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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Toeprinting mira a misurare la capacità in vitro di trascritti di RNA per formare complessi di inizio di traduzione con i ribosomi in una varietà di condizioni. Questo protocollo descrive un metodo per toeprinting RNA dei mammiferi e può essere usato per studiare traduzione cap-dipendente sia IRES-driven.

Abstract

L'inizio della traduzione è la tappa limitante della sintesi proteica e rappresenta un punto chiave in cui le cellule regolano la loro produzione di proteine. Regolamento della sintesi proteica è la chiave di risposta allo stress cellulare, e disregolazione è centrale rispetto a molti Stati di malattia, come il cancro. Per esempio, anche se stress cellulare porta all'inibizione della traduzione globale di attenuante inizio PAC-dipendente, determinate proteine di risposta allo stress sono selettivamente tradotto in modo indipendente dal tappo. Elementi regolatori di RNA discreti, ad esempio siti di voce cellulare ribosoma interna (IRESes), consentono per la traduzione di questi specifici mRNA. Identificazione di tali mRNA e la caratterizzazione dei loro meccanismi di regolazione, sono stati un'area chiave nella biologia molecolare. Toeprinting è un metodo per lo studio della funzione e della struttura del RNA per quanto concerne l'inizio della traduzione. L'obiettivo di toeprinting è per valutare la capacità in vitro di trascritti di RNA per formare complessi stabili con i ribosomi in una varietà di condizioni, al fine di determinare quali sequenze, elementi strutturali o accessori fattori sono coinvolti in ribosoma associazione — un pre-cursore per l'inizio della traduzione efficiente. Accanto a altre tecniche, quali analisi occidentale e polisoma profilatura, toeprinting permette per una robusta caratterizzazione dei meccanismi per la regolazione dell'inizio di traduzione.

Introduzione

Come traduzione consuma energia più cellulare, ha senso che la traduzione è strettamente regolato1. Al contrario, disregolazione della traduzione- e le conseguenti alterazioni nell'output di proteina-è spesso osservata negli Stati di risposta allo stress e malattia, ad esempio cancro1,2. Dei principali vantaggi del controllo traduzionale è la velocità con cui le cellule possono alterare la loro produzione di proteine al fine di rispondere a vari stimoli3. Regolamento di traduzione rappresenta quindi un meccanismo importante che può influenzare la sopravvivenza delle cellule e morte1,2,3. I passaggi di traduzione, l'iniziazione è la maggior parte altamente regolamentato e complesso3. Brevemente, il mRNA eucariotico più contenga un cappuccio di7G m di 5' è quasi sempre essenziale per la loro traduzione. Inizio PAC-dipendente richiede iniziazione eucariotica fattori eIF4E, eIF4A ed eIF4G (il complesso cap-riconoscimento) di interagire con l'estremità 5' del mRNA. 43S preinitiation ribosoma complesso, che contiene eIF2 associato iniziatore tRNA ed eIF3, viene reclutato all'estremità 5' del mRNA tramite un'interazione di eIF4G con eIF3. Il complesso di preinitiation è pensato per eseguire la scansione mRNA, aiutato da eIF4A (un RNA elicasi) fino a quando il codone di inizio (AUG) si trova. Successivamente si forma il complesso d'inizio 48S e tRNA viene consegnato al sito P del ribosoma. Infine, le subunità ribosomiale 60S e 40S sono unite per formare il complesso, d'inizio anni ' 80 seguito da traduzione allungamento1,3,4. Al contrario, siti di internal ribosome entry (IRESes) bypassare il requisito per un cappuccio 5' reclutando la subunità ribosomiale 40S direttamente per il codone di inizio3. Condizioni di stress fisiologico attenuano la traduzione di mRNA globale a causa di modifiche di fattori chiave di iniziazione eucariotica generale (eIFs). Tuttavia, meccanismi di iniziazione di traduzione non canonico consentono una traduzione selettiva di alcuni mRNA che codificano spesso proteine di risposta allo stress e disregolazione dell'inizio di traduzione non canonico è implicato negli Stati di malattia come il cancro 1 , 2. elementi regolatori discreti RNA, come IRESes cellulare, consentono per la traduzione di questi mRNAs2,3.

Un aspetto particolarmente interessante del controllo traduzionale è quello di comprendere i meccanismi della canonica contro traduzione non canonico di un dato mRNA. Toeprinting è una tecnica che permette lo studio meccanicistico dettagliato di inizio di traduzione di specifici RNA in vitro. L'obiettivo generale del toeprinting è quello di valutare la capacità di un RNA di interesse di nucleazione la formazione di un complesso con il ribosoma sotto una varietà di condizioni, l'inizio della traduzione al fine di determinare quali sequenze, elementi strutturali o dell'accessorio fattori sono necessari per l'inizio della traduzione efficiente. Per esempio, ribosoma assunzione potrebbe essere ostacolato in assenza di un cappuccio 5' ma stimolato dalla presenza di un IRES.

