC plates (white)	Corning	3727
1536-well sterile TC plates (black)	Corning	3893
Scivax Plates	MBL International	NCP-LH384-10
Equipment
Adhesives seals	ThermoFisher	AB0718
Spinning Incubator	LiCONiC
Stainless Steel Lids	The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic Dispensor	EDS Biosystems
Echo Acoustic Dispensor	Labcyte
Luminometer	Envision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop Combi	ThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FX	BioTek