Ottimizzato Scratch test per test In Vitro della migrazione cellulare con una fotocamera ottica automatizzata

Riepilogo

Qui descriviamo una procedura per verificare la migrazione cellule in vitro con un microscopio ottico automatizzato fotocamera. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato ampiamente usato dove la chiusura del graffio è seguita per un periodo determinato. Il microscopio ottico consente un rilevamento affidabile e a buon mercato della migrazione cellulare.

Abstract

Migrazione delle cellule è un processo importante che influenza molti aspetti della salute, come ad esempio la guarigione della ferita e cancro, e, pertanto, è cruciale per lo sviluppo di metodi per lo studio della migrazione. Il dosaggio di gratta e Vinci è stato a lungo il più comune metodo di in vitro per testare composti con proprietà anti - e pro - emigrazione a causa del sua basso costo e semplice procedura. Tuttavia, un problema spesso segnalati del dosaggio è l'accumulo di cellule attraverso il bordo del graffio. Inoltre, per ottenere dati del dosaggio, immagini di esposizioni diverse devono adottare per un periodo di tempo a nello stesso punto per confrontare i movimenti della migrazione. Analisi di diversi programmi possono essere utilizzati per descrivere la chiusura gratta e Vinci, ma sono ad alta intensità di manodopera, imprecise e cicli di forze delle variazioni di temperatura. In questo studio, dimostriamo un metodo ottimizzato per testare l'effetto di migrazione, ad esempio con le proteine naturale, umani e bovini-lattoferrina e loro peptide N-terminale Lactoferricin sulla linea cellulare epiteliale HaCaT. Un'ottimizzazione cruciale è quello di lavare e gratta e Vinci in PBS, che elimina il suddetto accumulo di cellule lungo il bordo. Questo potrebbe essere spiegato dalla rimozione di cationi, che sono stati indicati per avere un effetto sulla connessione cellulare dei cheratinociti. Per garantire la vera rivelazione della migrazione, pre-trattamento con mitomicina C, un inibitore della sintesi del DNA, è stato aggiunto al protocollo. Infine, dimostriamo l'automatizzato telecamera ottica, che elimina i cicli di temperatura eccessiva, lavoro manuale con analisi di chiusura sul gratta e Vinci, migliorando sulla riproducibilità e garantire un'analisi di sezioni identiche dello scratch nel corso del tempo.

Introduzione

La migrazione è un processo importante che influenza diversi aspetti fisiologici. Nella guarigione delle ferite, migrazione facilita la riepitelizzazione della pelle. Nelle ferite non guariscono, quali ferite croniche, batteri opportunisti causano infezione della ferita, e ferite aperte sono ideali per la crescita di batteri e la formazione di biofilm^1,2. Biofilm è una delle cause dello sviluppo di batteri resistenti, che è una delle maggiori minacce per la nostra società moderna³. Nella guarigione della ferita, le cellule immunitarie non possono penetrare il biofilm. Nel cancro, migrazione delle cellule tumorali è un passo fondamentale della metastasi, che è la causa principale di morte per i pazienti con tumori solidi^4,5. Pertanto, è fondamentale essere in grado di studiare la migrazione.

L'analisi di gratta e Vinci è spesso usata per testare la migrazione cellulare perché è economico e facile da eseguire sulle linee cellulari aderenti, ad esempio del fibroblasto, endoteliale e delle cellule epiteliali linee^6,7. Oggi, esistono diversi metodi per l'esecuzione di graffi⁸, e diversi materiali sono stati segnalati per essere utilizzato, compreso stuzzicadenti⁹, cella raschietti¹⁰, laser¹¹e correnti elettriche¹². Tutti i metodi sono diversi Pro e contro, e il metodo dovrebbe essere decisi secondo lo strumento di analisi, budget e tipo di cella. Ad esempio, se il tipo di cella utilizzata richiede rivestimento, rimozione manuale della pressione, ad esempio con una punta di uno stuzzicadenti o una pipetta, influenzerà la migrazione all'interno dell'area, deve essere utilizzato un metodo diverso. In questo studio, ci concentreremo sulla raschiatura manuale.

Un aspetto negativo per raschiatura manuale è la variazione delle dimensioni, forme dei graffi e l'accumulazione delle cellule sui bordi del graffio. Esistono molti protocolli, e una carta più citato consigli aumentata velocità e/o lavaggio accurato dopo graffiare¹³. Inoltre, sono stati utilizzati diversi metodi per ridurre al minimo la proliferazione, poiché la proliferazione delle cellule non si distingue dalla migrazione e pertanto può dare risultati falsi-positivi della migrazione. Alcuni segnalati sono metodi deprivazione di siero precede il gratta e Vinci¹⁴ e diminuendo la quantità di siero¹⁵. Tuttavia, nessuno di questi metodi possono garantire che non c'è nessuna proliferazione. Quindi, segnaliamo un pre-trattamento delle cellule con mitomicina C per garantire risultati veri della migrazione. Mitomicina C è un antibiotico che inibisce la sintesi del DNA formando un legame covalente con il DNA, che impedisce che il DNA che separa¹⁶. Pre-trattamento con mitomicina C e lavaggi con PBS prima di graffiare, la chiusura rilevata del gap dimostra la vera migrazione delle cellule (Figura 1).

Una caratteristica di tutti i metodi è la necessità di un sistema analizzare il processo di migrazione¹⁷. Un metodo economico per analizzare lo stato di avanzamento e un comune consiste nell'utilizzare un microscopio a luce-campo per prendere immagini dello scratch in intervalli di tempo predeterminati, seguita da un'analisi della chiusura del divario in un'immagine software^18,19. Questo metodo è che richiede tempo, inaffidabili per quanto riguarda scattare foto presso il punto stesso e la messa a fuoco, e il movimento da incubatrice per fotocamera impone cicli delle variazioni di temperatura mentre le immagini sono prese. Altri metodi sono stati sviluppati per rilevare migrazione misurando il flusso di corrente. Le modifiche apportate, come celle di coprono più spazio sul piatto, che viene letto come un aumento nell' impedenza²⁰. Misurando l'impedenza, l'ambiente delle cellule non è interessato, e il metodo è pertanto considerato invasivo. Questo metodo si basa su piatti specializzati con elettrodi d'oro, che sono costosi, ma consentono il rilevamento di molti processi, quali l'adesione cellulare, la proliferazione, migrazione e morte cellulare. Un grande svantaggio di questo metodo è che la misurazione dell'impedenza non direttamente indicare la migrazione, come fattori quali la temperatura hanno un grande impatto sull'impedenza. Modifiche nell'impedenza possono essere causate da diversi fattori che non vengono esaminati dal software, rendendo più difficile l'analisi dei dati. Di conseguenza, la mancanza di visualizzazione richiede un microscopio a luce convenzionale per verificare la migrazione.

Per superare molti degli aspetti negativi delle tecniche disponibili, usiamo una telecamera ottica automatizzata in tempo reale. La camera ottica è un sistema di rilevamento con un microscopio ad alta velocità in una piccola piattaforma con una lente, unità di illuminazione e una fotocamera digitale. Ha un built-in software, che può testare la migrazione e la proliferazione tra le altre cose. Per rilevare la migrazione, due algoritmi vengono utilizzati per analizzare la crescita e la cinetica di migrazione delle cellule, che sono chiamati la proliferazione e la cicatrizzazione analisi, rispettivamente. L'analisi di proliferazione si basa su un algoritmo di segmentazione di un'immagine in due fasi che applica texture analisi per rilevare la differenza tra zone coperte delle cellule (indicato in giallo) e vuoto aree di base di analisi Istogramma avanzato. L'analisi di cicatrizzazione è basato su un algoritmo di tre fasi che rileva il monostrato cellulare, individua il divario di ferita e determina la larghezza del gap. Questi passaggi sono condotti a intervalli di tempo definiti dall'utente, e i dati sono presentati come superficie coperta, larghezza di spacco e zona gap. Uno dei grandi vantaggi di questa macchina è che esso permette l'imaging delle cellule aderenti attraverso liquido a causa dell'angolo della telecamera²¹. Le immagini di lenstakes inclinato della telecamera che si proiettano a uno z-stack di un singolo z-plane generano per garantire che le foto sono a fuoco (Figura 2). z-stack vengono generati dalla fusione della serie di immagini (ad es. 40) prese perpendicolare al bordo della ferita e attraverso l'intera ferita. Gli z-stack consente l'acquisizione della profondità dello strato delle cellule come pure un piano di messa a fuoco attraverso la ferita. Inoltre, la serie di immagini possono essere messi insieme per una collezione di immagini, video con il clic di un pulsante.

Dimostriamo un protocollo ottimizzato per il rilevamento della migrazione nella linea cellulare dei cheratinociti HaCaT. Abbiamo testato la lattoferrina e suo peptide N-terminale, Lactoferricin, da esseri umani e mucche, per analizzare il loro effetto sulla migrazione come queste molecole hanno dimostrate di avere numerose applicazioni come antimicrobico e immunitario modulando molecole^{22 , 23}. i quattro composti sono stati confrontati con cellule HaCaT non trattate e fattore di crescita epidermico (EGF) è stato usato come controllo positivo.

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Protocollo

La messa a punto sperimentale non ha alcuna restrizione etici e giuridici ed è stata condotta in accordo con l'Università di Roskilde. Una panoramica della disposizione sperimentale può essere visto in Figura 1 e i meccanismi della telecamera ottica nella Figura 2.

1. preparazione

1. Eseguire tutti i passaggi in un banco di flusso laminare sterile pulendo la panchina e tutte le attrezzature con etanolo al 70% prima dell'inizio dell'esperimento.
2. Posizionare la fotocamera ottica in un convenzionale incubatore a 37 ° C con 5% CO₂ per garantire le condizioni ottimali per le cellule.
3. Crescere le cellule HaCaT nei media DMEM con 10% FBS e 1x antibiotici (penicillina e streptomicina) in un matraccio da T75.
4. Utilizzare tripsina 1 x 1ml per staccare le cellule e sub-coltivare ogni 3-4 giorni, dalla dispersione di esso sopra lo strato cellulare. Pre-riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso.

2. generazione di un monostrato di HaCaT cellule in micropiastra 48-pozzi

1. Rimuovere il supporto dal pallone T75 con una pipetta Pasteur.
2. Lavare le cellule aderenti nel matraccio aggiungendo 5 mL 1X PBS sterile al pallone T75.
   Nota: Assicurarsi che il PBS sia privo di calcio e magnesio.
3. Circolare del PBS e rimuoverlo con una pipetta Pasteur.
4. Ripetere il passaggio 2.2-2.3.
5. Aggiungere tripsina 1 x 1 mL al pallone e si sparpagliano per tutto lo strato delle cellule.
6. Incubare la beuta a 37 ° C in un incubatore convenzionale fino a quando le cellule sono staccate (5-8 minuti è sufficienti per la maggior parte delle linee cellulari).
7. Vista al microscopio se le cellule sono staccate. Una volta che le cellule sono staccate, aggiungere 9 mL di coltura regolare con 10% FBS per inattivare la tripsina 1x.
8. Contare la cella con entrambi un emocitometro, un contatore coulter o simili.
   Nota: Tripan blu può essere utilizzato per visualizzare le cellule morte. Tuttavia, in tripsina 1x HaCaT cellule sono perfettamente rotondi quando vivo.
9. Trasferimento 7,5 x 10⁴ cellule/pozzetto nei mezzi di comunicazione di 250 µ l 10% FBS ad una piastra di coltura del tessuto 48 pozzetti a fondo tondo (piastra standard).
   Nota: l'analisi può essere impostato anche in 6, 12, 24 o piastre a 96 pozzetti, che tutti possono essere analizzate al microscopio ottico.
10. Delicatamente spostare la piastra da lato a lato per garantire che le cellule sono equamente ripartite nei pozzetti, o le cellule si riuniranno nel centro dei pozzi. Controllare sotto un microscopio chiaro per assicurarsi che la cella è uniformemente nei media
11. Mettere il piatto in un convenzionale CO₂ incubatore a 37 ° C durante la notte o fino a quando le cellule hanno aderito al fondo dei pozzetti.

3. aggiunta di stimoli per gli effetti di migrazione

1. Verifica se i pozzi sono 90-95% confluenti sotto un microscopio chiaro.
2. Preparare 10 µ g/mL di mitomicina C in un importo appropriato del mezzo.
   Nota: In questo studio, Mitomycin C è conservato a 4 ° C in una soluzione di riserva a 1 mg/mL. Mitomicina C in soluzione possa essere conservato fino a una settimana al buio a 2-8 ° C.
3. Rimuovere il supporto speso con una pipetta Pasteur da ciascun pozzetto.
4. Aggiungere 250 µ l di 5 µ g/mL di mitomycin C in ciascun pozzetto.
5. Incubare la piastra per 2 ore a 37 ° C e 5% CO₂.
6. Preparare gli stimoli dei peptidi diluendo in un importo appropriato del mezzo.
   Nota: In questo studio, umane e bovine lattoferrina sia il Lactoferricin sono stati testati a 25 µ g/mL in un volume di 250 µ l
7. Rimuovere il mezzo con il mitomycin C con una pipetta Pasteur.
8. Lavare i pozzetti 1x con 250 µ l di 1X PBS (temperatura ambiente) e Rimuovi il lavaggio con un Pasteur pipetta.
9. Aggiungere 250 µ l di 1X PBS e graffiare manualmente i pozzetti verticalmente con una punta di pipetta 200 µ l. Usare un nuovo puntale per ciascun pozzetto.
10. Rimuovere il PBS e aggiungere stimoli di peptide 250 µ l.
11. Montare la piastra nel sistema ottico fotocamera regolando le viti su entrambi i lati della piastra. Lasciare il coperchio sulle micropiastre.
    Nota: La telecamera può funzionare con il coperchio aperto se necessario.

4. impostare il programma per la telecamera ottica sul Computer

1. Fare clic su Acquisisci nella barra a sinistra.
2. Scegliere la funzione di guarigione delle ferite nella barra a sinistra.
3. Scegliere il tipo di piastra cliccando qui sotto l' illustrazione di piastra.
4. Deseleziona i pozzi, non è in uso, contrassegnandoli e fare clic su attiva in alto a sinistra sullo schermo.
   Nota: Per impostazione predefinita vengono selezionati tutti i pozzetti.
5. Regolare la messa a fuoco dell'obiettivo su pozzetti per adattarsi alla posizione delle celle facendo clic su uno dei pozzi.
   Nota: Autofocus può anche essere regolata manualmente spostando la barra a destra dell'illustrazione piatto.
6. Impostare il periodo di tempo per le immagini sotto Intervallo di foto (ad es. (00:30:00)).
7. Impostare il numero di ripetizione per adattare il periodo desiderato (ad esempio 97 ripetizioni).
8. Iniziare la corsa facendo clic sul pulsante Start in basso a destra.

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Risultati

HaCaT è una linea cellulare dei cheratinociti, uno dei tipi più abbondanti delle cellule della pelle. Quando si verifica una ferita, le cellule della pelle iniziano a proliferare e migrare sopra al letto della ferita per chiudere la ferita (Figura 3). Entrambi i processi sono, quindi, della massima importanza per la corretta guarigione.

La camera ottica può seguire entrambi i processi in tempo re...

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Discussione

L'importanza dell'immigrazione negli studi di sviluppo, la guarigione della ferita, immunologia ed il cancro ha portato a diversi metodi per studiare la migrazione. Migrazione può essere un'espressione dell'espansione o la chiusura del divario dalle cellule. Più spesso la chiusura del graffio viene testata, come è più facile crescere le cellule in un monostrato e poi fare un graffio che la coltivazione di cellule in una forma specifica di⁸. Il nostro studio dimostra un metodo ottimizzato per s...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Optical camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cell			Donated from Bispebjerg Hospital
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium for HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fetal bovine serum
PBS	Gibco	D837	Without Mg+ and Ca2+
Pencillin-Streptomycin	Sigma	P0781	Antibiotics
Trypsin (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Inhibits proliferation
Microtiter plate	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro