Un metodo semplice e riproducibile per preparare campioni di membrana da microvasi cerebrali appena isolati del ratto

Riepilogo

Qui, è descritto un metodo per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana. Questo protocollo ha il chiaro vantaggio di produrre arricchito del microvessel campioni con proteina accettabile resa da singoli animali. Campioni possono quindi essere utilizzati per analisi di robusta proteina presso l'endotelio microvascolare cerebrale.

Abstract

Emato - encefalica (BBB) è un tessuto barriera dinamica che risponde ai vari stimoli fisiopatologici e farmacologici. Tali cambiamenti derivanti da questi stimoli possono notevolmente modulano la consegna della droga per il cervello e, per estensione, causano notevoli sfide nel trattamento del sistema nervoso centrale (CNS) malattie. Molte modifiche BBB che interessano la farmacoterapia, coinvolgono proteine localizzate ed espresse a livello delle cellule endoteliali. Infatti, tale conoscenza sulla fisiologia BBB nella salute e nella malattia ha suscitato notevole interesse nello studio di queste proteine di membrana. Da un punto di vista di ricerca di scienza di base, ciò implica un requisito per un metodo semplice ma robusto e riproducibile per l'isolamento dei microvasi dal tessuto di cervello raccolto da animali da esperimento. Per preparare campioni di membrana da microvasi appena isolati, è indispensabile che la preparazione del campione essere arricchiti in cellule endoteliali ma limitati in presenza di altri tipi di cellule dell'unità neurovascolare (cioè, gli astrociti, microglia, neuroni, periciti). Un ulteriore vantaggio è la possibilità di preparare i campioni da singoli animali al fine di acquisire la vera variabilità dell'espressione della proteina in una popolazione sperimentale. In questo manoscritto, vengono forniti dettagli per quanto riguarda un metodo che viene utilizzato per l'isolamento di microvasi cerebrali di ratto e preparazione dei campioni di membrana. Arricchimento del microvessel, dai campioni derivati, è ottenuta utilizzando quattro fasi di centrifugazione dove destrano è incluso nel buffer del campione. Questo protocollo può essere facilmente adattato da altri laboratori per le proprie applicazioni specifiche. Campioni generati da questo protocollo sono stati indicati per produrre dati sperimentali affidabili da esperimenti di analisi di proteine che possono notevolmente facilitare la comprensione delle risposte BBB a stimoli fisiologici, fisiopatologici e farmacologici.

Introduzione

Emato - encefalica (BBB) esiste a livello di interfaccia tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la circolazione sistemica e svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell'omeostasi del cervello. In particolare, le funzioni BBB al proprio controllo soluto le concentrazioni nel liquido extracellulare del cervello e di fornire in modo efficiente quei nutrienti necessari per soddisfare le richieste metaboliche considerevole del CNS¹dal tessuto cerebrale. Questi ruoli implicano che la BBB, che esiste principalmente a livello della cellula endoteliale microvascolare, deve possedere meccanismi discreti che permettono alcune sostanze per accedere il parenchima cerebrale, garantendo nel contempo che xenobiotici potenzialmente dannosi non può si accumulano. Infatti, cellule endoteliali microvascolari del cervello non sono fenestrate e pinocitosi limitato, che assicura una mancanza di permeabilità non selettivo²per mostre. Inoltre, le cellule endoteliali del microvessel di cervello esprimono proteine di giunzione junction e adherens strette che agiscono per formare un fisico "sigillo" tra cellule endoteliali adiacenti e limitare notevolmente paracellulare diffusione di sostanze ematica nel cervello parenchima. Infatti, la permeabilità selettiva di sostanze endogene ed esogene richiede espressione funzionale di assorbimento e efflusso trasportatori³. Nel complessive, strette giunzioni, giunzioni intermedie e trasportatori funzionano di concerto per mantenere le proprietà di barriera unico della BBB.

La BBB è una barriera dinamica che risponde agli stimoli fisiologici, fisiopatologici e farmacologici. Ad esempio, ipossia/riossigenazione stress ha dimostrato di modulare l'espressione di proteine di giunzione critici (cioè, occludina, zonulae occluden-1 (ZO-1)), che è associato con permeabilità paracellulare aumentato per gli indicatori vascolari come saccarosio^4,5,6. Osservazioni simili sono state effettuate a BBB nella regolazione della ferita di cervello traumatica⁷ e dolore infiammatorio periferico^8,9. Queste stesse malattie possono anche modulare i meccanismi di trasporto presso le BBB^{10,11,12,13,14}. Infatti, ipossia/riossigenazione aumenta l'espressione funzionale di anioni organici che trasporta il polipeptide 1a4 (Oatp1a4) presso la BBB, che può portare ad un aumento significativo del trasporto di sangue al cervello di substrati specifici di trasporto Oatp come taurocholate e atorvastatina¹³. BBB proprietà possono anche essere alterate dalla farmacoterapia stessa, un meccanismo che possa costituire una base per entrambi profondi cambiamenti nell'efficacia droga nel cervello e per interazioni farmaco-farmaco. Ad esempio, meccanismi di recettori nucleari di bersagli di acetaminofene segnalazione in cellule endoteliali microvascolari del cervello, aumenta l'espressione funzionale del trasportatore di efflusso critico P-glicoproteina (P-gp) e modifica l'analgesia dipendente dal tempo conferiti dalla morfina, un analgesico oppioide e stabilito P-gp trasporto substrato¹⁵. Una conoscenza approfondita delle modifiche BBB, che può essere indotta da malattie o da farmaci, richiede anche l'identificazione e caratterizzazione di specifici meccanismi regolatori che controllano queste modifiche. Infatti, le vie di segnalazione discrete sono state identificate in cellule endoteliali microvascolari del cervello che controllano l'espressione molecolare di giunzione stretta proteine^16,17 e trasportatori^{15, 18,19}. Prese insieme, queste osservazioni indicano che vie molecolari complesse sono coinvolti nella regolazione delle giunzioni strette BBB e trasportatori in salute e malattia.

Una sfida significativa nello studio della BBB è il requisito assoluto di un metodo semplice ed efficace per l'isolamento dei microvasi da tessuto cerebrale derivato da animali da esperimento e successiva preparazione dei campioni di membrana. Questi campioni devono essere preparati in modo che sono sia arricchite in cellule endoteliali microvascolari del cervello e limitati in presenza di altri tipi di cellule. Sopra i passato parecchi anni, molteplici metodologie per l'isolamento di microvasculature dal cervello del roditore sono stati segnalati nella letteratura scientifica^13,20,21,22. Questo articolo viene descritto un semplice, robusto e un metodo riproducibile per l'isolamento dei microvasi dal cervello del ratto e per la preparazione di campioni arricchita di membrana endoteliali che può essere utilizzato per l'analisi dell'espressione della proteina. Un vantaggio di questo protocollo di isolamento del microvessel è la capacità di ottenere la preparazione del campione di alta qualità e con resa sufficiente di proteina da un singolo animale sperimentale. In questo modo la considerazione della variabilità nell'espressione della proteina. Tale un anticipo in questo protocollo ha migliorato notevolmente la robustezza degli studi BBB perché over-estimation (o sottovalutazione) della vera grandezza dei cambiamenti della proteina a BBB ora può essere evitato. L'inclusione di più fasi di centrifugazione con destrano consente inoltre di arricchimento migliorata di microvasi in campioni sperimentali, facilitando la rimozione di costituenti cellulari indesiderate quali neuroni.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate da un istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e si conformano al National Institutes of Health (NIH) e Animal Research: Reporting In Vivo esperimenti (arrivo) linee guida. Nella Figura 1è illustrato il flusso procedura per il protocollo.

1. set-up per la procedura

1. Preparare il tampone del microvessel di cervello (BMB). Avviare pesando 54,66 g D-mannitolo, 1,90 g EGTA e 1,46 g 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (cioè, Tris) base in un bicchiere pulito. Aggiungere 1,0 L di acqua deionizzata. Miscelare i componenti del buffer BMB utilizzando un agitatore magnetico. Una volta che la soluzione è stata mescolata accuratamente, regolare il pH a 7.4 utilizzo 1,0 M HCl.
2. Preparare la soluzione di destrano (75.000 MW) di 26% (w/v) prima anestetizzare gli animali. Preparare la soluzione di destrano come descritto nei passaggi seguenti.
   Nota: È criticamente importante preparare questa soluzione prima del tempo perché destrano può prendere circa 1,5-2 h da sciogliere in tampone acquoso.
   1. Pesare il destrano in polvere (26 g / 100 mL di tampone) in un becher pulito.
   2. Misurare il volume appropriato di BMB e versare in un becher separato, pulito.
   3. Versare lentamente BMB nel becher contenente destrano in polvere. Mescolare manualmente il destrano in polvere durante il versamento di BMB utilizzando un bastoncino per mescolare vetro.
   4. Regolare il pH a 7.4 con 1,0 M HCl immediatamente prima di utilizzare.
      Nota: Un isolamento tipico di microvasi cerebrali da 12 ratti Sprague-Dawley individuali (maschio o femmina; 3 mesi di età; 200-250 g ciascuna) richiede 200 mL di soluzione del dextrano (cioè, del dextrano 52 g in 200 mL di BMB).

2. estrazione del tessuto di cervello dai ratti Sprague-Dawley

1. Dopo il trattamento sperimentale desiderato, anestetizzare ratti Sprague-Dawley utilizzando ketamina (50 mg/kg; 2,5 mL/kg i.p.) e xilazina (10 mg/mL; 2,5 mL/kg I, p.). Diluire la ketamina e xilazina in soluzione fisiologica 0,9% a concentrazioni finali di 20 mg/mL e 4,0 mg/mL rispettivamente. Eutanasia animali per decapitazione usando una ghigliottina affilata conformemente agli orientamenti IACUC. Utilizzare la stessa procedura per ratti Sprague-Dawley maschi e femminili.
2. Resecare la pelle dal cranio del ratto facendo un singolo taglio trasversa utilizzando forbici chirurgiche.
3. Utilizzando Pinze ossivore, attentamente rimuovere la piastra di cranio ed esporre il cervello.
4. Rimuovere il cervello con una spatola. Staccare il cervello e inserire il tessuto cerebrale isolato in una provetta conica da 50 mL contenente 5 mL di BMB. Aggiungere 1,0 µ l di inibitore della proteasi cocktail / 1,0 mL di tampone BMB immediatamente prima dell'uso.

3. brain Processing

1. Trasferire il tessuto cerebrale dalla provetta conica da 50 mL per una piastra Petri pulita.
2. Usando il forcipe, rotolare delicatamente il cervello su carta da filtro diametro 12,5 cm per rimuovere esterne meningi, che sono liberamente aderite alla corteccia cerebrale. Premere il tessuto cerebrale contro la carta da filtro delicatamente e tirare il tessuto ancora. Girare la carta filtro frequentemente durante questo passaggio.
3. Separare il plesso coroideo dagli emisferi cerebrali usando il forcipe.
   Nota: Il plesso coroideo appare come un tessuto chiaro membranoso localizzato sulla superficie dei ventricoli cerebrali.
4. Delicatamente appiattire il tessuto cerebrale e rimuovete le meningi e bulbi olfattivi usando il forcipe rimanenti.
5. Posizionare il tessuto cerebrale corticale in un mortaio di vetro ghiacciato. Aggiungere 5,0 mL di cocktail contenenti inibitore della proteasi BMB nel mortaio.
6. Utilizzando un omogeneizzatore di cavi elettrici, omogeneizzare il tessuto cerebrale usando 15 pinneggiata a 3.700 giri/min. Eseguire omogeneizzazione utilizzando una smerigliatrice di tessuto 10ml mortaio e pestello. Tra omogeneizzazione di ogni singolo campione, pulire il pestello con etanolo al 70%.
   Nota: Omogeneizzazione colpi devono essere coerenti in termini di ritmo e grandezza.
7. Versate l'omogeneizzato in provette da centrifuga con etichetta.

4. centrifugazione passaggi

1. Aggiungere 8,0 mL di soluzione del dextrano 26% per ogni provetta da centrifuga con etichetta contenente omogeneato del cervello.
2. Capovolgere la provetta due volte e poi accuratamente Vortexare il campione. Condurre il Vortex di ciascun campione con angolazioni multiple per garantire un'accurata miscelazione della soluzione omogeneato del cervello con soluzione del dextrano del 26%.
3. Centrifugare i campioni a 5.000 x g per 15 min a 4 ° C.
   Nota: Per alcune analisi, è utile confrontare il cervello dei microvasi con parenchima cerebrale. Dovrebbe essere la valutazione dell'espressione proteica in parenchima cerebrale richiesto, il surnatante da questo passo di centrifugazione (cioè, frazione parenchimatica del cervello) possa essere raccolti e conservato a-80 ° C per un uso futuro.
4. Rimuovere il supernatante utilizzando un aspiratore e pipetta Pasteur in vetro.
   Nota: Attenzione deve essere presa per non disturbare il pellet. In caso contrario, sarà ridotto quantitativo dei microvasi cerebrali raccolti, che diminuirà notevolmente il rendimento di proteina da questa procedura.
5. Risospendere il pellet in 5,0 mL di BMB contenente l'inibitore della proteasi cocktail (cioè, 1,0 μL inibitore della proteasi cocktail per 1,0 mL di buffer di BMB). Vortice il pellet per garantire la completa miscelazione.
6. Aggiungere mL 8,0 del dextrano del 26% a ogni provetta da centrifuga e vortice come descritto ai punti 4.1-4.2 del presente protocollo.
7. Centrifugare i campioni a 5.000 x g per 15 min a 4 ° C.
8. Utilizzando un termos e pipetta di vetro, aspirare il surnatante e garantire quel pellet contenente del microvessel cervello non viene interrotto.
   Nota: Materiale di eccesso che abbia aderito alla parete del tubo non contiene dei microvasi e dovrebbe essere accuratamente puliti e rimosso.
9. Ripetere i passaggi da 4,5 a 4,8 un ulteriore due volte.
10. Una volta 4 fasi di centrifugazione di destrano sono state completate, aggiungere 5,0 mL di BMB ogni pellet e vortexare per risospendere il campione.
    Nota: Dopo il completamento del passaggio 4.10, microvasi interi possono essere raccolti per l'analisi di localizzazione della proteina. Questo può essere realizzato prendendo un 50 μL aliquota del precipitato risospeso microvessel e sbavature su un vetrino per microscopio. Microvasi sono quindi calore-fisso a 95 ° C per 10 minuti in un blocco di riscaldamento seguito da fissazione in etanolo ghiacciata per un ulteriore 10 min diapositive possono quindi essere archiviati a 4 ° C fino a quando richiesto per gli studi di imaging.

5. ultracentrifugazione per preparare campioni di membrane microvascolare cerebrale totale

1. Trasferire campioni l'omogeneizzatore bicchiere precedentemente raffreddato.
2. Utilizzando un omogeneizzatore di cavi elettrici, omogeneizzare il tessuto cerebrale usando 8-10 su e giù colpi a 3.000 giri/min. Omogeneizzazione è condotto utilizzando una smerigliatrice di tessuto 10ml mortaio e pestello. Pulire il pestello con etanolo al 70% dopo omogeneizzazione di ogni singolo campione.
3. Trasferire i campioni per pulire i tubi ultracentrifuga. Numero e pesare ogni singolo tubo. Equilibrio e accoppiare i tubi prima di caricarli nel rotore ultracentrifuga.
   Nota: Tutti i peso e accoppiamento di tubi ultracentrifuga devono svolgersi con i tappi su per garantire misure accurate di pesi del tubo.
4. Centrifugare i campioni a 150.000 x g per 1 h a 4 ° C.
5. Usando un termos e vetro pipetta Pasteur, aspirare il surnatante facendo attenzione di non disturbare il pellet di membrana capillare.
6. In base alle dimensioni della pallina, aggiungere un volume adeguato di buffer di memoria, che è composto di acqua deionizzata e BMB in un rapporto di 1:1 (v/v). In genere, i pellet sono risospese in 400-500 μL di tampone di deposito. Aggiungere cocktail inibitore della proteasi per il buffer di memoria in un rapporto di 1,0 µ l per 1,0 mL di buffer di memoria.
7. Campioni di vortice per risospendere il pellet in buffer di archiviazione.
8. Utilizzando un pipetta Pasteur di vetro, trasferire campioni di membrana capillare in una microcentrifuga da 1,5 mL con etichetta.
9. Esempio di passaggio attraverso un ago siringa 5 x affinché il campione è mescolato completamente e che non aggregati cellulari esistono.
10. Conservare i campioni a-80 ° C fino a quando non necessari per l'analisi.
    Nota: Il contenuto proteico di ogni campione di membrana del microvessel è misurata utilizzando il metodo di Bradford.

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Risultati

Il flusso sperimentale per l'isolamento dei microvasi cerebrali di ratto e per la preparazione di campioni di membrana del microvessel è mostrato nella Figura 1. Utilizzando la procedura qui presentata, è dimostrato successo isolamento dei microvessels intatti dal cervello del ratto (Figura 2A). Questi vasi sono stati ottenuti dopo completamento di centrifugazione con destrano e immediatamente prima dell'inizio ultracentrifugaz...

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Discussione

In questo articolo, viene descritto un metodo semplice ed efficace di preparazione dei campioni di proteine di membrana da microvasi appena isolati dal tessuto di cervello di ratto. Diversi approcci per isolamento di microvasi cerebrali di ratto e/o generazione di preparazioni della membrana da microvasculature isolato sono stati segnalati in letteratura^{13,20,21,22 ,}

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	#P8340	Component of brain microvessel buffer
D-mannitol	Sigma-Aldrich	#M4125	Component of brain microvessel buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	#E3889	Component of brain microvessel buffer
Trizma Base	Sigma-Aldrich	#T1503	Component of brain microvessel buffer
Dextran (MW 75,000)	Spectrum Chemical Mftg Corp	#DE125	Dextran used in centrifugation steps to separate microvessels from brain parenchyma
Zetamine	MWI Animal Health	#501072	General anesthetic
Xylazine	Western Medical Supply	#5530	General anesthetic
0.9% saline solution	Western Medical Supply	N/A	General anesthetic diluent
Filter Paper (12.5 cm diameter)	VWR	#28320-100	Used for removal of meninges from brain tissue
Centrifuge Tubes	Sarstedt	#60.540.386	Disposable tubes used for dextran centrifugation steps
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay	ThermoFisher Scientific	#23236	Measurement of protein concentration in membrane preparations
Wheaton Overhead Power Homogenizer	DWK Life Sciences	#903475	Required for homogenization of samples
10.0ml glass mortar and pestle tissue grinder	DWK Life Sciences	#358039	Required for homogenization of samples
Hydrochloric Acid	Sigma-Aldrich	#H1758	Required for pH adjustment of buffers
Bovine Serum Albumin	ThermoFisher Scientific	#23210	Protein standard for Bradford Assay
Standard Forceps	Fine Science Tools	#91100-12	Used for dissection of brain tissue
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	#16020-14	Used for opening skull to isolate brain
50 ml conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	#352070	Used for collection of brain tissue following isolation
Glass Pasteur Pipets	ThermoFisher Scientific	#13-678-20C	Used for aspiration of cellular debris following dextran spins
Ethanol, anhydrous	Sigma-Aldrich	#459836	Used for cleaning tissue grinder; diluted to 70% with distilled water
Ultracentrifuge tubes	Beckman-Coulter	#41121703	Used for ultracentrifugation of samples