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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Consegna di droga locale a ghiandole sottomandibolari è di interesse nella biologia della ghiandola salivaria comprensione e per lo sviluppo di nuove terapie. Vi presentiamo un protocollo di iniezione retroductal aggiornate e dettagliate, progettato per migliorare la precisione nella consegna e riproducibilità sperimentale. L'applicazione presentata qui è la consegna di nanoparticelle polimeriche.

Abstract

Due obiettivi comuni di terapeutica della ghiandola salivaria sono la prevenzione e la cura di disfunzione del tessuto seguendo uno autoimmuni o ferita di radiazione. Formulando localmente i composti bioattivi per le ghiandole salivari, le maggiori concentrazioni di tessuto possono essere raggiunto in modo sicuro contro l'amministrazione sistemica. Inoltre, fuori tessuto bersaglio effetti da extra-ghiandolare accumulo di materiale possono essere drasticamente ridotto. A questo proposito, iniezione di retroductal è un metodo ampiamente usato per lo studio sia della ghiandola salivaria biologia e fisiopatologia. Retroductal la somministrazione di fattori di crescita, cellule primarie, vettori adenovirali e farmaci piccola molecola ha dimostrata di sostenere la funzione della ghiandola nella regolazione della ferita. Precedentemente abbiamo indicato l'efficacia di una strategia di nanoparticelle-siRNA retroductally iniettato per mantenere la funzione della ghiandola dopo l'irradiazione. Qui, un metodo altamente efficace e riproducibile per amministrare i nanomateriali alla ghiandola sottomandibolare murina attraverso il dotto di Wharton è dettagliato (Figura 1). Descriviamo l'accesso alla cavità orale e delineare i passaggi necessari per dotto di Wharton cannulate, con ulteriori osservazioni che funge da controllo di qualità durante tutta la procedura.

Introduzione

Disfunzione della ghiandola salivaria ha molte eziologie, compreso la sindrome di Sjögren, una perdita mediata autoimmune del tessuto secretivo funzionale e indotta da radiazioni hyposalivation (RIH), un comune sequella di testa e collo cancro radioterapia1. Perdita di funzione salivaria a causa di una delle due condizioni predispone gli individui ad infezione orale e sistemica, carie dentaria, disfunzione digestiva e della deglutizione, danno di discorso e depressione maggiore1,2,3. Di conseguenza, qualità della vita significativamente soffre, con interventi limitati alla palliazione dei sintomi piuttosto che curare4. Per studiare nuove terapie in vivo, è di interesse per l'amministrazione di composti bioattivi direttamente alla ghiandola salivare.

Iniezione di Retroductal è un metodo importante per fornire composti bioattivi direttamente per le ghiandole salivari e verificare l'efficacia nella malattia, ferita, o sotto l'omeostasi normale del tessuto. Sono tre ghiandole salivari maggiori parotide (PG), la sottomandibolare (SMG) e sublingual (SLG), tutti di cui vuoto nella cavità orale attraverso dotti escretori. L'anatomia della murino SMG consente accesso diretto attraverso l'incannulamento del dotto di Wharton, situato nel pavimento della bocca sotto la lingua5. Seguito all'inserimento di una canula, solvatato farmaci può essere somministrato direttamente al SMG. A seguito della consegna retroductal, diffusione extra-ghiandolare è limitato alla capsula di tessuto circostante che regola lo scambio di materiale con le circostanti strutture6. il SMG e le relative condutture sono strutturati allo stesso modo negli esseri umani e abitualmente si accede durante il SMG chirurgia e sialoendoscopy7. Negli esseri umani e topi, il PG è similarmente raggiungibile tramite dotto di Stensen nella mucosa orale8.

In modelli murini di RIH, SMG retroductal iniezione è stata usata per fornire terapie anche fattori di crescita, cellule primarie, vettori adenovirali, citochine e composti antiossidanti di modulare la risposta cellulare al danno e ridurre il risultante tessuto danno5,9,10,11,12,13,14,15,16. Il più notevole successo clinico dell'iniezione di retroductal è la somministrazione di vettore adenovirale alla diretta espressione di un canale di acqua (Acquaporina 1; AQP1) in pazienti dopo la radiazione per testa e collo cancro17.

In precedenza, abbiamo sviluppato e dimostrato l'efficacia di un sistema di nanoparticelle polimeriche-siRNA retroductally iniettato per proteggere la funzione della ghiandola salivaria da RIH11,18,19,20. Come un'estensione del nostro lavoro passato, qui, dimostriamo il nostro protocollo per l'iniezione di SMG retroductal utilizzando una nanoparticella fluorescente contrassegnata (NP) in grado di caricamento e di trasporto altrimenti scarsamente solubili farmaci21,22, 23.

Abbiamo sintetizzato il NP da un copolimero diblock composto da poli (stirolo-alt-idrazide anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) attraverso polimerizzazione per addizione reversibile catena frammentazione (zattera), come descritto in precedenza21. Attraverso cambio solvente, questi polimeri spontaneamente auto-assemblarsi in strutture NP micella con un idrofobo interni e idrofilo esterno21. La NPs sono etichettati con Texas-Red fluoroforo per consentire la verifica della consegna NP nelle ghiandole senza sacrificare l'animale. Animali immagini dal vivo e immunohistochemistry SMG è mostrato a 1 h e 1 giorno dopo l'iniezione.

Questo aggiornamento e protocollo di inserimento di una canula riproducibile dovrebbe consentire ad altri di raggiungere retroductal iniezione. Ci aspettiamo che questa raffinata tecnica diventerà fondamentale per gli studi in vivo e sviluppo terapeutico24,25.

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Protocollo

Tutte le procedure in vivo descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Università sulle risorse animali presso l'Università di Rochester, Rochester, NY.

1. preparazione

  1. Utilizzando tubi di 32G catetere intracranico con inserto in filo, tagliare 3 cm del tubo per formare un'estremità smussata, circa 45° rispetto all'asse maggiore. Confermare che il filo sia almeno 1 cm più lungo rispetto al tubo.
  2. Caricare 50 µ l di soluzione di nanoparticelle PSMA (Figura 1), o altro materiale di iniezione, in una siringa di Hamilton. Per ridurre la probabilità del barotrauma durante l'iniezione, collegare il tubo del catetere, con il mandrino rimosso, alla siringa ed espellere il volume morto.
  3. Ispezionare la soluzione di iniezione per assicurarsi che la nanoparticella è completamente solvatati per evitare l'ostruzione duttale dopo la somministrazione.
  4. Preparare la soluzione di atropina a 0,1 mg/mL.
    Nota: Poiché l'atropina è sensibile alla luce e si degrada nel tempo, questa soluzione dovrebbe essere fatta il giorno dell'iniezione e al riparo dalla luce fino a quando somministrato.

2. accesso e visualizzazione Ductal punto di ingresso

  1. Pesare topi C57/BL6 utilizzando una bilancia analitica.
  2. Usando una siringa da 0,5 mL con ago 29 x ½", anestetizzare i topi con una soluzione salina sterile intraperitonealmente iniettato di 100 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina. Procedere con il passaggio seguente quando il mouse non risponde agli stimoli, che generalmente si verifica entro 5-10 min dopo l'iniezione.
    Nota: Questa procedura può essere eseguita anche sotto isoflurano, ma richiederà un cono di naso personalizzato che consente l'accesso alla cavità orale.
  3. Per prevenire la secchezza durante la procedura, applicare il lubrificante per gli occhi e posizionare il mouse in posizione prona su un palco personalizzato.
    Nota: Per mantenere condizioni adeguate per fase intra-orale, strumenti dovrebbero essere disinfettati o sterilizzati prima di ogni utilizzo.
  4. Aprire la cavità orale proteggendo gli incisivi maxillary sopra una trave metallica e utilizzare una fascia elastica per tendere verso il basso dietro gli incisivi mandibolari (Figura 2A).
  5. Allineare il mouse sotto il microscopio per dissezione in modo tale che la base della mascella è visualizzata.
  6. Utilizzare un retrattore in acciaio personalizzato, curvo per applicare tensione bilateralmente al mucosa orale per allargare la bocca.
  7. Per visualizzare i papillae sottomandibolari, afferrare e sollevare delicatamente la linguetta dal pavimento della bocca usando il forcipe smussato.
    Nota: Le papille verranno visualizzato come due sporgenze pallidi sotto la lingua (Figura 2B).
  8. Per facilitare la visualizzazione e l'ulteriore manipolazione all'interno della cavità orale, posizionare il cotone tra la lingua e la mucosa buccale.

3. inserimento di una canula ductal e posizionamento della linea

  1. Usando bene, pinzetta, afferrare tubo catetere con l'inserto di filo. Per un controllo manuale ottimale durante l'inserimento di una canula, allineare il tubo con la curvatura delle pinze (Figura 3A).
  2. Uso del microscopio per dissezione, spostare il forcipe e filo nel campo di vista.
    Nota: Il cavo deve essere sporgenti dal tubo.
  3. Applicare una leggera pressione nella base di una papilla sottomandibolare con il filo da incasso per produrre una piccola, superficiale, mucosa puntura (0,076 mm di diametro) che faciliterà il successivo ingresso del tubo del catetere (0,25 mm di diametro). Se si incontra resistenza, taglio smussati freschi suggerimenti su entrambi i tubi e inserto in filo con le forbici per dissezione tagliente.
  4. A seguito dell'entrata, ritirare il mandrino e, utilizzando il microscopio per dissezione, confermano la presenza di saliva al sito di puntura. Evitare movimenti improvvisi o forti (ritiro o inserimento) del mandrino che può causare sanguinamento o compromettere l'integrità ductal.
  5. Retrarre il mandrino all'interno della tubazione (Figura 3B).
  6. Per garantire che i tubi di iniezione rientrerà nel dotto di Wharton di apertura, inserire tubi contenenti il mandrino come una guida rigida nella puntura fatta in precedenza (Figura 2 C).
    Nota: Se non eseguite rapidamente, gonfiore locale può impedire il re-inserimento.
  7. Per evitare la contropressione da prolungata ostruzione duttale, ritirare il tubo. Ispezionare per verificare che un'apertura, visibile al microscopio, può essere visto nel papilla sottomandibolare. Caso di sanguinamento visibile, rimuovere il mandrino e tentare di nuovo a partire da punto 3.2 papillae sottomandibolari avversari.
  8. Senza spostare il mouse, somministrare l'iniezione intraperitoneale di soluzione di atropina 1 mg/kg, per ridurre la salivazione durante la procedura. Attendere 5-10 min.
  9. Afferrare l'estremità del tubo siringa e inserire l'orifizio utilizzando il microscopio per dissezione (Figura 3). Se si incontra resistenza, tagliare un'estremità smussata fresca alla tubazione e tentare nuovamente.
  10. Una volta che il tubo è posto all'interno della papilla sottomandibolare, far avanzare lentamente 3-5 mm nel condotto. Rilasciare il tubo dal forcipe.
  11. Per migliorare la tenuta tra il tubo e la papilla sottomandibolare, asciugare l'interfaccia tamponando delicatamente con una garza per 1 min.
  12. Verificare che la posizione del tubo non è spostata durante l'asciugatura.

4. iniezione

  1. Iniettare il materiale ad un tasso di 10 µ l/min Inspect per confermare che il mouse rimane sedato e non mostra segni di afflizione (Figura 2D).
    Nota: Le iniezioni di 15-50 µ l sono ben tollerate. Iniezione di grandi volumi può causare barotrauma.
  2. Dopo l'iniezione, mantenere la pressione di siringa per 5 min migliorare la ritenzione del materiale all'interno del dotto di Wharton e SMG (Figura 4). Ispezionare la papilla sottomandibolare periodicamente per assicurarsi che la tubazione non uscire l'orifizio ductal.
  3. Utilizzando una pinzetta, afferrare ed estrarre delicatamente il tubo da papillae sottomandibolari.
    Nota: È normale osservare qualche uscita fluido dalle papille.
  4. Rimuovere il riavvolgitore e cotone dalla cavità orale prima di spostare il mouse dal palco.
    Nota: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Inoltre, assicurarsi che il mouse non si trova con altri topi fino a completamente recuperato.

5. Verifica e analisi

Nota: Un in vivo Imaging System (IVIS) può essere utilizzato per valutare il mantenimento delle nanoparticelle fluorescente identificate dopo l'iniezione (come mostrato in 1h e 24 h dopo l'iniezione nella Figura 5).

  1. Per visualizzare meglio il segnale fluorescente all'interno del SMG attraverso la pelle, rimuovere il pelo ventrale che ricopre il SMGs rasatura o utilizzando un depilatori chimico.
    Nota: A seguito di eutanasia, SMG tessuto può anche essere raccolto, fisso (pernottamento in 4% paraformaldeide) e macchiato usando immunohistochemistry per confermare la persistenza di NP fluorescente contrassegnati un giorno dopo l'iniezione (Figura 6).

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Risultati

Iniezione di Retroductal può essere utilizzato per amministrare NPs per il SMG murino (Figura 1). Qui, noi consegniamo 50 µ g PSMA NPs etichettato con Texas Red fluorophore.

Corretto posizionamento del mouse permette facile accesso e la visualizzazione del pavimento della bocca (Figura 2A-B). I papillae sottomandibolari sono identificati come due spor...

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Discussione

Retroductal iniezione è fondamentale per la consegna di droga localizzata alla ghiandola salivare. Questa tecnica ha applicazioni nella selezione di agenti terapeutici per condizioni tra cui la sindrome di Sjogren e RIH9,10,28. Consegna della droga diretta in SMG mediante iniezione di retroductal fornisce un vantaggio chiave rispetto alla somministrazione sistemica nelle sue potenzialità per ridurre gli effetti di fuori bersag...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental e Craniofacial Research (NIDCR) e il National Cancer Institute (NCI) dei National Institutes of Health, sotto Premio numero R56 DE025098, UG3 DE027695 e F30 CA206296. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Quest'opera fu appoggiata anche dalla NSF DMR 1206219 e l'innovazione di IADR in Oral Care Award (2016).

Vorremmo ringraziare Jayne Gavrity per la sua assistenza nell'esecuzione di esperimenti IVIS. Vorremmo ringraziare Karen Bentley per il suo ingresso e assistenza nell'esecuzione di EM. Vorremmo ringraziare Weng Pei-Lun per la sua assistenza con IHC. Vorremmo ringraziare Matthew Ingalls per la sua assistenza nella preparazione di figura. Vorremmo ringraziare Dr. Elaine Smolock ed Emily Wu per la lettura critica di questo manoscritto.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Pilocarpine hydrochlorideSigma AldrichP6503Pilocarpine
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-9Spring Scissors for Tracheostomy
Sterile Saline SolutionMedlineRDI30296HSaline
Dumont #7 ForcepsFine Science Tools11274-20Curved Forceps
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-10Straight Forceps
Standard Pattern ForcepsFine Science Tools11000-12Blunt Forceps
Fine Scissors- Tungsten CarbideFine Science Tools14568-09Dissection Scissors
Microhematocrit Heparinized Capillary TubesFisher Scientific22362566Capillary tubes
Lubricant Eye OintmentRefreshN/ARefresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Antibody
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad PrismGraphPadver6.0Statistical Software
Cotton tipped applicatorMedlineMDS202000Applicator for eye ointment
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"BD7629Syringe for intraperitoneal injection

Riferimenti

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