Ca2 + risposte di imaging durante l'infezione delle cellule epiteliali Shigella

Riepilogo

Qui, presentiamo protocolli per visualizzare le risposte di calcio (Ca^{2 +}) indotte dalle cellule HeLa infettate da Shigella. Ottimizzando i parametri di infezione batterica e di imaging con sonde Ca^{2 +} fluorescenti, atipico globali e locali Ca^{2 +} segnali indotti da batteri sopra una vasta gamma di cinetica di infezione sono caratterizzati.

Abstract

CA^{2 +} è un ione onnipresente coinvolti in tutti i processi cellulari conosciuti. Mentre global Ca^{2 +} le risposte possono influenzare il destino delle cellule, variazioni locali in Ca^{2 +} citosolico le concentrazioni libere, legate per rilasciare da negozi interni o un afflusso attraverso i canali della membrana plasmatica, regolano i processi delle cellule corticali. Gli agenti patogeni che aderiscono a o invadere host cellule grilletto una riorganizzazione del citoscheletro di actina sottostante la membrana plasmatica di host, che probabilmente colpisce sia globale che locale di Ca^{2 +} segnalazione. Perché questi eventi possono verificarsi alle basse frequenze in modo pseudo-stocastico sopra estesa cinetica, l'analisi del Ca^{2 +} segnali indotti da agenti patogeni solleva grandi sfide tecniche che devono essere affrontate.

Qui, segnaliamo i protocolli per la rilevazione di globale e locale Ca^{2 +} segnali su un'infezione di Shigella delle cellule epiteliali. In questi protocolli, manufatti legati ad un'esposizione prolungata e photodamage connesso con l'eccitazione di sonde Ca^{2 +} fluorescenti sono Troubleshooting controllando rigorosamente i parametri di acquisizione su periodi di tempo definiti durante un Shigella invasione. Le procedure vengono implementate per analizzare rigorosamente l'ampiezza e la frequenza di Ca^{2 +} segnali citosolici globali durante la cinetica di infezione estesa utilizzando la sonda chimica Fluo-4.

Introduzione

CA^{2 +} regola tutti i processi conosciuti delle cellule, tra cui la riorganizzazione del citoscheletro, le risposte infiammatorie e vie di morte cellulare relazionate al ospite-patogeno interazioni^1,2,3. In condizioni fisiologiche, basale concentrazioni Ca^{2 +} citosoliche sono basse, in alcune centinaia di nM, ma possono essere soggetti ad aumenti transitori dopo stimolazione agonista. Queste variazioni mostrano spesso comportamento oscillatorio attraverso l'azione delle pompe e canali alle membrane del reticolo endoplasmatico e del plasma. Il modello di queste oscillazioni si caratterizza per il periodo, la durata e l'ampiezza del Ca^{2 +} aumenta e viene decrittografato dalle cellule che, a loro volta, innescano risposte specifiche in quello che è noto come il Ca^{2 +} codice^4,5 . Un aumento marcato la concentrazione Ca^{2 +} citosolico in condizioni patologiche può portare alla morte cellulare connessa con la permeabilizzazione delle membrane mitocondriali e il rilascio di pro-apoptotici o necrotico fattori^{6, 7}.

Shigella, l'agente eziologico della dissenteria bacillare, invade le cellule epiteliali iniettando effettori nelle cellule ospiti utilizzando un tipo di secrezione di III (T3SS) sistema^8,9. Un'invasione di Shigella delle cellule dell'ospite è associata con Ca^{2 +} segnali locali e globali suscitati dalla T3SS. Per quanto riguarda poro-formare tossine, il Traslocone T3SS inserisce in membrane cellulari host e è necessario per l'iniezione di T3SS effettori è probabile responsabile dell'attivazione di PLC e la (1, 4, 5) l'inositolo trifosfato (InsP3)-dipendente Ca^{2 +} rilascio. La combinazione di stimolazione localizzata PLC e l'accumulo di actina polimerizzata in siti di un risultato di invasione di Shigella in un insolitamente lunga durata InsP3-dipendente Ca^{2 +} rilascio¹⁰. L'effettore III tipo IpgD, un fosfatidil 4,5 bifosfato (PIP2) -4-fosfatasi, limita la quantità di locale di PIP2, controllando così la quantità di substrato disponibile per PLC generare InsP3, che contribuisce al confino di locale Ca^{2 +} risposte all'invasione batterica siti^11,12. Questi Ca^{2 +} risposte locali probabile contribuiscono per la polimerizzazione dell'actina Shigella invasione siti¹⁰. Ca^{2 +} risposte globale che sono anche suscitate da Shigella, tuttavia, sono indispensabili per il processo di invasione batterica ma innescare l'apertura del connexin adenosina alla membrana del plasma e il rilascio di ATP in extracellulare vano. ATP rilasciato agisca in modo paracrino, a sua volta, stimola Ca^{2 +} oscillatorio responses in cellule accanto alla cellula infettata. IpgD è anche responsabile per la modellatura del global Ca^{2 +} le risposte nelle risposte erratiche isolate con dinamica lenta. Finalmente, dopo un'infezione batterica prolungata, IpgD conduce all'inibizione di InsP3-mediata di Ca^{2 +} segnali. Attraverso la sua interferenza con segnalazione di Ca^{2 +} , IpgD ritarda a Ca^{2 +}-dipendente calpaina attivazione che conduce lo smontaggio delle strutture di adesione focale e il distacco prematuro della infettato cellule¹³.

Mentre Ca^{2 +} segnali sono coinvolti in aspetti critici della patogenesi, l'uso di un microorganismo solleva una serie di sfide tecniche che non vengono rilevati negli studi classici agonista. I protocolli descritti qui utilizzano il comunemente usato fluorescente Ca^{2 +} indicatore chimico Fluo-4 che abbiamo progettato per caratterizzare il Ca^{2 +} segnali locali durante un'infezione Shigella . Passaggi critici per la rilevazione di questi segnali sono discusse, così come le procedure attuate per la loro analisi quantitativa necessarie per caratterizzare il ruolo di effettori batterici nella segnalazione di Ca^{2 +} .

