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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare le cellule immunitarie incorporate in una matrice di collagene (3D) tridimensionale utilizzando la microscopia a luce-foglio. Questo protocollo elabora anche come tenere traccia di migrazione cellulare in 3D. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione nella matrice 3D.

Abstract

In vivo, l'attivazione, proliferazione e funzione delle cellule immuni tutti si verificano in un ambiente tridimensionale (3D), per esempio nei linfonodi o tessuti. Fino a data, la maggior parte dei sistemi in vitro si basano su superfici bidimensionali (2D), come piastre di coltura cellulare o vetrini coprioggetti. A condizioni fisiologiche in modo ottimale mimare in vitro, utilizziamo una matrice di collagene 3D semplice. Il collagene è uno dei principali componenti della matrice extracellulare (ECM) ed è stato ampiamente utilizzato per costituire matrici 3D. Per l'imaging 3D, la tecnologia sviluppata di recente la microscopia luce-foglio (noto anche come microscopia di illuminazione su un unico piano) è dotata di acquisizione ad alta velocità, profondità di penetrazione grande, candeggio basso e fotocitotossicità. Inoltre, la microscopia luce-foglio è particolarmente vantaggiosa per misurazioni a lungo termine. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato come impostare e gestire le cellule immuni umane, ad esempio primario umani linfociti T citotossici (CTL) e cellule natural killer (NK) nella matrice collagene 3D per l'utilizzo con la microscopia di luce-foglio per l'imaging di cellule vive e campioni fissati. La procedura di acquisizione e analisi di migrazione delle cellule delle immagini sono presentati. Un'attenzione particolare è data per evidenziare i passaggi critici e fattori per la preparazione dei campioni e analisi dei dati. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione in una matrice di collagene 3D e non è limitato alle cellule immuni.

Introduzione

La maggior parte delle conoscenze sulla migrazione di cellule proviene da 2D esperimenti1,2,3, che normalmente si svolgono in una superficie in vetro o in plastica di un cultura/imaging piatto. Tuttavia, uno scenario fisiologico richiede, nella maggior parte dei casi, un microambiente 3D, in cui la matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo determinante. ECM non solo fornisce l'essenziale struttura 3D per mantenere la morfologia cellulare corretto, ma offre anche segnali di sopravvivenza o direzionale spunti per un funzionamento ottimale di molte cellule4,5 . Pertanto, è necessario per identificare meglio le funzioni cellulari e comportamento in un ambiente che meglio riflette il contesto fisiologico un ambiente 3D.

Nel corpo umano, la maggior parte delle cellule soprattutto le cellule immuni, esercitano le loro funzioni nell'ambito di uno scenario 3D. Per esempio, cellule di T attivate pattugliano tessuti alla ricerca di cellule bersaglio, le cellule T naive migrano attraverso i linfonodi in cerca di loro cellule presentanti l'antigene cognate durante il quale le modalità di migrazione e i macchinari sono adattati ai corrispondenti extracellulare ambiente3,6,7. Il gel di collagene 3D è stato ampiamente usato come un cellulare 3D ben consolidata e ben caratterizzati cultura sistema8,9,10. Il nostro lavoro precedente dimostra che linfociti umani primari sono estremamente mobili e la migrazione a una velocità media di circa 4,8 µm/min in una matrice a base di collagene di 0,25%11. Riarrangiamento del citoscheletro svolge un ruolo chiave nella migrazione cellulare12. Raccogliendo la prova dimostra che i linfociti non si applicano solo una singola modalità di migrazione ancora possono passare di certo comportamento di migrazione a seconda della posizione, microambiente, citochine, gradienti chemiotattici e segnali extracellulari quali tune il comportamento migratorio in modi diversi 3.

Per analizzare in modo affidabile le funzioni delle cellule immuni e comportamento, ad esempio, migrazione, formazione di protrusione o trasporto vescicolare, è di grande vantaggio di essere in grado di acquisire immagini in 3D relativamente grandi volumi in modo veloce e affidabile. Per l'imaging 3D, la tecnologia sviluppata di recente la microscopia luce-foglio (noto anche come microscopia di illuminazione su un unico piano) offre una soluzione soddisfacente13,14. Durante l'acquisizione di imaging, un sottile foglio di luce statico viene generato per illuminare il campione. In questo modo, sul piano di messa a fuoco, una vasta area possa essere illuminata contemporaneamente senza intaccare le cellule fuori piano. Questa funzionalità consente una velocità di acquisizione elevata con un candeggio drasticamente ridotto e la fotocitotossicità. In questo articolo, descriviamo come visualizzare cellule immuni umane primarie utilizzando la microscopia a luce-foglio e come analizzare la migrazione in uno scenario 3D.

Protocollo

Ricerca effettuata per questo studio con il materiale umano (alloggiamenti di sistema del leucocita riduzione dai donatori di sangue umano) è autorizzata dal comitato etico locale (dichiarazione da 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) e segue le linee guida corrispondenti.

1. preparazione della soluzione neutralizzata collagene (500 µ l)

  1. Trasferire 400 µ l di soluzione di riserva refrigerata collagene (10,4 mg/mL) in una provetta sterile 1,5 mL sotto il cofano di cultura cellulare. Lentamente aggiungere 50 µ l di refrigerati 10 x PBS (pH 7,0-7,3) a 400 µ l di soluzione di riserva refrigerata collagene. Miscelare la soluzione di affiancamento delicatamente il tubo.
    Nota: Tutti i passaggi nella parte 1 dovrebbero essere fatto sotto una cappa di cultura cellulare.
  2. Aggiungere 8 µ l di 0.1 M NaOH in 500 µ l della soluzione del collagene da 1.1. per regolare il pH a 7,2-7,6. Usare le strisce reattive pH (gamma di pH: 6-10) per determinare il valore del pH della miscela.
    Nota: I volumi possono variare per diversi lotti di collagene. Soluzione di NaOH dev'essere mescolato lentamente per evitare bolle d'aria. La miscela dovrebbe essere tenuta sul ghiaccio per evitare la gelificazione del collagene.
  3. Aggiungere 2 µ l di ddH sterile2O per rendere il volume finale di 500 µ l. mescolare bene e conservare questa soluzione di collagene (8,32 mg/mL) in ghiaccio o a 4 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
    Nota: In questa condizione, neutralizzate collagene possono essere utilizzata per 24 h. aliquote non sono consigliate per evitare bolle d'aria.

2. preparazione dei campioni per microscopia a fluorescenza di luce-foglio utilizzando capillari

  1. Etichetta fluorescente cellule vive di interesse con le tinture fluorescenti primario desiderato15 o proteine fluorescenti11 come descritto in precedenza.
  2. Trasferimento 1 × 106 delle cellule in una provetta sterile mL 1,5 sotto una cappa di cultura cellulare. Centrifugare la provetta a 200 x g per 8 min. scartare il supernatante e risospendere il pellet in 200 µ l di terreno di coltura.
    Nota: La densità delle cellule di 5 × 106 cellule/mL è consigliata per la visualizzazione di migrazione delle cellule immuni umane, soprattutto per i linfociti T citotossici (CTL) e cellule natural killer (NK).
  3. Aggiungere 85,9 µ l di soluzione di collagene neutralizzati da 1,3. nella sospensione delle cellule da 2,2. e mescolare bene per raggiungere una concentrazione di collagene di 2,5 mg/mL. Lasciare il mix di cella/collagene su ghiaccio nella cappa.
    Nota: Supponiamo che la concentrazione di collagene sia N mg/mL, il volume di neutralizzato soluzione di collagene (per sospensione di cellule di 200 µ l) = 200 × N /(8.32-N)
  4. Successivamente, inserire lo stantuffo corrispondente nel capillare (diametro interno ~ 1 mm) fino a quando lo stantuffo è 1 mm fuori del capillare. Bagnato lo stantuffo immergendo in terreno di coltura (Figura 1A).
    Nota: Questo passaggio potrebbe contribuire a evitare bolle d'aria quando il capillare è tuffato nel mix delle cellule/collagene. Il capillare e lo stantuffo non devono essere sterili.
  5. Immergere il capillare nel mix delle cellule/collagene da 2,3. Tirare lentamente lo stantuffo per 10-20 mm (Figura 1B). Pulire la parete esterna del capillare con un tovagliolo di carta inumidito con spray di etanolo 70% per rimuovere la soluzione rimanente di collagene.
  6. Montare il capillare con argilla di modellistica sulla parete interna di un tubo di 5ml e spingere il mix di cella/collagene verso il bordo del capillare (Figura 1).
  7. Tenere il vaso capillare a 37 ° C con 5% CO2 per 1 h per la polimerizzazione di collagene.
  8. Aggiungere il terreno di coltura (circa 1-2 mL) in una provetta da 5 mL. Premere delicatamente l'asta di collagene polimerizzato fuori nel mezzo per circa 3/4 del collagene appeso nel mezzo (Figura 1).
  9. Tenere il vaso capillare, come questo, a 37 ° C con 5% CO2 per altri 30 min equilibrare l'asta di collagene con il mezzo.
    Nota: In seguito, l'asta di collagene può essere tirato indietro nel capillare e coltivate ulteriore prima dell'ulteriore uso.

3. acquisizione immagini utilizzando la microscopia a luce-foglio

  1. Assemblea camera del campione secondo le istruzioni del fabbricante.
  2. Accendere il microscopio per riscaldare la camera del campione a 37 ° C (per live cell imaging solo) e l'incubazione.
  3. Posizionare il capillare nel pozzetto di misurazione e individuare l'esempio per trovare l'area di interesse per acquisizione di immagini.
  4. Attivare il corrispondente laser(s). Impostare le seguenti impostazioni: laser di potenza, tempo di esposizione, passo-dimensione della posizione z-stack, inizio e fine di z-stack e l'intervallo di tempo per l'imaging di cellule vive.
    Nota: ad esempio, nell'esempio in Figura 2 era imaged ogni 40 s per 6 h a 37 ° C con una dimensione di passo di 1 µm (spessore totale: 538 µm). La potenza del laser era 1% con un tempo di esposizione di 30 ms la dimensione in pixel in direzione x-y è 0,23 µm.
  5. Avviare l'acquisizione dell'immagine.

4. automated Tracking Analysis

  1. Aprire il convertitore di file, fare clic su Aggiungi file per scegliere i file immagini da convertire nel formato di file di software (*.ims). Fare clic su Sfoglia e selezionare una cartella in cui salvare i file convertiti. Fare clic su Avvia tutti.
  2. Aprire il software di analisi. Fare clic su sorpassare. Andare su File e fare clic su Apri, quindi scegliere il file di imaging per essere analizzati.
    Nota: Se la dimensione del file è grande questo passaggio potrebbe richiedere tempo. File più grandi di 1 Terabyte (TB) non sono consigliati per un singolo esperimento come il processo di tali file di grandi dimensioni sono capacità computazionale altamente esigenti.
  3. Fare clic su Aggiungi nuovo spot. Selezionare la casella di Immagine intero processo infine. Fare clic su Avanti.
  4. Immettere le coordinate x e y (in pixel) per definire l'area di interesse. Immettere il numero di fotogrammi (tempo e posizione z) per analizzare. Fare clic su Avanti.
  5. Selezionare il canale di destinazione, che contiene gli oggetti da rilevare, nell'elenco a discesa del Canale sorgente. Immettere stimato xy diametro (in µm). Fare clic su Avanti.
    Nota: Diametro stimato xy è il diametro medio della dimensione di x-y di oggetti da rilevare.
  6. Fare clic su qualità. Impostare una soglia, in cui la maggior parte delle cellule (oggetti) devono essere inclusa. Fare clic su Avanti.
  7. Scegliere l'algoritmo desiderato (Autoregressive Motion è consigliato). Immettere la distanza massima (20 µm è consigliato) e la dimensione di max divario (consigliato 3 o 2). Fare clic su processo intero immagine infine.
    Nota: Distanza massima e la dimensione massima del divario sono due soglie di rompere le tracce. Più specificamente, in due fotogrammi consecutivi quando la distanza tra lo stesso oggetto supera la distanza di Max, questo oggetto nel frame successivo verrà considerato come un nuovo oggetto. A volte durante l'acquisizione, lo stesso oggetto può scomparire per pochi fotogrammi e mostrare di nuovo. In questo caso, solo quando questo oggetto riapparirà all'interno della dimensione massima di gap, si considererà come lo stesso oggetto.
  8. Fare clic sul Tipo di filtro e scegliere l'opzione per escludere tracce indesiderate.
    Nota: Questo passaggio è facoltativo.
  9. Fare clic su Avanti e quindi fare clic su fine.
    Nota: Questo passaggio può richiedere ore fino a giorni a seconda della potenza di calcolo.
  10. Fare clic su Modifica tracce e scegliere la Corretta Drift. Selezionare l'algoritmo appropriato (Drift traslazionale è consigliato). Selezionare la desiderata Dimensione del set di dati di risultato (Nuova dimensione uguale alla dimensione corrente è consigliato). Fare clic su OK.
    Nota: Questo passaggio è solo necessario quando il collagene andato alla deriva durante l'acquisizione di immagini.
  11. Fare clic su statistiche e scegliere Configurare elenco di valori statistiche visibili. Controllare le opzioni di interesse per essere esportato (ad es. coordinate, velocità e così via). Fare clic su OK.
  12. Fare clic su Esporta tutte le statistiche al File e immettere il nome del file.

5. fissazione e immunofluorescenza colorazione delle cellule in matrici di collagene

  1. Trasferire 1.000 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA, in PBS) in una provetta da 5 mL sotto una cappa chimica.
    Nota: PFA dovrebbe essere equilibrato a temperatura ambiente.
  2. Immergere il capillare con collagene polimerizzato da 2,9. nella soluzione di PFA (per ~ 5 mm) e montare il capillare sulla parete interna del tubo 5ml con argilla di modellistica (come mostrato nella Figura 1).
  3. Premere delicatamente lo stantuffo fino a metà dell'asta del collagene è appeso nella soluzione PFA (Figura 1). Tenere il tubo a temperatura ambiente per 20 min.
  4. Tirare indietro lo stantuffo per ottenere l'asta di collagene all'interno del capillare. Prendete il capillare e scartare PFA.
  5. Montare il capillare in una nuova provetta e aggiungere 1 mL di PBS. Assicurarsi che il capillare è immerso in PBS.
  6. Premere delicatamente lo stantuffo fino a metà dell'asta del collagene è appeso nella soluzione. Montare il capillare sulla parete interna con argilla di modellistica.
  7. Tenere il tubo a temperatura ambiente per 5 min.
  8. Ripetere 5.4. -5.7 per altre 2 volte.
  9. Tirare indietro lo stantuffo per ottenere l'asta di collagene all'interno del capillare. Scartare il PBS. Trasferire 1-2 mL di tampone di blocco/permeabilizzazione (PBS + BSA 1% e 0,1% tensioattivi non ionici) nella provetta e ripetere 5.6.
    Nota: La BSA (1%) può essere sostituita dal 5% siero dell'animale in che l'Ab secondario è stata sollevata.
  10. Tenere il tubo a temperatura ambiente per 30-60 min.
  11. Tirare indietro lo stantuffo per ottenere l'asta di collagene all'interno del capillare. Scartare il buffer di permeabilizzazione. Trasferire 200-500 µ l di anticorpo primario nel buffer blocco/permeabilizzazione ed espelle l'asta nella soluzione.
  12. Tenere il tubo a temperatura ambiente per 1 h.
  13. Lavare l'asta di collagene 3 volte con PBST (PBS + 0.1-% tensioattivi non ionici) come descritto al punto 5.4. -5.8.
  14. Incubare la verga in anticorpo secondario nel buffer blocco/permeabilizzazione per 1 h a temperatura ambiente. Mantenerlo dalla luce.
  15. Lavare l'asta di collagene 3 volte con PBS come descritto al punto 5.4. -5.8.
  16. Tirare indietro lo stantuffo per ottenere l'asta di collagene all'interno del capillare. Conservare i campioni in PBS fino imaging.
  17. Acquisire i campioni come descritto in 3.

Risultati

Formazione di protrusione durante la migrazione delle cellule T è un processo altamente dinamico, che è dipendente di actina. Per visualizzare la formazione di protrusione di CTL umano primario, transfected transitoriamente una proteina mEGFP fusa per etichettare il citoscheletro di actina in CTL come descritto prima delle11. Un giorno dopo trasfezione, le cellule sono state incorporate nella matrice di collagene. Serie di immagini sono state acquisite ogni 40 s ...

Discussione

La maggior parte in vitro le analisi sono effettuata su una superficie 2D, ad esempio in piastre di coltura cellulare, capsule di Petri o sulle lamelle, considerando che in vivo le cellule, soprattutto le cellule immuni, esperienza principalmente un microambiente 3D. La prova emergente indica che modelli di migrazione delle cellule immuni differiscono tra 2D e 3D scenari17. Inoltre, i profili di espressione delle cellule del tumore sono differenti in 2D e 3D-in coltura di tessuti...

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi finanziario o commercio.

Riconoscimenti

Ringraziamo l'Istituto di clinica Hemostaseology e medicina trasfusionale per la fornitura di sangue del donatore; Carmen Hässig e Cora Hoxha per l'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo Jens Rettig (Saarland University) per il vettore di pMAX modificate, Roland Wedlich-Soldner (Università di Muenster) per il costrutto originale LifeAct-Ruby e Christian Junker (Saarland University) per generare il costrutto LifeAct-mEGFP. Questo progetto è stato finanziato da 1027 Sonderforschungsbereich (progetto A2 a B.Q.) e 894 (progetto A1 a M.H.). Il microscopio di luce-foglio è stato finanziato dalla DFG (GZ: FUGG 19-1 INST 256/4).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Fibricol, bovine collagen solutionAdvanced Biomatrix #5133-20MLCollagen matrix
0.5 M NaOH SolutionMerck1091381000for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agaroseAffymetrix32821-10GMSample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells KitThermo Fisher11348DIsolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher11132DActivation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2Thermo FisherPHC0023Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kitLonzaV4XP-30XXTransfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgGAbcamab124904IF
Alexa Fluor 633 PhalloidinThermo FisherA22284IF
CellMask Orange Plasma membrane StainThermo FisherC10045Fluorescent cell label
Tween 20SigmaP1379-250mLIF
Triton X-100Eurobio018774IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered salineThermo Fisher14190250IF
Bovine serum albuminSigmaA9418-100GIF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbitThermo FisherA-11011IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy)ZeissN.A.
Cell culture hoodThermo FisherHeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i Thermo FisherN.A.
Centrifuge 5418 and 5452EppendorfN.A.
PippettesEppendorf3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tipsVWR89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubesSarstedt 62.554.002
Capillaries 50 µLVWR (Brand)613-3373Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillariesVWR (Brand)BRND701934"Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stipsMerck1095430001to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringesBDZ230723 ALDRICHAlternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7)Play-DohN.A.
Imaris file converterBitplaneavailable at http://www.bitplane.com Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage)Bitplaneavailable at http://www.bitplane.com Analysis of 3D and 4D imaging data

Riferimenti

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