Il principio della tecnica è quello in vitro trascrivere un RNA di interesse, viene quindi incubato in presenza di estratti cellulari contenenti componenti di traduzione (o le componenti purificate) per consentire a trascrivono complessi di iniziazione per forma e per invertire il RNA con un primer specifico. Complessi RNA-ribosoma stabili causerà la trascrizione inversa di stallo all'estremità 3' del ribosoma, il cosiddetto 'toeprint'5,6,7.

In questo protocollo, le subunità ribosomali, eIFs, tRNAs e IRES trans-fattori agenti (ITAFs) sono convenientemente fornite da lysate del reticulocyte del coniglio (RRL). Un altro vantaggio di questo protocollo è l'utilizzo di un primer marcato fluorescente e imager di gel a base di fluorescenza, piuttosto che un primer radiomarcato. Questo Elimina passaggi aggiuntivi, tra cui radiolabeling il primer, come pure asciugare il gel ed esporla ad uno schermo d'intensificazione. Le bande fluorescenti sono registrate in tempo reale, durante l'esecuzione del gel, consentendo una maggiore risoluzione. Scoperchiata inibitore X-linked di apoptosi (XIAP) proteina IRES RNA viene utilizzato come esempio qui, anche se capped mRNA può essere analizzata anche da questa tecnica8.

A differenza di analisi occidentale, che misura l'output finale del processo di traduzione in lisati cellulari, toeprinting è un approccio in vitro per misurare la formazione complessa di iniziazione di traduzione su un RNA. Questo approccio riduzionista consente lo studio altamente dettagliato di substrati o fattori che regolano l'inizio della traduzione (ad es., ridotta o ONU-capped mRNA, IRES struttura, presenza o assenza di coda poli-A, fornitura di fattori proteici specifici, ecc.). Quindi, toeprinting può essere utilizzato per studiare le diverse modalità di traduzione8 o gli effetti delle strutture di mRNA, come IRESes, su proteina sintesi9,10.

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Protocollo

Nota: il RNA è altamente suscettibile alla degradazione da ribonucleasi (RNasi). Prendere precauzioni standard per mantenere intatto il RNA. Cambiare spesso i guanti. Utilizzare puntali filtrata, plasticware nucleasi-libero e privo di nucleasi prodotti chimici in tutte le fasi del protocollo. Uso della nucleasi-free o pirocarbonato dietilico (DEPC)-acqua per tutte le soluzioni trattata.

1. preparazione delle soluzioni

  1. Preparare il tampone di Toeprinting: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5% (p/v) di saccarosio, spermidina ditiotreitolo (DTT) e 0,5 mM 2 mM.
    1. Memorizzare il DTT e spermidina in monouso aliquote a-20 ° C per evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
      Nota: DTT e spermidina deve essere aggiunto al buffer toeprinting immediatamente prima dell'uso. Una soluzione manca DTT e spermidina possa essere conservata a-20 ° C.
  2. Preparare aliquote di 85 mM 5'-imidodiphosphate di guanylyl (GMP-PNP) e 91 mM l'adenosina trifosfato (ATP). Conservare le aliquote a-20 ° C.
  3. Preparare 450 mL di miscela di gel di 6% poliacrilammide - 7m urea: 67,5 mL di 40% acrylamide:bis-acrilammide (19:1), 189 g di urea, 112,5 mL di 5x TBE (Tris/borato/thylenediaminetetraacetic acido (EDTA)) e 120 mL di acqua. Sciogliere l'urea dal riscaldamento a bagnomaria a 37 ° C, o su una piastra calda con agitazione. Filtrare la soluzione (ad es., 0,2 μm filtro vuoto di nitrocellulosa).
    Nota: La soluzione può essere conservata a 4 ° C per almeno un mese.
    Attenzione: L'acrilammide monomerica è una neurotossina che può essere assorbita attraverso la pelle. Fare molta attenzione per evitare il contatto con la pelle (cioè., indossare un camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi). Poliacrilammide anche deve essere maneggiato con cura, come polimerizzazione non può procedere al 100% di completamento.
  4. Preparare la formammide tintura di caricamento: 95% formammide, 18 mM EDTA, 0.025% (p/v) sodio dodecil solfato (SDS), blu di bromofenolo 0.025% (p/v) e 0.025% (p/v) xilene cianolo. Conservare a-20 ° C.
  5. Sciogliere 1 nmol di primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' fine-etichettati con 800 IRDye) in 100 μL di acqua per una concentrazione di lavoro di 10 pmol/μL. Conservare a-20 ° C in aliquote monouso (circa 10 µ l), al riparo dalla luce.

2. preparazione del mRNA

  1. Amplificare i modelli del DNA per la sintesi di mRNA da reazione a catena della polimerasi (PCR) da modelli appropriati (cioè., il DNA genomico o il DNA del plasmide, a seconda dei casi). Utilizzare un'ad alta fedeltà della polimerasi di DNA secondo le istruzioni del produttore, con le seguenti condizioni di reazione (35 cicli): sciogliere, 98 ° C, 10 s; temprare, 53 ° C, 20 s; estendere, 72 ° C, 30 s.
    Nota: Il primer forward (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpora la sequenza del promotore T7 per consentire per la trascrizione del RNA; il primer reverse (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) comprende 51 residui di timina per fornire una coda poli-A per il RNA trascritto. Si noti che il RNA può anche essere in vitro trascritto dal DNA del plasmide.
  2. Utilizzare un kit di trascrizione appropriato per in vitro trascrivere IRES-contenente RNA o RNA ridotta dal modello del DNA. Seguire le istruzioni del produttore. Preparare il campione di RNA in volumi di reazione μL 20 standard. Trattare il nuova sintesi RNA con 2 unità di dnasi RNAsi-libera per 30 min a 37 ° C.
  3. Diluire il RNA dnasi-trattati a 110 µ l con acqua priva di nucleasi aggiungere 110 fenolo acido µ l, vortice 5 s e centrifugare per 3 min a 20.000 x g a temperatura ambiente. Rimuovere 100 µ l della fase acquosa ad un nuovo tubo microfuge 1,5 mL, aggiungere 10 µ l di acetato di sodio 3 M e vortex 2 s. Add, 3 volumi di etanolo al 100%, vortice 5 s e precipitare il RNA a-20 ° C durante la notte.
  4. Centrifugare a > 20.000 x g per 30 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Lavare la pallina con 500 µ l di etanolo al 70% (v/v) ghiacciata e ripetere la centrifugazione. Aspirare tanto del surnatante possibili e asciugare all'aria il pellet per 5-10 min. fare attenzione a non spostare la pallina.
  5. Risospendere il RNA nel volume appropriato di acqua priva di nucleasi per produrre una lavoro di concentrazione di 0,5 μg/μL. Questo può essere conservato a-80 ° C o utilizzato immediatamente.

3. Toeprinting reazione

  1. Mix 15 μL di coniglio del Reticulocyte Lysate (RRL, non nucleasi-trattati), 1 μL (40 unità) di RNAsi inibitore, 1 µ l di 91 mM ATP (1,82 mM finale) e 1 μL di 85mm GMP-PNP (1,7 mM finale) in una provetta da 1,5 mL microfuge. Incubare a 30 ° C per 5 min.
    Nota: Il RRL devono essere titolati monouso evitare congelamento-scongelamento ripetitivo. Un controllo critico è una reazione carente RRL, per delucidare le pause naturali di trascrizione d'inversione a causa della struttura secondaria del RNA. Aggiungi toeprinting buffer per sostituire RRL per questo controllo.
  2. Aggiungere 0,5 µ g (1 µ l) di RNA e incubare a 30 ° C per 5 min.
  3. Aggiungere 22 µ l di tampone di Toeprinting e incubare a 30 ° C per 3 min.
  4. Aggiungere 0,5 µ l (5 pmol) di IRDye-labeled primer e incubare in ghiaccio per 10 min.
  5. Aggiungere 2 µ l di 25 mM dNTPs (concentrazione finale: 1 mM ciascuno), 2 µ l di 100 mM Mg(OAc)2, 1 µ l di aviaria Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase (AMV-RT) e 3,5 µ l di tampone di Toeprinting. Il volume finale è 50 μL.
  6. Incubare la reazione a 30 ° C per 45 min.
  7. Aggiungere 200 µ l di acqua priva di nucleasi ed estrarre immediatamente con 250 µ l di 25:24:1 fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (pH circa 8.0). Vortice 5 s e centrifugare a 20.000 x g per 3 min a temperatura ambiente. Rimuovere la fase acquosa ad un nuovo tubo microfuge 1,5 mL, aggiungere 3 volumi di etanolo al 100%, vortice 5 s e precipitare a-20 ° C durante la notte.
  8. Centrifugare a > 20.000 x g per 30 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Lavare la pallina di DNA con 500 µ l di etanolo al 70% (v/v) ghiacciata. Centrifugare a > 20.000 x g per 15 min a 4 ° C. Aspirato tanto surnatante possibile e aria secca che il pellet per 5-10 minuti fare attenzione a non spostare la pallina.
  9. Dissolva la pallina in 6 μL di acqua esente da nucleasi e aggiungere 3 μL di formammide tintura di caricamento.

4. sequenza di reazioni

  1. Utilizzare il modello di DNA da 2.1 e il primer IRDye-etichettati dal passaggio 3.4 per reazioni di sequenziamento standard, utilizzando didesossiribonucleotidi (ddNTP) come terminatori di catena. Utilizzare un apposito kit di sequenziamento del DNA e seguire le istruzioni del produttore.
  2. Mix 6 μL di ogni reazione di sequenziamento con 3 μL di formammide tintura di caricamento.

5. preparazione del sequenziamento Gel e l'elettroforesi

Nota: Questo protocollo utilizza un imager di gel a base di fluorescenza e un 21 cm x 23 cm x gel di 0,2 mm, ma può essere adattato per altri sequencer o gel-dimensioni, se necessario.

  1. Pulire accuratamente i distanziali di 0,2 mm, nonché a breve (23 × 25 cm) e lastre di vetro a lungo (30 × 25 cm) con etanolo al 100%. Asciugare all'aria.
  2. Mix 30 mL di 6% gel di poliacrilammide - 7m urea mescolare con 200 μL di 10% (p/v) ammonio persolfato (APS) e 20 μL di tetrametiletilendiammina (TEMED). Versare il gel, avendo cura di evitare le bolle e inserire il pettine di gel di dente di squalo. Lasciare che il gel di polimerizzare per 1 h a temperatura ambiente.
  3. Montare l'apparecchiatura di sequenziamento e riempire i serbatoi con 1 x TBE.
  4. Pre-corsa per 15 min a 1500 V fino a quando non viene raggiunta la temperatura ottima di 55 ° C.
  5. Riscaldare la miscela colorante di caricamento del campione (da passaggi 3.9 o 4.2) a 85 ° C per 5 min carico 1 μL in gel di sequenziamento.
  6. Esegua il gel a 1500 V per 8 h. La macchina leggerà le bande in tempo reale.
  7. Smontare l'apparecchio e smaltire il gel dell'acrilamide e il buffer in esecuzione.

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Risultati

Precedentemente abbiamo descritto la capacità dell'IRES XIAP per sostenere l'inizio della traduzione cap-indipendente in vitro8,10. Toeprinting era la chiave tecnica per interrogare i dettagli meccanicistici del complesso d'inizio XIAP IRES. Un costrutto di DNA che codifica un mRNA contenente l'IRES XIAP (Figura 1A) era in vitro trascritto e sottoposti ad analisi di...

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Discussione

Toeprinting è una tecnica potente per misurare direttamente la capacità di un RNA di interesse per sostenere la formazione dei complessi di inizio traduzione in circostanze altamente controllate. Questo protocollo descrive una tecnica semplificata per toeprinting mammiferi RNAs. Reticolociti di coniglio lisato (RRL) viene utilizzato come una comoda fonte di ribosomi, eIFs, iniziatore tRNA e IRES trans-in qualità di fattori (ITAFs). Lo sperimentatore fornisce loro RNA di scelta e può anche completare la reazi...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interesse a divulgare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato da un scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), la Fondazione canadese per fondo di innovazione-John R. Evans leader (35017), il programma di Innova Alberta Campus e il Ministero di Alberta di Sviluppo economico e commercio.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
DEPC (Diethyl pyrocarbonate)SigmaD5758-100ML
TRIS base, UltrapureJT Baker4109-01
KOAc (Potassium acetate)Bio BasicPB0438
Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)Bio BasicMB0326
Sucrose, molecular biology gradeCalbiochem573113-1KG
SpermidineSigma85558
GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solutionSigmaG0635
ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solutionSigmaA6559
19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%Bio BasicA0006
UreaBio BasicUB0148
500mL bottle top filtration units, 0.2 µmSarstedt83.1823.101
FormamideSigmaF9037-100ML
EDTA (disodium salt, dihydrate)Bio BasicEB0185
SDSBio BasicSB0485
Bromophenol blueBio BasicBDB0001
Xylene cyanol FFBio BasicXB0005
MEGAshortscript T7 transcription kitAmbionAM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kitAmbionAM1344
Acid Phenol:Chloroform (5:1)AmbionAM9722
25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl AlcoholInvitrogen15593-049
Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.Green Hectares, USAContact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)Thermo FisherE00382
100 mM dNTPsInvitrogen56172, 56173, 56174, 56175Mix equal parts for a stock of 25 mM each.
AMV-RT, 10 U/µLPromegaM5101
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing KitThermo Fisher707701KT
Model 4200 IR2 DNA analyzerLI-CORProduct has been discontinued
APS (Ammonium Persulfate)Bio BasicAB0072
TEMEDBio BasicTB0508
Phusion High Fidelity PolymeraseNew England BiolabsM0530
Turbo DnaseThermo FisherAM2238

Riferimenti

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