Protocollo

1. preparati

1. Preparazione di batteri
   1. I batteri del piatto — ceppo selvaggio-tipoShigella esprimendo l'adesina AfaE (M90T-AfaE) — su un trypticase agar soia (TCS) piastra contenente 0,01% Congo rosso (CR) e li Incubare per 18 h a 37 ° C.
      Nota: Per aumentare la loro riproducibilità, le piastre di Shigella ottenute al passaggio 1.1.1 sono conservate a 4 ° C e devono essere utilizzate entro una settimana, perché tutte le colonie su supporto CR alla fine diventerà rosse nel corso del tempo.
   2. Inoculare TCS brodo di pre-coltura selezionando 3 colonie rosse dalle piastre striatura.
      Nota: Un'inoculazione con 3 colonie viene eseguita per limitare la probabilità di scegliere un singolo clone cui plasmide di virulenza ha subito una ricombinazione genetica.
   3. Crescere le colture batteriche liquide in un incubatore d'agitazione per 16 h a 37 ° C a 200 giri/min. Aggiungere ampicillina ad una concentrazione finale di 75 mg/mL. Le concentrazioni di antibiotiche non devono superare 3 x la concentrazione inibitoria minima, come un eccesso di antibiotico può portare alla perdita del plasmide di virulenza grande.
      Nota: La manutenzione del plasmide di virulenza di Shigella deve essere verificata da colture batteriche su piastre CR completati con concentrazioni di antibiotiche appropriate di placcatura. La presenza di colonie bianchi indica una perdita di plasmide.
   4. Inoculare la cultura TCS con la pre-coltura batterica ad una diluizione di 1: 100. Incubare a 37 ° C in un incubatore d'agitazione per 2 h a 200 giri/min. Garantire che la densità ottica a 600 nm (OD_600nm) è di 0,2 - 0,4.
   5. Centrifugare la coltura batterica per 2 min a 13.000 x g a 21 ° C e risospendere il pellet in un volume equivalente di mezzo EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, glucosio di 5 mM e 25 mM HEPES pH = 7.3).
   6. Diluire la sospensione batterica in un buffer di EM un finale OD_600nm di 0.1 e utilizzarlo da subito o conservarlo a 21 ° C e utilizzarlo entro i prossimi 60 min.
2. Preparazione delle cellule
   1. Cellule HeLa di cultura in DMEM con 1 g/L di glucosio completati con 10% siero fetale di vitello (FCS) e farle crescono a 37 ° C con 10% CO₂. Crescere TC-7 coltivate in DMEM con 4,5 g/L di glucosio, contenente 10% FCS e gli aminoacidi non essenziali in un incubatore a 37 ° C contenente 10% CO₂.
   2. Per la manutenzione delle cellule, dividere le celle regolarmente, per evitare un'inibizione di crescita-contatto collegata agli Stati confluenti; Questo è fondamentale per un'elevato Ca^{2 +} sonda caricamento/efficienza transfezione.
   3. Piastra di cellule HeLa sulla sterile 25 mm diametro circolare coprioggetti in piastre da 6 pozzetti ad una densità di 3 x 10⁵ cellule/pozzetto il giorno prima dell'esperimento per le cellule HeLa.
   4. Per cellule TC-7, tripsinizzano e contare le celle. Semi a 4 x 10⁵ cellule/pozzetto e incubare li 5-7 giorni a 37 ° C in un 10% CO₂-incubatore prima degli esperimenti per consentire una polarizzazione.
      1. Aggiornare il mezzo di coltura cellulare ogni giorno fino al giorno dell'esperimento.
         Nota: Chambers USA e getta di diametro 35 mm con fondo di vetro può anche essere utilizzato come alternativa ai pozzetti contenenti coprioggetti. Se questi ultimi sono utilizzati, controllo della temperatura attraverso un piatto riscaldato o obiettivo non è sufficiente, e una camera di incubazione termostato montato sul tavolino del microscopio è necessario.
3. Il giorno dell'esperimento, rimuovere il supporto e lavare le cellule 3 x con il mezzo di 1ml EM a 21 ° C.
4. Caricare le celle con 3mm Fluo-4am¹⁴ in un buffer di EM per 30 min a 21 ° C.
   Nota: Mentre il caricamento delle cellule HeLa Sub-confluenti non genera problemi principali, il caricamento di cellule polarizzate TC-7 è spesso eterogeneo e scarsamente efficiente. Per queste cellule, abbiamo trovato che l'efficienza di caricamento è migliorata con l'aggiunta dell'agente disperdente — pluronic acido — ad una concentrazione finale di 0,1% e l'anione-trasportatore inibitore bromosulfophtalein ad una concentrazione finale di 20 µM per il Fluo-4-AM-contenente EM. L'uso di raziometrici chimico sonde o geneticamente codificato-FRET sonde che richiedono dual-acquisizione non è compatibile con la velocità di acquisizione necessaria per l'imaging del locale Ca^{2 +} le risposte.
5. Lavare i campioni 3 x con EM buffer e ulteriormente li Incubare in 1 mL di tampone di EM a 21 ° C per consentire l'idrolisi della parte dell'AM. Uso Fluo-4 caricato cellule immediatamente o entro i prossimi 90 min (mantenuta a 21 ° C).

