Un approccio basato su goccia di microfluidica e microsfere-PCR amplificazione per ampliconi di DNA Single-Stranded

Riepilogo

Questo lavoro fornisce un metodo per la realizzazione di piattaforme microfluidici basati su gocciolina e l'applicazione di microsfere di poliacrilammide per l'amplificazione di PCR di microsfere. Il metodo di microsfere-PCR permette di ottenere single-stranded DNA ampliconi senza separare DNA double-stranded.

Abstract

Basato su goccia microfluidica consentono la produzione affidabile di microsfere omogenee nel canale di microfluidica, fornendo controllata, dimensioni e morfologia delle microsfere ottenute. Una microsfera copolimerizzato con una sonda di DNA coprocoltura con successo è stato fabbricato. Diversi metodi quali la PCR asimmetrica, digestione esonucleasi e isolamento su biglie magnetiche rivestite con streptavidina possono essere utilizzati per sintetizzare DNA a singola elica (ssDNA). Tuttavia, questi metodi non possono utilizzare in modo efficiente grandi quantità di altamente purificato ssDNA. Qui, descriviamo un protocollo di PCR di microsfere dettagliare come ssDNA può essere amplificato in modo efficiente e separato da dsDNA semplicemente pipettando da una provetta di reazione di PCR. L'amplificazione di ssDNA può essere applicato come potenziali reagenti per i microarray del DNA e DNA-SELEX (sistematica evoluzione di ligandi di arricchimento esponenziale) processi.

Introduzione

DNA a singola elica (ssDNA) è stato ampiamente considerato come un elemento di riconoscimento molecolare (MRE) grazie alle sue proprietà intrinseche per l'ibridazione DNA-DNA^1,2. Lo sviluppo di sistemi sintetici ssDNA può portare ad applicazioni biologiche quali DNA microarrays³, oligotherapeutics, diagnostica e molecolare di rilevamento integrato basato su interazioni complementari^4,5.

Fin qui, le particelle di polimero di scala micrometrica sono state dimostrate con successo utilizzando dispositivi microfluidici. Diverse tecniche di microfluidica hanno dimostrati di essere potente per la produzione di microsfere altamente omogenee il flusso continuo in ambiente microchannel^6,7.

Nello studio di Lee et al. ⁸, una piattaforma di microfluidica gocciolina-basato per la sintesi di microfluidica di amplificazione oligo-microsfere e ssDNA qui è stato segnalato. La piattaforma microfluidica è costituito da due strati PDMS (polidimetilsilossano): una parte superiore con una rete di canali microfluidici per la generazione di microsfere e un fondo piatto a parte. Questi consistono di tre tipi di canali fluidici PDMS: 1) un flusso di canale per la generazione di goccia, 2) un canale serpeggiante per la miscelazione di due soluzioni e 3) un canale di polimerizzazione sequenziale per solidificazione di microsfere di messa a fuoco. Una volta due flussi immiscibili vengono introdotti in un singolo canale fluidico PDMS, i flussi possono essere forzati attraverso la struttura di orifizio stretto. I comportamenti di flusso come geometria del canale, portata e viscosità influiscono sulla dimensione e la morfologia delle microsfere. Pertanto, il principale flusso di liquido può essere diviso in Microscala monospheres^9,10.

Qui, viene fornito un protocollo dettagliato microsfera-PCR per l'amplificazione di ssDNA. In primo luogo, un processo di progettazione di dispositivi microfluidici basati su goccia è descritto. Quindi, è spiegato il modo in cui poliacrilammide microsfere possono essere funzionalizzate con modello casuale di DNA in maniera complementare. Infine, un protocollo di microsfere-PCR per amplificare ssDNA è mostrato.

Protocollo

1. realizzazione di una piattaforma di Microfluidic PDMS

1. Preparare 20 mL di liquido prepolimero PDMS con polimero di base e catalizzatore in un rapporto di volume di 10:1. Versare 10 mL del liquido PDMS su uno stampo SU-8 preparato su un wafer di silicio per la parte superiore della rete microfluidica. Per la parte inferiore piatta, versare lo stesso volume di liquido PDMS sul wafer di silicio senza una struttura di stampo.
   Nota: La rete di microfluidica è progettata in un programma CAD e poi convertita in un photomask al fine di fabbricare un master utilizzando il processo di fotolitografia tipico (vedere Figure supplementari). Questo master è composto lo stampo di SU-8 photoresist negativo sui wafer di silicio¹¹.
2. Posizionare due wafer di silicio rivestito con liquido prepolimero PDMS sulla piastra calda e della cura a 75 ° C per 30 min.
   1. Manualmente rimuovere lo strato PDMS curato dallo stampo SU-8. Allineare un diametro di 1,5 mm tondo attrezzo di perforazione del foro per il porto di olio sulla rete replicata microfluidici per l'interfaccia dei canali di flusso micron-scala con i campioni di liquido macro. Pugno l'attraverso-foro manualmente.
   2. Ripetere questo processo tre volte per la formazione delle due soluzioni e la porta di uscita di punzonatura.
3. Eseguire trattamento superficiale idrofilico sulla tomaia e strati di PDMS fondo utilizzando un palmare corona treater¹² per alcuni secondi per campione.
   1. Stack due trattati del plasma PDMS strati e calore a 90 ° C per 30 minuti utilizzando una piastra calda per il processo di incollaggio PDMS-a-PDMS. Fornire l'acqua pressurizzata utilizzando la pompa a siringa in tre porte di ingresso per l'incollaggio strutturale e la prova di perdita del dispositivo fabbricato.

2. produzione di poliacrilammide Oligo-microsfere

1. Preparare la miscela di microsfere indicata nella tabella 1.
2. Vortice e brevemente centrifuga la coprocoltura standard ssDNA etichettati sonda (Ap, 100 μM) e acrylamide:bis (19:1) soluzione di riserva.
3. Preparare soluzione ho mescolando 25 μL di 40% di acrilammide bis soluzione, 10 μL di ssDNA (coprocoltura sonda), 10 μL di tampone di x TBE 5 (1,1 M Tris; borato di 900 mM e 25 mM EDTA) e 5 μL di acqua. Preparare soluzione II con 50 μL di persolfato dell'ammonio 20%.
4. Preparare due siringhe individualmente riempito con soluzione soluzione II e io e montarli sulla pompa per introdurre flussi di soluzione nella piattaforma microfluidica. Preparare l'olio minerale mescolato con 0,4% TEMED per solidificazione superficiale delle microsfere.
   Nota: TEMED è ben noto come stabilizzatore del radicale libero. I radicali liberi possono accelerare il tasso di formazione del polimero con ammonio persolfato (APS) al fine di catalizzare la polimerizzazione di acrilammide.
5. Riempire una bottiglia di vetro con 4 mL di olio minerale per generare un flusso continuo.
6. Inserire due tubi a due porte nel tappo della bottiglia di vetro come un serbatoio di microfluidica: il raccordo pneumatico per l'applicazione dell'aria compressa in bottiglia di vetro dal compressore d'aria e la porta di fluido per fornire l'olio pressurizzato alla rete micro canale dalla bottiglia di vetro. Collegare i tubi tra la bottiglia di vetro e la porta di olio nel dispositivo microfluidico.
   1. Collegare i tubi ai porti due soluzione nel dispositivo microfluidico al fine di fornire le due soluzioni dalle pompe a siringa. Inserire tubi di mandata al fine di trasferire la microsfera generato nel becher.
7. Impostare la portata della pompa a siringa a 0,4 - 0,7 mL/h. regolare aria compressa la pressione del compressore utilizzando un regolatore (82-116 kPa). Impostare la velocità di rotazione (500 giri/min) della barra di agitatore magnetico in bicchiere di vetro su un piatto caldo. Azionare la pompa a siringa e fornire l'aria compressa generata da un compressore esterno nella bottiglia di vetro utilizzando il controllo ON/OFF di una valvola elettromagnetica¹³.
8. Osservare la formazione di microsfere nella geometria del flusso-messa a fuoco e solidificazione delle microsfere generate in bicchiere di vetro con un microscopio digitale.
   Nota: La dimensione e velocità di produzione delle microsfere dipendono la portata delle soluzioni e la pressione applicata per il flusso di olio minerale (tabella 2).

3. esecuzione di poliacrilammide Oligo-microsfere conta

1. Per la quantificazione di un emocitometro, prendete una piccola quantità (circa 100 µ l) di soluzione acquosa di poliacrilammide oligo-microsfere e posto sul vetro emocitometro e riempire delicatamente la sospensione di microsfere fino al pozzo della camera del conteggio.
   Nota: Per ulteriori dettagli, vedere http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
2. Utilizzare un microscopio e mano tally contatore per contare le microsfere in un unico set di 16 quadrati. Spostare l'emocitometro al gruppo successivo della camera, quindi portare il conteggio fino a quando tutte le quattro serie di 16 angoli sono contati.
3. Determinare il numero medio di microsfere e calcolare il numero delle microsfere in sospensione originale perlina.
4. Trasferire 100 μL di microsfere a un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Rimuovere il sopranatante mediante centrifugazione (400 x g) dolce e pipettaggio.

4. eseguire l'ibridazione del DNA sulla superficie del poliacrilammide Oligomicrosphere

Nota: Un'identico DNA sonda con un 5'-NH₂-gruppo invece di 5'-acrytide modifica viene aggiunto nella soluzione ho e testato per Ap-contenente microsfere in parallelo. Risultati di ibridazione del DNA sono mostrati nella Figura 2. La soluzione di sonde (PAC) di oligonucleotidi complementari Cy3-etichetta dovrebbe essere posizionata in una stanza buia.

1. Risospendere Cy3-cAp con 100 μL di tampone 1xTE (buffer di TE: 10 mM Tris e 1μM EDTA, pH 8.0) al fine di ottenere una concentrazione finale di 100 μM. Ad esempio, risospendere 1 pmol PAC in 100 mL di buffer di TE e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga coperta con carta stagnola.
   Nota: Per le sequenze di strand, vedere la tabella 3.
2. Aggiungere 100 μM di Cy3-PAC a un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL contenente microsfere Ap-copolimerizzati.
3. Toccare il tubo di un paio di volte per mescolare e incubare a temperatura ambiente al buio per 1 h.
4. Scartare il surnatante e rimuovere residui buffer tramite il pipettaggio.
5. Lavare tre volte con 500 μL di tampone di TE.
6. Risospendere le microsfere toccando delicatamente il tubo del microcentrifuge. Quindi, ripetere il passaggio 4.4.
7. Posizionare le microsfere sul vetrino (75 x 50 mm) e coprire con un foglio di alluminio prima di formazione immagine.

5. asimmetrica PCR per amplificare ssDNA

1. Preparare una miscela di reagenti PCR asimmetrica per amplificare ssDNA per essere analizzati. Scongelare i reagenti in tabella 4 su ghiaccio. Non tenere l'enzima polimerasi di Taq (50 U / µ l) sul ghiaccio, ma piuttosto conservare a-20 ° C fino a quando necessario.
2. Vortice di delicatamente tutti i reagenti e quindi brevemente Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 s.
3. Combinare tutti i reagenti come descritto tabella 4.
4. I campioni in un termociclatore e avviare la PCR asimmetrica nelle seguenti condizioni: 25 cicli (95 ° C per 30 s, 52 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s), 85 ° C per 5 min, tenere a 4 ° C.

6. microsfere-PCR per amplificare ssDNA

Nota: Questa sezione descrive il protocollo per l'amplificazione ssDNA in una provetta di reazione di PCR. Reazioni di microsfere-PCR sono state effettuate in 50 µ l di volume di reazione. Le sequenze dettagliate utilizzate per amplificare ssDNA sono elencate nella tabella 5. In questo caso, Ap sulla superficie di microsfere può tempri casuale modelli del DNA in modo complementare. Si tratta di un passo molto importante per la produzione di filamenti di DNA complementare (filo del DNA antisenso, Figura 3). Il DNA esteso è usato come un modello per l'amplificazione di PCR di microsfere.

1. Preparare la miscela reagente microsfera-PCR. Scongelare i reagenti in tabella 6 su ghiaccio; Tuttavia, non tenere l'enzima della polimerasi di Taq sul ghiaccio. Conservare a-20 ° C fino a quando necessario.
2. Vortice di delicatamente tutti i reagenti e quindi brevemente Centrifugare le provette a 10.000 x g per 10 s.
3. Ottenere circa ~ 25 microsfere attraverso conteggio al microscopio.
   Nota: Il numero delle microsfere in provetta di uno reazione vengono calcolato utilizzando un microscopio con ingrandimento 40x. Circa 25 ~ microsfere sono utilizzate per l'amplificazione di PCR di microsfere. Informazioni più dettagliate sono nel passaggio 3.
4. Combinare tutti i reagenti come descritto tabella 6.
5. I campioni in un termociclatore e avviare la PCR asimmetrica nelle seguenti condizioni: 25 cicli (95 ° C per 30 s, 52 ° C per 30 s e 72 ° C per 30 s), 85 ° C per 5 min, tenere a 4 ° C.
6. Amplificazione di seguente, aggiungere 8 μL di 6 x buffer di caricamento e caricare 15 µ l di ciascun campione in gel di agarosio al 2%. Quindi, eseguire l'elettroforesi a 100 V per 35 min in 1 x TAE (Tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8.2) buffer.

7. microscopio confocale acquisizione

Nota: I risultati dell'ibridazione della sonda di microsfere-DNA sono imaging sotto un microscopio confocale. Analisi dell'immagine viene eseguita utilizzando ImageJ.

1. Difficoltà ibridate microsfere sul palco del microscopio in un supporto.
2. Selezionare il laser (laser a Elio/Neon, 543 nm linea) e accenderlo a controllo laser.
3. Selezionare la lente dell'obiettivo nel controllo del microscopio.
4. Selezionare il filtro desiderato per Cy3 e canale a controllo di configurazione.
5. Iniziare l'esperimento e osservare il campione. Impostazioni per il microscopio confocale sono riassunti nella tabella 7.

Risultati

La piattaforma di fabbricato polimerici microfluidici basati su gocciolina è costituito da due strati PDMS (Figura 1a). Vengono utilizzati tre tipi di reti di canali microfluidici per la generazione di microsfere: geometria 1) flusso di messa a fuoco, come mostrato in Figura 1b, 2) un canale serpeggiante per miscelare la soluzione io e soluzione II e 3) un canale di polimerizzazione per microsfere solidificazione. L'altezza di t...

Discussione

Contaminanti di dsDNA sono un problema importante in ssDNA amplificazione. Rimane difficile minimizzare dsDNA amplificazione in convenzionale di amplificazione in PCR asimmetrica¹⁵. Inoltre, anche se miglioramenti tecnici per la generazione di ssDNA hanno permesso di aumentare l'efficienza di rendimento del campione, ssDNA isolamento è ancora problematico a causa di suoi alti costi e rendimenti di depurazione incompleta.

PCR asimmetrica è uno dei più impegnativi meto...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres