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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Dimostriamo di tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la visualizzazione di immunohistochemical di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.

Abstract

Periciti giocano un ruolo importante in molte malattie dell'occhio. Tecniche dei vasi retinici e microvascolare di macchiatura immunohistochemical periciti sono al centrali di ricerca oftalmologica. È fondamentale scegliere un metodo appropriato di visualizzare i pericytes microvascolari. Descriviamo retinica Pericita microvascolare immunoistochimica in cryo-sezioni, intero-monta e sistema vascolare isolato ipotonico usando gli anticorpi per β del ricevitore di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ) e l'antigene del nervo/glial 2 (NG2). Questo permette di evidenziare vantaggi e difetti di ciascuna delle preparazioni del tre tessuto per la visualizzazione dei periciti microvascolare. Cryo-sezioni forniscono transsectional visualizzazione di tutti gli strati retinici ma contengono solo qualche occasionale taglio trasversale del microvasculature. Intero-monta fornisce una panoramica dell'intero sistema vascolare retinico, ma la visualizzazione del microvasculature può essere fastidioso. Ipotonica isolamento fornisce un metodo per visualizzare l'intero sistema vascolare retinico tramite la rimozione delle cellule neuronali, ma questo rende il tessuto molto fragile.

Introduzione

Periciti sono al centro di molti laboratori di ricerca come queste cellule svolgono un ruolo importante nell'integrità del sistema vascolare. Condizioni patologiche quali retinopatia diabetica1, ischemia2e glaucoma3 hanno caratteristiche vascolari che coinvolgono la funzione di periciti. I periciti sono trovati in plessi capillari retinici interni. Arteria retinica centrale che fornisce i rami retina interna in due strati dei plexuses capillari. Il letto vascolare interno è situato tra la cellula del ganglio e strati interni di nucleare. Lo strato più profondo è più denso e complesso ed è localizzato tra lo strato nucleare interno ed esterno4,5. Inoltre, alcune parti della retina contengono anche una terza rete definita i capillari parapapillary radiale. Questi sono lunghi, dritti capillari che si trovano tra le fibre nervose e raramente anastomotizzare con un l'altro o gli altri due plessi6. All'interno della parete capillare, i periciti sono incorporati nella membrana dello scantinato e linea lato abluminale delle cellule endoteliali vascolari.

A questa data, esiste un marker biologico unico di questi periciti che possibile distinguerle da altre cellule vascolari. Β del ricevitore di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ) e l'antigene del nervo/glial 2 (NG2) sono comunemente utilizzati marcatori che entrambi presentano il pericytes ma anche altre cellule vascolari. Identificazione dei pericytes è ulteriormente complicata dall'esistenza di sottoinsiemi di periciti che variano nell' espressione della proteina e morfologia7. Attualmente, la migliore identificazione si basa su una combinazione di proteine marker e il posizionamento caratteristico del Pericita nella parete vascolare. Dimostriamo qui tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la macchiatura di immunohistochemical PDGFRβ/NG2 di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.

Con cryo-sezioni, la retina e la sclera sono tagliate attraverso il nervo ottico. Ciò consente la visualizzazione di tutte le strutture a strati di neuroni. I dieci strati distinti della retina sono evidenti come lo scambio di strutture nucleari e assonale/dendritiche che possono essere visualizzate con macchie quali ematossilina/eosina o fluorescente nucleare 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. I requisiti metabolici differiscono tra i livelli9 e si fornisce un metodo per determinare lo spessore o la totale assenza di un livello specifico (ad esempio, la perdita delle cellule ganglionari retiniche è uno dei tratti distintivi di ischemia retinica10, 11). Il sistema vascolare è evidente come attraverso la retina, rendendo possibile studiare separatamente i plexuses capillari all'interno i rispettivi strati retinici12,13tagli trasversali.

Più tradizionalmente, le indagini della rete sistema vascolare retinico sono effettuate in intero-monta retinica. Con questa preparazione del tessuto, la retina è tagliata e appiattita come una struttura a forma di fiore. Il metodo è una tecnica di preparazione del tessuto relativamente veloce che permette di evidenziare il vasculature retinico di architettura globale e pertanto è spesso applicato nell'inchiesta della neovascolarizzazione della retina murino. Visualizzazione successo del microvasculature in retine montato tutto è segnalato anche nel sviluppo neonatale topo e nel ratto retina14,15,16,17,18, 19. questi studi rivelano una più definita attività pericitica con grandi aree senza capillare nell'adulto rispetto al retina neonatale14.

Un altro modo di visualizzare è il microcircolo retinico dopo isolamento ipotonica. Questa tecnica di preparazione del tessuto si traduce in vasi sanguigni retinici e capillari viene liberati delle cellule neuronali. Questo tipo di rappresentazione bidimensionale della rete vascolare retinica isolata è solitamente eseguito dopo retinica tripsina digestione20 e utilizzato per valutare le anomalie vascolari della retinopatia diabetica, compreso perdita di periciti e capillare degenerazione20,21,22. Il metodo di isolamento ipotonico offre le indagini del gene vascolare retinica e risposte normative proteina come è stato fatto con RT-PCR e western blotting23,24,25. Forniamo qui un protocollo per la macchiatura di immunohistochemical di flottante del vasculature retinico isolato ipotonico come alternativa alla digestione della tripsina per esaminare i pericytes microvascolari.

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Protocollo

Il protocollo è stato ottimizzato e dimostrato su ratti adulti maschii dell'albino. In tutte le procedure sperimentali, gli animali sono stati trattati secondo la normativa l'ARVO istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research. Gli animali sono stati eutanasizzati di biossido di carbonio e successiva dislocazione cervicale.

1. ratto tessuto retinico preparazioni

  1. Cryo-sezione
    1. Rendere ~0.5 anteriori e posteriori fessure cm nella palpebra del ratto con un bisturi.
      1. Opzionale: Utilizza un bruciatore di diatermia, contrassegnare l'occhio l'angolo interno per orientare l'occhio in modo uniforme durante l'incorporamento e consentire per il sezionamento di criostato verticale tramite il nervo ottico.
    2. Afferrare l'occhio con il forcipe e inclinare con attenzione al lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con le forbici di dissezione nel tessuto muscolare e connettivo.
      Attenzione: Non tirare troppo l'occhio come eccessiva pressione sul nervo ottico può causare il distacco della retina.
    3. Mettere l'occhio brevemente in formaldeide 4% in tampone fosfato salino (PBS) per stabilizzare prima di effettuare un foro iniziale al limbus corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi.
    4. Sotto un microscopio, tagliato lungo il limbus cornea con le forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con il forcipe prima dell'immersione in formaldeide 4% in PBS per 2 – 4 h.
    5. Sciacquare in modo sequenziale in tampone fosfato di Sörensen con saccarosio di 10% e 25% di saccarosio.
    6. Incorporare nel mezzo di Yazulla preparato con 3% di gelatina da porcino pelle e 30% albumina da bianco d'uovo di pollo.
      Nota: Il protocollo può essere sospesa qui con deposito di tessuto a-20 ° C.
  2. Intero-monta
    1. Rendere ~0.5 posteriori ed anteriori cm fessure nella palpebra del ratto con un bisturi.
    2. Afferrare l'occhio con il forcipe e inclinare con attenzione al lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con le forbici di dissezione nel tessuto muscolare e connettivo.
      Attenzione: Non tirare troppo l'occhio come eccessiva pressione sul nervo ottico può causare il distacco della retina.
    3. Mettere l'occhio brevemente in formaldeide 4% in PBS per stabilizzare prima di effettuare un foro iniziale al limbus corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi.
    4. Sotto un microscopio, tagliare lungo il limbus cornea con le forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con il forcipe.
    5. Separare la retina dall'epitelio retinico del pigmento verso il nervo ottico con il forcipe con movimenti di piccola apertura per evitare di strappare principali.
    6. Gratis la retina al nervo ottico con forbici di dissezione e fare quattro fessure di pochi millimetri lunghezza dalla periferia retinica verso la testa del nervo ottico.
    7. Diffondere la retina su un vetrino e lasciare asciugare per 5 – 10 min.
    8. Difficoltà in formaldeide 4% per 20-30 min di sgocciolatura formaldeide sulla retina.
      Attenzione: Non applicare direttamente sulla retina, come può staccare dal vetro.
    9. Risciacquare con PBS. Per ottenere risultati ottimali, immuno-macchia direttamente dopo il risciacquo.
  3. Isolamento ipotonica
    1. Rendere ~0.5 posteriori ed anteriori cm fessure nella palpebra del ratto con un bisturi.
    2. Afferrare l'occhio con il forcipe e inclinare con attenzione al lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con le forbici di dissezione nel tessuto muscolare e connettivo.
      Attenzione: Non tirare troppo l'occhio come eccessiva pressione sul nervo ottico può causare il distacco della retina.
    3. Fare un foro iniziale al limbus corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi.
    4. Sotto un microscopio, tagliare lungo il limbus cornea con le forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con il forcipe.
    5. Separare la retina dall'epitelio retinico del pigmento verso la testa del nervo ottico con il forcipe con movimenti di piccola apertura per evitare di strappare principali.
    6. Gratis la retina al nervo ottico con forbici di dissezione, collocare la retina in 1 mL di acqua deionizzata in una piastra a 24 pozzetti e agitare a 200 giri/min con un'orbita di vibrazione di 1,5 mm per 1 h a temperatura ambiente.
      Nota: Qui di seguito, verrà visualizzato la retina che meno definiti ai bordi.
    7. Aggiungere 200 U dnasi 1 per dissociare i detriti di lisato cellulare dal sistema vascolare retinico e agitare per un altro 30 min a temperatura ambiente.
      Nota: Detriti potrebbero iniziare a forma nei pozzetti.
    8. Sciacquare almeno 3 volte in acqua deionizzata per 5 minuti con agitazione a 150 – 300 giri/min per rimuovere i detriti di un neurone delle cellule. La retina dovrebbe diventare più trasparente con ogni risciacquo indicativo della rimozione di detriti cellulari neuronali.
      1. Utilizzare uno sfondo scuro per esaminare la piastra 24 pozzetti di vedere chiaramente il vasculature retinico isolato diafano.
      2. (Facoltativo): se il sistema vascolare non è gratis di un neurone strati (semi-trasparente) a questo punto o aggiungere ulteriori passaggi di risciacquo, aumentare la velocità di agitazione o utilizzare una pipetta per aspirare il liquido sul sistema vascolare.
        Attenzione: I passaggi facoltativi possono danneggiare il sistema vascolare.
    9. Difficoltà 10 min in 1 mL di paraformaldeide al 4% in PBS a temperatura ambiente e risciacquo 3 volte in PBS.
      Nota: Il protocollo può essere sospesa qui con deposito di tessuto a 4 ° C.

2. esame immuno-istochimico

  1. Macchiatura di cryo-sezioni
    1. Tagliare 10 µm cryo-sezioni della retina gelatina-incastonati come sezionamento verticale tramite il nervo ottico e la cryo-sezioni su un vetrino e lasciare asciugare (minimo 1 h).
    2. Immergere il vetrino in PBS con 0,25% Triton X-100 (PBS-T) per 15 min.
    3. 1: 100 PDGFRβ e gli anticorpi primari di 1: 500 NG2, diluiti in PBS-T + 1% BSA sulla cryo-sezione a goccia e incubare in camere di incubazione a 4 ° C durante la notte.
    4. Immergere il vetrino 2 volte in PBS-T per 15 min e 1: 100 anticorpi anti-topo Alexa Fluor 594-linked e 1: 100 anti-coniglio FITC-collegato secondari diluiti in PBS-T con 3% BSA su cryo-sezioni a goccia.
    5. Incubare il vetrino 1 h a temperatura ambiente al buio.
    6. Sciacquare il vetrino in PBS-T 2 x 15 min.
      Nota: Facoltativo: per la macchiatura immunofluorescente doppie e triple, macchiatura sequenziale può essere eseguita ripetendo la procedura dal 2.1.3 a 2.1.6 due e tre volte, rispettivamente.
    7. Montare il cryo-sezioni macchiate con anti-affievolimento montaggio medio contenente DAPI e un vetrino coprioggetti.
  2. Macchiatura del intero-supporto
    1. Coli di PBS-T sull'intero-monta e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Versare fuori e gocciolamento 1: 100 PDGFRβ e gli anticorpi primari di 1: 500 NG2, diluiti in PBS-T + BSA 1% e incubare in camera umida a 4 ° C durante la notte.
    3. Versare fuori e gocciolare su PBS-T a sciacquare il vetrino in 2 x 15 min.
    4. Versare fuori e gocciolare su 1: 100 anti-coniglio Cy2 - e 1: 100 anti-Cy3-collegato secondario anticorpo diluito in PBS-T con 3% BSA per Incubare 1h in una camera umida a temperatura ambiente al buio.
    5. Versare fuori e gocciolare su PBS-T a sciacquare in 2 x 15 min al buio.
      Nota: Facoltativo: per la macchiatura immunofluorescente doppie e triple, macchiatura sequenziale può essere eseguita ripetendo la procedura da 2.2.2 a 2.2.5 due e tre volte, rispettivamente.
    6. Montare l'intero-monta macchiato con anti-affievolimento montaggio medio contenente DAPI e un vetrino coprioggetti.
  3. Macchiatura del vasculature isolato ipotonica
    1. Bloccare il vasculature isolato ipotonico 1h con agitazione a 100 rpm e temperatura con 500 µ l/pozzetto di 10% di siero di asino diluito in PBS.
    2. Incubare per una notte a temperatura ambiente e agitare a 100 rpm con 600 µ l/pozzetto di 1: 100 PDGFRβ e 1: 500 NG2 anticorpi primari diluiti in siero di 10% asino in PBS.
    3. Risciacquo retinico 3x in PBS per 5 min di rete ed incubare 1: 100 anticorpi anti-topo Alexa Fluor 594-linked e 1: 100 anti-coniglio FITC-collegato secondari diluiti con 10% siero di asino in PBS agitazione a 100 rpm e temperatura ambiente per 1 h al buio.
    4. Risciacquare in PBS-T per 5 min e incubare a 0,2 ng/mL DAPI in PBS-T seguita da risciacqui 3 x 5 min in PBS-T al buio per 15 min.
    5. Tagliare la punta di una pipetta di Pasteur plastica, inumidirlo con PBS-T e utilizzarlo per trasferire la rete retinica a una diapositiva di alloggiamento vetro 4 pozzetti.
      Nota: Il passaggio d'inumidimento è importante evitare il vasculature retinico che attacca all'interno della pipetta Pasteur.
    6. Aprire completamente il sistema vascolare retinico. Evitare di toccare il vasculature retinico con il forcipe come questo può causare il sistema vascolare a groviglio.
      Nota: Svolgimento può essere fatto inclinando il vetrino camera avanti e indietro o aspirando le gocce di liquido sul sistema vascolare retinico.
    7. Rimuovere il supporto dai pozzi. La tensione superficiale del liquido si appiattiscono il vasculature sulla parte inferiore della diapositiva.
    8. Garantire il corretto dispiegarsi sotto un microscopio prima di rimuovere la plastica pozzi dalla diapositiva camera.
    9. Montare il vasculature macchiato con mezzo di montaggio anti-sbiadimento e un vetrino coprioggetti.

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Risultati

I protocolli di successo forniscono tre diverse preparazioni della retina per la visualizzazione di periciti microvascolari. Ciascuno di questi metodi utilizza la PDGFRβ e NG2 immunoreactivity co-localizzazione e la posizione unica dei pericytes che avvolgono l'endotelio capillare identifiicazione.

Con cryo-sezioni, gli strati di un neurone possono essere identificati dalla densità fluorescente dei nuclei DAPI-etichettati e in...

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Discussione

Presentiamo tre tecniche di preparazione della retina che possono essere applicate nello studio dei periciti microvascolari. Qui di seguito, forniamo un confronto tra ciascuno dei metodi ed evidenziare passi critici nei protocolli.

Con cryo-sezionamento, la retina è tagliata in sezioni sagittali e quindi, è possibile ottenere numerosi esemplari dalla retina stessa. Le sezioni numerale derivanti da questo metodo lo rendono la scelta ideale per la specificità dell'anticorpo e titolazione test...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

La ricerca è stata finanziata dalla Fondazione Lundbeck, Danimarca.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Geletin from porcine skinSigma-AldrichG2625-500G
Albumin from chicken egg whiteSigma-AldrichA5253-500G
Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreasSigma-AldrichD5025-15KUDissolved in 0.15 M NaCl
Bovine serum albumin (BSA)VWR0332-100G
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121, lot 129348
Rabbit anti-PDGFRβSanta Cruzsc-4321:100
Mouse anti-NG2Abcamab500091:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch711-585-1521:100
Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-095-1511:100
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-225-1521:100
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch715-165-1501:100
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGDissolved in DMSO
Anti-fading mounting mediumVector LaboratoriesH-1000
Anti-fading mounting medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slideThermo Fisher Scientific154526

Riferimenti

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