2. infezione e acquisizione di immagini di locale Ca^{2 +} risposte

1. Posizionare il vetrino coprioggetto contenente le celle di Fluo-4 caricato in una camera di imaging o con fondo di vetro camera. Lavare i campioni nella camera di imaging o USA e getta con fondo di vetro camera 3x con buffer di EM per rimuovere i composti potenzialmente derivanti da lisi cellulare. Aggiungere 1 mL di tampone di EM.
2. Posizionare la camera su un palcoscenico di microscopio di fluorescenza invertito riscaldato a 33 ° C.
   Nota: Questa temperatura è selezionata come un compromesso tra le temperature ottimali compatibili con il processo di invasione di Shigella e il rallentamento del Ca^{2 +} le risposte di visualizzare risposte locali. Usiamo un 63 X obiettivo a immersione in olio (NA = 1.25) dotati di anelli di contrasto di fase.
3. Selezionare un campo di microscopia e impostare i parametri di acquisizione, incluso il tempo di esposizione e binning se necessario, per ottimizzare il segnale fluorescente Fluo-4.
   Nota: Le principali sfide del locale Ca^{2 +} formazione immagine sono la bassa ampiezza e la piccola durata delle risposte, che richiedono acquisizione almeno ogni 30 ms più commercialmente disponibili retro-illuminato EM-CCD o C-MOS telecamere presentano la necessaria sensibilità per rilevare locale Ca^{2 +} risposte utilizzando Fluo-4. Sensibilità di rilevazione è anche una questione importante per limitare photodamage o manufatti quali risposte spontanee collegate all'eccitazione fluorescente di Fluo-4 ad alta frequenza. Qui, un'illuminazione basati su LED di 470 nm, con un filtro di eccitazione di 480 ± 40 nm passa-banda, un filtro dicroico 505 nm e un 527 emissione del passa-banda ± 30 nm usato al 5% della sua massima intensità combinata con un filtro a densità neutra 1,0 sono stati utilizzati per ridurre al minimo questi problemi sotto un flusso di acquisizioni di durata limitata. Un'analisi del Ca^{2 +} segnali locali di lotti di 120 flussi di s è stata effettuata ordinariamente. In queste condizioni di bassa illuminazione, fluoroforo photobleaching non è stata osservata durante le acquisizioni di min-flusso 2. Acquisizioni successive sullo stesso campione possono essere eseguite, condizione diversi campi sono utilizzati. Come regola generale, un primo flusso di acquisizione viene eseguito su un campo di controllo in assenza di stimolazione di batteri per garantire l'assenza di risposte spontanee. Se si osservano le risposte spontanee, i campioni sono lavati con un tampone di EM fino a quando non risposte sono osservate.
4. Per aggiungere i batteri al campione, rimuovere 500 µ l di tampone di EM dalla camera e aggiungere 500 µ l della sospensione batterica preparata al punto 1.1.6 per ottenere un finale OD_600nm di 0.05, con la cura adeguata per evitare di spostare il campo selezionato microscopia; i volumi di garantiscono una corretta miscelazione dei batteri e una distribuzione omogenea dei batteri su campioni di cellule.
5. Eseguire un'acquisizione su aggiunta batterica. In alternativa, eseguire un'acquisizione 10 min dopo l'aggiunta di batterico, che corrisponde al tempo necessario per i batteri di sedimento sulle cellule nelle circostanze usate. Alla fine del flusso acquisizione, acquisire un'immagine di contrasto di fase del campo selezionato per visualizzare i batteri a contatto con le cellule e il volant di membrana associato ai siti di invasione batterica.
6. Ripetere la procedura di acquisizione come descritto al punto 2.5, a intervalli che sono favorevoli alla durata delle acquisizioni di immagine, file risparmio e selezione di un nuovo campo per coprire l'intero processo.
   Nota: Per Shigella, abbiamo trovato che acquisizione flussi ogni 5 min per 20 min, seguendo la sedimentazione batterica di 10 min, ha permesso di coprire la maggior parte degli eventi invasione.
7. Al termine della procedura di acquisizione, è necessario aggiungere una concentrazione finale di 2 µM di Ca^{2 +} ionoforo ionomicina campioni per determinare la massima ampiezza di Ca^{2 +} segnali. Acquisire immagini ogni 3-5 s fino al segnale di stabilizzazione, di solito per meno di 10 min.
8. Seguire con l'aggiunta di Ca^{2 +} chelante EGTA ad una concentrazione finale di 10 mM per determinare il segnale di fluorescenza in assenza di Ca^{2 +}. Acquisire immagini ogni 3-5 s fino al segnale di stabilizzazione, di solito per meno di 10 min.
   Nota: A causa della relativamente lenta dinamica delle variazioni^{2 +} Ca globale, eseguire queste acquisizioni ogni 3-5 s (non in modalità streaming), permettendo per Ca^{2 +} imaging nello stesso campo microscopico durante i trattamenti successivi.

3. analisi

1. Rapidi^{2 +} variazioni di Ca citosolici nel tempo come la percentuale di ΔF/F₀, dove ΔF rappresenta la variazione dell'intensità di fluorescenza media della regione di interesse (ROI) e F₀ la fluorescenza di base nello stesso ROI, a cui un regione non rilevanti del campo privo di cellule viene sottratto.
   1. Rimuovere i livelli basali di fluorescenza per ogni cella in diversi campi, corrispondenti ai livelli basali; questi livelli possono essere determinati in modo non ambiguo a causa della bassa frequenza e relativamente di breve durata di Ca^{2 +} risposte locali in un'acquisizione di flusso specificato.
      Nota: Quantificare caratteristiche sorprendenti delle risposte relazionate alle domande poste e il modello patogeno studiato. Classicamente, vari parametri sono presi in considerazione per analizzare il Ca^{2 +} segnali, tra cui la frequenza delle cellule risultati locali o globali Ca^{2 +} risposte, così come la durata, ampiezza e frequenza di queste risposte. Nel caso di Shigella e risposte locali, un altro aspetto importante dell'analisi è l'associazione spaziale delle risposte con i siti di invasione batterica.
2. Per quantificare la percentuale di cellule rispondenti le risposte globali o locali, disegnare ROIs in cellule, nelle serie temporali corrispondenti alle variazioni di intensità di Fluo-4.
   1. Impostare parametri precisi per identificare locale Ca^{2 +} risposte, ad esempio un'ampiezza di variazioni dello sfondo sopra triplice della linea di base delle cellule di fluorescenza media intensità o una durata di almeno 200 ms, per evitare segnando un falso positivo.
      Nota: Come regola generale, anche i piccoli Ca^{2 +} risposte locali possono essere distinto da qualsiasi rumore di fondo dal loro profilo. Il ROIs dovrebbe essere sufficiente per integrare abbastanza segnali di fluorescenza per consentire la rilevazione delle variazioni locali. A seconda dell'intensità della rilevazione Fluo-4, questi ROIs può corrispondere a cerchi con diametri che vanno da 2-5 mM.
   2. Misurare le variazioni dell'intensità di fluorescenza di Fluo-4 media in 2 regioni in una zona distinta della cella stessa, per determinare se le risposte sono locali o globali.
      Nota: L'analisi di un gran numero di cellule è facilitato dall'uso di software che permette la visualizzazione on-line delle variazioni dell'intensità di fluorescenza media nel tempo per le regioni selezionate di imaging. Software di imaging disponibili in commercio ha una tale opzione, ma questo può essere eseguito anche utilizzando il freeware di Icy , utilizzando il plugin di ROI intensità Evolution .
   3. Determinare la percentuale di cellule che mostrano risposte locali.
      Nota: Questa percentuale è calcolata dal numero totale delle cellule analizzate nel campo della microscopia, che dovrebbe essere in numero sufficiente per supportare un statisticamente significato utilizzando un test non parametrico.
   4. Determinare la durata delle risposte locali.
      Nota: Locale Ca^{2 +} le risposte possono essere ulteriormente distinti secondo le loro gamme di durata (cioè, meno di 500 ms, tra 5 e 10 s, o superiore a 10 s) e la loro associazione con siti di invasione di Shigella .
3. Quantificare l'ampiezza delle risposte. In primo luogo, calibrare i Ca^{2 +} e delle cellule sfondo i livelli massimi determinati come descritto al punto 2.1.7. Poiché il carico di Fluo-4 può variare per ogni cella, è possibile eseguire queste determinazioni per le singole celle nel campo.
   1. L'ampiezza delle risposte si esprime come percentuale relativa della risposta massima.
   2. Eseguire il test statistico utilizzando un test di normalità, seguito da un test parametrico per analizzare le differenze di potenziale nell'ampiezza delle risposte tra i campioni.
   3. Determinare l'associazione di queste risposte riguardante i siti di invasione batterica dalla loro rispettiva localizzazione per il volant di membrana batterica-indotta visualizzati nelle immagini di contrasto di fase corrispondente.

Risultati

Invasione di Shigella è associato con atipico lunga durata Ca^{2 +} risposte locali:

A seguito del protocollo di cui sopra, le cellule HeLa Fluo-4-caricati sono state sfidate con WT Shigella e acquisizioni di flusso sono stati effettuati per analizzare segnali di Ca^{2 +} . Un esperimento rappresentativo è mostrato in Figura 1, con serie di time-lapse immagini dell'i...

Discussione

Questo manoscritto descrive il protocollo che abbiamo progettato per seguire Ca^{2 +} segnali locali durante la cinetica relativamente breve di un'invasione di Shigella , nonché global Ca^{2 +} le risposte durante la cinetica estesa di Shigella. Di seguito, chiave possono essere rilevati problemi che devono essere affrontate per ottimizzare l'individuazione di Ca^{2 +} segnali, riducendo al minimo qualsiasi interferenza con i processi biologici.

Chimica ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin