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  • Riepilogo
  • Abstract
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  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Idrogeli di ingegneria della proteina ricombinanti sono vantaggiosi per la coltura cellulare 3D poiché consentono completa accordabilità della catena polimerica e di conseguenza, il microambiente delle cellule. Qui, descriviamo il processo di purificazione della proteina ricombinante elastino-simili e la sua applicazione in incapsulamento cella 3D idrogel.

Abstract

Tecniche di coltura tissutale (2D) bidimensionali sono stati essenziali per la nostra comprensione della biologia delle cellule fondamentali. Tuttavia, la mancanza di sistemi di coltura del tessuto 2D tradizionale una matrice tridimensionale (3D), risultante in un significativo scollamento tra risultati raccolti in vitro e in vivo. Per risolvere questa limitazione, i ricercatori hanno creato piattaforme di coltura del tessuto 3D idrogel che possono imitare le proprietà biochimiche e biofisiche del microambiente delle cellule in vivo . Questa ricerca ha motivato la necessità di sviluppare materiale piattaforme che supportano incapsulamento cella 3D e analisi biochimiche a valle. Ingegneria delle proteine ricombinanti offre un unico set di strumenti per disegno materiale idrogel 3D e sviluppo, consentendo il controllo specifico di sequenza della proteina e quindi, per estensione, le potenziali proprietà meccaniche e biochimiche della risultante matrice. Qui, presentiamo un protocollo per l'espressione di recombinantly-elastina-come proteina derivata (ELP), che può essere utilizzato per forma idrogel con proprietà meccaniche regolabili in modo indipendente e concentrazione del ligando delle cellule-adesivo. Presentiamo inoltre una metodologia per l'incapsulamento di cellule all'interno di ELP idrogeli e macchiatura immunofluorescente successive di embedded cellule per analisi a valle e la quantificazione.

Introduzione

Durante il secolo passato, coltura del tessuto bidimensionale (2D) è sviluppato in un set di strumenti integrato per lo studio della biologia fondamentale delle cellule in vitro. Inoltre, i protocolli relativamente basso costo e semplici per la coltura cellulare 2D hanno condotto alla sua adozione attraverso molte discipline biologiche e mediche. Tuttavia, ricerca passata ha dimostrato che le tradizionali piattaforme 2D possono portare a risultati che si discostano sensibilmente da quelli raccolti in vivo, causando tempo prezioso e finanziamenti sprecati per ricerca clinicamente orientata1,2, 3. Noi ed altri suppongono che questa discrepanza può essere attribuita alla mancanza di nativi biochimiche e biofisiche spunti forniti per le cellule coltivate su superfici 2D, che possono essere necessarie per la proliferazione ottimale e maturazione dei vari tipi di cellule.

Per risolvere queste limitazioni e aiuto ponte il divario tra 2D in vitro e in vivo gli studi, i ricercatori hanno sviluppato idrogel tridimensionale (3D) piattaforme per cellulari-incapsulamento1,4,5 ,6. Idrogeli sono materiali ideali per ricapitolare il microambiente endogeno della matrice extracellulare (ECM) in vivo a causa di loro proprietà meccaniche del tessuto-come e struttura gonfio d'acqua che consente il rapido trasporto di nutrienti e segnalazione fattori7,8. Inoltre, idrogeli 3D possono essere progettati per avere controllo indipendente sulle proprietà meccaniche e biochimiche dell'impalcatura. Sia matrice meccanica9,10,11,12 e ligandi cellulari-adesivo13,14,15 sono ben noti per influenzare la cella comportamento in vitro e in vivo. Così, idrogeli 3D con proprietà sintonizzabile offrono una piattaforma per studiare le relazioni causali tra cellule e loro microambiente. Criteri per una matrice di idrogel 3D ideale includono semplice, non citotossica delle cellule-incapsulamento come pure accordabilità indipendente di proprietà meccaniche fisiologicamente rilevanti e mimici di nativi cella-adesivo motivi.

Entrambi sintetico (ad es., polietilenglicole, acido polilattico, poli (acido glicolico)) e di derivazione naturale (ad es., alginato, collagene, Matrigel) idrogeli presentano vantaggi rispetto 2D in vitro piattaforme di cultura; Tuttavia, essi hanno anche notevoli lacune che limitano la loro applicabilità. Primo, molte piattaforme di derivazione naturale e sintetiche richiedono condizioni di reticolazione duro che possono essere potenzialmente tossiche per le cellule di mammiferi, che porta alla diminuzione di attuabilità delle cellule7. Inoltre, molte piattaforme sintetici mancano nativa bioattività e bisogno di essere funzionalizzate attraverso reazioni chimiche secondarie, che possono aggiungere maggiore costo e complessità16. Infine, mentre materiali di derivazione naturale contengono tipicamente intrinseche bio-attivi domini, essi sono spesso afflitti da un'elevata variabilità lotto e spesso sono limitate a formare gel relativamente debole7,17.

Ingegneria delle proteine ricombinanti presenta un unico set di strumenti per la progettazione di materiali consentendo controllo esplicito sulla sequenza della proteina e, per estensione, le potenziali proprietà meccaniche e biochimiche dell'idrogel finale dell'impalcatura18. Inoltre, sfruttando il ben nota macchine biologiche di Escherichia coli (Escherichia coli) per esprimere proteine, materiali possono essere prodotto in modo conveniente e coerente con la variabilità limitata inter - e intra-batch. La proteina elastina-come (ELP) presentata qui ha tre domini ingegnerizzati: (1) un tag T7 e His6 che consente per etichettatura tramite fluorescente contrassegnati gli anticorpi, (2) una regione 'elastin-like' che conferisce proprietà meccaniche elastiche e consente per l'industria chimica reticolazione e (3) una regione 'bio-attivi' che codifica per motivi di cella-adesivo.

Nostra regione di elastina-come si basa sulla canonica sequenza di elastina (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 dove quattro dei 'Xaa' siti dell'amminoacido isoleucina (Ile), ma potrebbero essere progettato per essere qualsiasi amminoacido ad eccezione della prolina. Questa sequenza dota ricombinante ELPs con comportamento di temperatura (LCST) soluzione critica inferiore che può essere sfruttata per post-l'espressione purificazione semplice via19,20di cicli termici. Questa proprietà LCST può essere sintonizzata per termicamente aggregato a temperature diverse modificando l'ospite 'Xaa' residuo21,22.

Qui, la posizione di 'Xaa' su una delle cinque ripetizioni elastina-come è stata sostituita con la presentazione di ammina lisina (Lys) dell'aminoacido, che è utilizzata per la reticolazione di idrogel. Il nostro lavoro precedente ha indicato non citotossica e robusto reticolazione tramite reazione con l'ammina-reattivo crosslinker tetrachis (idrossimetil) fosfonio cloruro (THPC)23. Di varie proteine contenuti e crosslinker concentrazione complessiva, siamo in grado di produrre idrogel che può essere sintonizzato per estendersi su una rigidità fisiologicamente rilevanti gamma (~0.5-50 kPa)9,23,24. Oltre alle proprietà meccaniche di tuning, cellula adesione all'interno dei risultati di idrogel dall'integrazione dei domini canonici di cella-adesivo all'interno la spina dorsale della proteina ELP. Ad esempio, l'incorporazione di estesa fibronectin-derivato 'RGDS' sequenza dell'amminoacido permette delle cellule adesione e flessibilità conformazionale, mentre le uova strapazzate, variante di 'RDGS' non vincolante limita di adesione cellula-matrice24. Modulando il rapporto di cella-adesivo non adesivo proteine come pure la concentrazione nella proteina totale, siamo in grado di produrre in modo efficace gli idrogel che abbracciano una vasta gamma di concentrazione del ligando. Resultantly, abbiamo sviluppato una piattaforma di idrogel con proprietà biochimiche e biofisiche disaccoppiate, che può essere regolato in modo indipendente per coltura ottima 3D di vari tipi cellulari.

Oltre alla matrice di rigidezza e accordabilità legante adesivo, ricombinante idrogel offrono la possibilità di profili di degrado del materiale specifico design, che è necessaria per la diffusione delle cellule, la proliferazione e la migrazione all'interno di un contesto 3D4 , 9. questo degrado è garantito dalla secrezione delle cellule delle proteasi che si rivolgono specificamente elastina-come sequenza25o estesa 'RGDS'9 . ELP idrogeli inoltre sono stati indicati per sostenere le successive analisi biochimiche che sono necessari per lo studio di attuabilità delle cellule e la funzione compreso immunocytochemistry così come estrazione di DNA/RNA/proteine per inversione quantitativa reazione a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) e Western blot9. ELP varianti inoltre sono stati usati in un certo numero di modelli in vivo e sono noti per essere tollerato dal sistema immunitario26.

Presi insieme, ELP come una piattaforma di materiale per gli studi delle cellule-incapsulamento vanta una vasta gamma di vantaggi rispetto alle piattaforme di materiale sintetiche o di derivazione naturale, che spesso non hanno lo stesso grado di accordabilità biochimiche e biofisiche e riproducibilità. Inoltre, non citotossica un di ELP uso semplice e con un'ampia varietà di tipi cellulari (ad es., pulcino radice dorsale dei gangli14,24, progenitrici neurali murini cellule9, cellule staminali mesenchimali umane27, bovino condrociti neonatale28, human endothelial cells29,30) consente per un modello più fisiologicamente rilevante del ECM 3D endogeno rispetto alla coltura delle cellule 2D. Qui, presentiamo un protocollo per l'espressione di recombinantly-derivati, ELPs per l'uso come una piattaforma di idrogel sintonizzabile per 3D cell incapsulamento. Vi presentiamo ulteriormente la metodologia per l'etichettatura fluorescente downstream e microscopia confocale delle cellule incapsulate.

Protocollo

1. protocollo di espressione ELP

  1. Giorno 1: Cresce la colonia di avviamento
    1. Preparare le piastre di agar di ampicillina e cloramfenicolo in autoclave 25 g di Luria brodo e 15 g di agar per 1 L di acqua ultrapura. Una volta che la soluzione è raffreddata a ~ 60 ° C, aggiungere 1 mL di brodo di ampicillina (100 mg/mL in acqua ultrapura) e 1 mL di brodo di cloramfenicolo (34 mg/mL di etanolo al 70%) a 1 L di soluzione di agar per concentrazioni finali di 100 µ g/mL e 34 µ g/mL , rispettivamente. Trasferire 20 mL di soluzione finale per 10 cm di Petri con una pipetta sierologica e consentire l'agar solidificare. Avvolgere le capsule di Petri con parafilm e conservare a 4 ° C.
      Nota: capsule di Petri può essere memorizzato a 4 ° C fino a due settimane.
    2. Striscia un piccolo campione di BL21 (DE3) pLysS e. coli da uno stock di batterico pre-fatto che contiene un vettore pET15b codifica l'ELP di interesse su una piastra di agar di ampicillina e cloramfenicolo.
      Nota: L'ampicillina e cloramfenicolo selezionare per batteri contenenti vettori sia la pET15b e pLysS, rispettivamente.
    3. Posizionare la piastra striata testa in giù in un incubatore a 37 ° C. Consentire le colonie batteriche a crescere durante la notte.
      Nota: Non Incubare le piastre per più di 16 h come ampicillina si degrada e si possono formare le colonie che non trasportano resistenza all'ampicillina.
  2. Giorno 2: Preparazione dei media di cultura ed espressione di avviamento
    1. Rimuovere la coltura di Escherichia coli dall'incubatrice. Parafilm la piastra e negozio per un massimo di 4 giorni a 4 ° C.
    2. Preparare un matraccio di cultura starter (250 mL) e matracci di cultura di espressione (12 x 1 L) e autoclave. Per 1 L di expression media, aggiungere 47,6 g di brodo formidabile e 4 mL di glicerolo a 1 L di acqua distillata in un matraccio di cultura sconcertato 2L e tappo con foglio di alluminio.
      Nota: Rendimenti tipici sono 60-100 mg/L proteina di expression media.
    3. Caricare il dispositivo d'avviamento in autoclave in pre-riscaldato, incubatore agitazione a 37 ° C ed incubare senza agitazione.
    4. Aggiungere 250 µ l di brodo di sterile filtrata (filtro di 0,22 µm) ampicillina (100 mg/mL in acqua ultrapura) per la coltura starter per una concentrazione finale di 100 µ g/mL. Iniziare immediatamente agitando la coltura starter a 250 giri/min.
      Nota: Cloramfenicolo è utilizzato solo per la selezione di Colonia su piastre di agar e per colture liquide non è incluso.
    5. Inoculare la coltura starter con l'aggiunta di una singola colonia di e. coli plasmide contenente ELP dalla piastra striata e consentire la coltura starter scuotere a 37 ° C per 16 h.
    6. Posizionare il supporto di cultura espressione boccette in pre-riscaldati, 37 ° C in agitazione incubatori e incubare per una notte senza agitazione affinché le beute sono pronte inoculare la mattina successiva.
  3. Giorno 3: Inducendo l'espressione della proteina in e. coli
    1. Fare magazzino fresco, filtrato sterile ampicillina (100 mg/mL in acqua ultrapura). Aggiungere 1 mL di brodo di ampicillina per ogni beuta di expression media per una concentrazione finale di 100 µ g/mL.
    2. Iniziare agitando i mezzi di espressione a 250 giri/min.
    3. Prelevare un campione di 2 mL di media da ogni boccetta di espressione e aggiungere una cuvetta come uno spazio vuoto per una densità ottica di lettura a 600 nm (OD600).
    4. Al termine dell'incubazione di cultura starter 16h, inoculare ciascuna beuta espressione trasferendo 20 mL della coltura starter ad ogni boccetta di espressione tramite una pipetta sierologica.
    5. Dopo il completamento dell'agitazione di 1h, misurare il OD600 di uno dei palloni espressione. A seguito di questo passaggio, misurare il OD600 ogni 20 min, verificando un pallone diverso ogni volta.
    6. A un OD600 di 0,6, ridurre la temperatura degli shakers contenente le beute di espressione a 32 ° C.
    7. Verifica il OD600 ogni 10 min. A un OD600 di 0,8, inducono l'espressione aggiungendo 1 mL di 1 M, sterile filtrata β-isopropil thiogalactoside (IPTG) nell'acqua ultrapura per ciascuna beuta di espressione.
    8. Consentire l' e. coli in boccette di espressione esprimere per 7 h.
    9. 20 min prima della fine dell'espressione, pre-raffreddare una centrifuga di grande piano a 4 ° C.
    10. Raccogliere tutti i 12L di expression media in equilibrio e individuali dei recipienti.
    11. Centrifugare i mezzi di espressione al > 12.000 x g per 15 min a 4 ° C, utilizzando una centrifuga di piano.
    12. Versare il sovranatante da ciascun contenitore centrifuga. Con una spatola, raccogliere le palline delle cellule in un sacchetto a chiusura zip pre-pesati.
    13. Risospendere il pellet in sterile filtrata dieci buffer (100 mL di tampone per 25 g di pellet) e rimuovere eventuali bolle d'aria in eccesso da massaggiare il pellet. Per 1 L di tampone dieci, aggiungere 5,8 g di cloruro di sodio, 1,21 g di tris base e 0,37 g di disco sale acido etilendiammina etilendiamminotetraacetico (EDTA) sodio dibasico diidrato a 900 mL di acqua ultrapura. Aggiustare il pH a 8.0 e portare a 1 L. Per questo passaggio, strisce pH sono sufficienti.
    14. Posizionare il sacchetto a chiusura lampo contenente il pellet cellulare risospeso in un contenitore secondario e congelare a-80 ° C durante la notte.
  4. Giorno 4-6: rottura della parete cellulare batterica tramite cicli di gelo-disgelo
    1. Rimuovere il pellet congelato dal congelatore e lasciarla scongelare lentamente a 4 ° C con agitazione delicata utilizzando un agitatore orbitale.
    2. Lasciar scongelare fino a quando un po' di liquido è presente il pellet. Aggiungi ~ 30-40 mg di desossiribonucleasi I (DNasi) a scongelati lisato. Inoltre, è possibile aggiungere 1 mL di fenilmetilsufonilfluoruro di 100 mM (PMSF; un inibitore della proteasi) in isopropanolo 100 millilitri di lysate delle cellule. Consentire il lisato di scuotere durante la notte.
      Nota: Aggiunta la DNasi e PMSF è necessaria solo per il primo ciclo di congelamento-scongelamento.
      Attenzione: PMSF è tossico se inalato. Una maschera facciale deve essere utilizzata durante la manipolazione della polvere PMSF.
    3. Una volta che il lisato cellulare è completamente sciolto, congelare il lisato a-80 ° C durante la notte, o fino a quando completamente congelato.
    4. Ripetere la procedura di congelamento-scongelamento per un totale di tre cicli. Lasciare il lisato scongelati a 4 ° C dopo l'ultimo gelo-disgelo. Memorizzare 100 µ l di crudo lisato per sodio dodecil solfato-poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) analisi al termine della purificazione.
    5. Dopo il disgelo ultimo, regolare il pH della scongelati lisato 9.0 utilizzando 1 M NaOH. Per questo passaggio, strisce pH sono sufficienti. Incubare a 4 ° C per almeno 1 h (durante la notte è appropriato) su agitatore orbitale.
  5. Giorno 7-9: purificazione di ELP attraverso cicli termici spin freddo e caldo
    1. Raffreddare la centrifuga di piano a 4 ° C 20 min prima della centrifugazione.
    2. Aliquotare ed equilibrio lo scongelati lisato in recipienti della centrifuga.
    3. Centrifugare i campioni a > 15.000 x g per 1 h a 4 ° C. Dopo il completamento della purificazione, conservare 100 µ l del surnatante per analisi SDS-PAGE.
      Nota: Dopo la centrifugazione, la proteina ELP dovrebbe rimanere nel surnatante a causa della sua elevata solubilità in acqua a temperature inferiori a sua LCST (< 32 ° C).
    4. Trasferire il surnatante a nuovo dei recipienti e bilanciare in modo appropriato.
    5. Aggiungere cloruro di sodio (NaCl) in tre parti ad una concentrazione finale di 1 M (5,84 g di NaCl per ogni 100 mL di surnatante). Verificare che il NaCl è aggiunto in tre parti per consentire per dissoluzione sufficiente.
    6. Agitare per 3 h a 37 ° C a 250 rpm in un incubatore d'agitazione.
    7. 1 h prima della fine dell'agitazione, pre-riscaldare una centrifuga di piano a 37 ° C.
    8. Centrifugare a > 15.000 x g per 1 h a 37 ° C. Dopo il completamento di purificazione conservare 100 µ l del surnatante per analisi SDS-PAGE e scartare il surnatante rimanente.
      Nota: Dopo centrifugazione, la proteina ELP dovrebbe essere pellettata a causa della sua bassa solubilità in acqua a temperature superiori a sua LCST (> 32 ° C).
    9. Risospendere il pellet con l'aggiunta di 10 mL di acqua ultrapura, sterilizzato nell'autoclave per 1 g di pellet. Utilizzare una spatola di metallo per schiacciare la pallina per facilitare la dissoluzione della proteina.
    10. Regolare il pH della scongelati lisato 9.0 utilizzando 1 M NaOH. Per questo passaggio, strisce pH sono sufficienti.
    11. Agitare durante la notte a 4 ° C su agitatore orbitale.
    12. Ripetere la procedura di ciclismo termica spin caldi e freddi per un totale di tre cicli (cioè., ripetere i passaggi da 1.5.1 attraverso 1.5.11 per tre cicli totali).
  6. Giorno 10-15: ELP dialisi e liofilizzazione
    1. Centrifuga risospeso in una centrifuga pre-refrigerata a > 15.000 x g per 1 h a 4 ° C. Dopo il completamento della purificazione, conservare 100 µ l del surnatante per analisi SDS-PAGE.
    2. Dissalare la soluzione della proteina di dialisi il surnatante rimanente in una membrana di dialisi di 3,5 kDa contro 4 L di acqua ultrapura pre-refrigerato a 4 ° C. Cambiare l'acqua di dialisi due volte al giorno per un totale di 6 volte in 3 giorni.
      Nota: I volumi surnatante tipici sono tra 5 e 30 mL.
    3. Centrifugare la soluzione dializzata in una centrifuga pre-raffreddata a > 15.000 x g per 1 h a 4 ° C. Memorizzare 100 µ l del surnatante per analisi di SDS-PAGE alla fine della purificazione.
    4. Congelare il risultante surnatante a-80 ° C in provette coniche da pre-pesati.
    5. Lyophilize la soluzione congelata per 3 giorni e la massa del prodotto finale per determinare il rendimento di proteina.
    6. Parafilm le provette contenenti la finale liofilizzato prodotto ELP e conservare a 4 ° C.
    7. Eseguire SDS-PAGE per determinare la purezza della proteina.
      Nota: Protocolli per SDS-PAGE varierà in base alle condizioni del gel dell'agarosi specifici. Per i nostri esperimenti, finale liofilizzato di proteine è stato disciolto ad una concentrazione di 0,5 mg/mL in acqua deionizzata e correre a 140 V per 70-100 min in un gel di acrilammide 12% (p/v) sotto condizioni di denaturazione.

2. cellula incapsulamento in 3D elastina-come proteina idrogeli

  1. Preparazione di stampi in silicone
    1. Usare un punzone di biopsia con il diametro desiderato per creare fori in un foglio di silicone spessa 0,5 mm e tagliare un quadrato intorno a ogni buca. Ripetere per il numero di stampi desiderato.
      Nota: Il diametro e lo spessore degli stampi può essere regolate per la particolare applicazione e condizioni di coltura delle cellule. In pratica, per colture cellulari di 50 106 cellule/mL, 0,5 mm spessore stampi con diametri di 5 mm e 4 mm sono raccomandati per sufficiente DNA/RNA ed estrazione della proteina, rispettivamente. Per immunostaining, un pugno di biopsia di 2 mm utilizzabile per creare invece tre fori adiacenti per stampo quadrato in modo che tre replicati possono essere macchiati per pozzetto.
    2. Rimuovere l'involucro di plastica su ogni lato dello stampo individuale con le pinzette.
      Nota: Evitare il contatto con la superficie esposta del silicone come contaminazione può diminuire l'efficienza di incollaggio al plasma futuro.
    3. Con una pinzetta, organizzare lo stesso numero di stampi in silicone nuda e vetrini coprioggetti (n ° 1, diametro 12 mm) a righe sul coperchio rovesciato di una piastra a 48 pozzetti alternate. Una volta completato, coprire il coperchio della piastra 48 pozzetti per evitare la contaminazione.
    4. Il plasma ad ossigeno trattare il coperchio intero 48 pozzetti (cioè., stampi e lastre di vetro). Subito dopo, usare pinze per invertire lo stampo in silicone sull'adiacente vetrino coprioggetti. Premere con forza sullo stampo per garantire l'incollaggio. Lasciate che gli stampi Incubare a temperatura ambiente per 1 h.
      Nota: La durata del trattamento al plasma di ossigeno variano a seconda dello strumento utilizzato. Condizioni tipiche per il nostro strumento sono una finestra di pressione gas funzionamento tra 0,3-4 mbar, flusso di gas di ossigeno/min 20 cm3, e l'esposizione del campione a plasma per 10-20 s.
    5. Sterilizzare gli stampi in autoclave. Conservare gli stampi a temperatura ambiente in un ambiente sterile fino all'utilizzo.
      Nota: Gli stampi possono essere memorizzati in questa fase a tempo indeterminato.
  2. Preparazione della soluzione di riserva di proteina elastina-like
    1. Rimuovere liofilizzato ELP dal deposito di 4 ° C. Caldo la proteina a temperatura ambiente prima dell'apertura del tubo per non garantire condensa si basa sulla proteina sopra uso ripetuto.
    2. Sciogliere ELP in soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) a 4 ° C con agitazione costante (i. e., filatura) durante la notte.
      Nota: Concentrazione della soluzione stock di ELP sarà ulteriormente diluito con l'aggiunta di soluzione di reticolante a un rapporto volumetrico definito dall'utente. Ad esempio, per una concentrazione finale di ELP di 3% (p/v), preparare una soluzione stock di ELP 3,75% (p/v) che sarà diluita in un rapporto volumetrico di 4:1 di soluzione di soluzione: crosslinker ELP. Regolare la concentrazione necessaria per l'applicazione desiderata.
    3. Filtro sterile soluzione di riserva di ELP utilizzando un filtro per siringa da 0,22 µm. Memorizzare ELP su ghiaccio quando non in uso.
  3. Nella cappa di biosicurezza, trasferire gli stampi sterili con pinzette sterili ad una piastra di coltura del tessuto 24 pozzetti.
  4. Preparazione della soluzione di riserva THPC
    1. Diluire il THPC in DPBS appena prima di utilizzare. Regolare la concentrazione della soluzione THPC secondo la concentrazione finale di ELP e rapporto di reticolazione desiderata.
      Nota: Per il protocollo, una concentrazione finale di ELP del 3% (p/v) sarà essere fatto mescolando la soluzione madre di ELP con la soluzione THPC un rapporto volumetrico di 4:1. Regolare, se necessario.
    2. Aggiungere 2,6 µ l di soluzione THPC (80% in acqua) a 997.4 µ l di DPBS.
      Nota: Questa concentrazione di THPC corrisponde a un rapporto stechiometrico di 1:1 dei gruppi idrossi metil su THPC e ammine primarie sulla proteina ELP quando mescolando soluzioni al descritto 4:1 rapporto volumetrico per un finale idrogel ELP 3% (p/v). La soluzione THPC è viscosa e goccioline di soluzione potrebbero aderire al lato della punta della pipetta. Per precise concentrazioni, evitare tali goccioline quando si diluisce in DPBS. Eliminare il contenitore di stock THPC con gas azoto per prevenire l'ossidazione della fosfina e inattivazione del reticolante.
    3. Vortex la soluzione di mescolare e tenere sul ghiaccio.
    4. Filtro sterile il THPC scorta soluzione utilizzando un filtro per siringa da 0,22 µm. Diluire la soluzione di riserva THPC ulteriormente con DPBS sterile per ottenere rapporti stechiometrici reticolazione più bassi (ad es., 0.5:1 o 0.75:1).
      Nota: THPC è sensibili all'ossigeno, e la soluzione diluita deve essere usata entro poche ore dopo la preparazione.
  5. Dissociare le cellule mediante incubazione con tripsina-EDTA in una sospensione unicellulare, agglomerare le cellule e contare le celle nuovamente sospese in mezzo utilizzando un emocitometro.
    Nota: Protocolli esatte per questo passaggio dipenderà pesantemente il tipo cellulare desiderato e applicazione. Per le cellule progenitrici neurali usate in tutto questo protocollo, è stata condotta un'incubazione di tripsina-EDTA 0.025% a temperatura ambiente per 1,5 min. Le cellule erano pellettate a 200 x g per 2 min. Per la vitalità aumentata delle cellule cellule dovrebbero essere sospesi in condizioni medie normali. Densità tipica della cella utilizzata per intervallo di incapsulamento celle da 1-50 106 cellule/mL di volume finale idrogel. Regolare, se necessario.
  6. Aliquotare il numero desiderato di cellule in una provetta da centrifuga sterili da 1,5 mL.
  7. Centrifugare le cellule a ~ 200 x g per 3 min. con attenzione, aspirare il supernatante e tenere il pellet cellulare sul ghiaccio.
    Nota: È fondamentale per aspirare completamente tutto il supernatante per attenuare l'ulteriore diluizione del reticolante ELP e THPC. Velocità di centrifugazione specifici variano con il tipo di cella.
  8. Risospendere il pellet cellulare della soluzione stock di ELP tale che il volume è 80% del volume finale (supponendo un rapporto di 4:1 di soluzione di soluzione: THPC ELP). Pipettare mix 20 - 25 volte per produrre una miscela omogenea delle cellule ed ELP.
    Nota: Evitare il fondo della provetta per mitigare l'aumento della temperatura e transizione di fase successive di ELP di presa. Ogni stampo di 2 mm con tre replicati richiede 7,5 µ l di volume finale (cioè., 6 µ l di soluzione madre di ELP e 1,5 µ l di soluzione madre THPC) diviso in parti uguali nei 3 fori (cioè., 2,5 µ l di volume finale per foro). Per gli stampi di mm 4 e 5, un volume finale di 7,5 µ l e µ l 15,5 è richiesto, rispettivamente.
  9. Aggiungere soluzione stock THPC alla sospensione cellulare/ELP per il restante volume finale di 20%. Pipettare mix 20 - 25 volte per produrre una miscela omogenea.
  10. Pipettare immediatamente gli ultimi volumi corrispondenti della cella/ELP/THPC miscela in ogni stampo con un movimento circolare. Ripetere per tutti gli stampi.
  11. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti, seguito da un'ulteriore incubazione a 37 ° C per 15 min.
    Nota: Il primo periodo di incubazione contribuiranno a facilitare la reticolazione iniziale dell'idrogel prima di aumentare la temperatura a quella sopra LCST di ELP e indurre la sua segregazione di fase termica.
  12. Lentamente aggiungere 750 µ l di terreno di coltura cellulare caldo in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti, evitando di interrompere i gel.
  13. Incubare gli idrogeli a 37 ° C per 7 giorni.
    Nota: Completo medio modifiche sono consigliate ogni 1-2 giorni a seconda del tipo di cella. Per limitare lo stress sul gel, è possibile utilizzare un vetro pipetta Pasteur apposto con una punta di pipetta 200 µ l quando aspirando medio dal pozzo.

3. immunocitochimica di cellule in 3D ELP idrogeli

  1. Preparare la soluzione di fissazione del paraformaldeide (PFA) del 16% (p/v) di 10 mL in 30 ml di DPBS. Riscaldare la soluzione a 37 ° C.
  2. Aspirare il mezzo dalla piastra a 24 pozzetti e lavare delicatamente con 1 mL di DPBS.
  3. Aggiungere 750 µ l della soluzione di fissazione ad ogni pozzetto e incubare a 37 ° C per 30 min. Non utilizzare l'incubatrice di coltura del tessuto per evitare la contaminazione di altre culture con il vapore PFA.
  4. Aspirare accuratamente la soluzione di fissaggio da ogni pozzetto, scartando il PFA a un contenitore appropriato di rifiuti pericolosi.
    Attenzione: L'esposizione a PFA può causare irritazione cutanea e oculare. Indossare guanti/occhiali e lavorare in una cappa chimica.
  5. Aggiungere 1 mL di DPBS per ogni campione. Immediatamente aspirare il DPBS ed eliminare nel contenitore scarti PFA.
  6. Lavare due volte con 1 mL di DPBS per 10 minuti ciascuno, i campioni.
    Nota: I campioni possono essere conservati in DPBS a 4 ° C per fino ad una settimana dopo aver sigillato la piastra con Parafilm.
  7. Permeabilize ogni campione con 750 µ l di soluzione di permeabilizzazione (100 mL di DPBS e 0,25 mL di Triton X-100; PBST) per 1 h a temperatura ambiente su un rocker 15 giri/min.
  8. Aspirare il PBST e 750 µ l di soluzione (95 mL di PBS, 5 g di albumina di siero bovino (BSA), 5 mL di siero e 0,5 mL di Triton X-100) di blocco per ogni campione. Incubare a temperatura ambiente per 3 ore su un rocker 15 giri/min.
    Nota: La soluzione bloccante deve contenere siero da specie ospiti in cui sono cresciuti gli anticorpi secondari (ad es., capra, asino) e sterile filtrata attraverso un 0,22 µm filtrare prima dell'uso.
  9. Preparare la soluzione di diluizione di anticorpo (97 mL di DPBS, 2,5 g di BSA, 2,5 mL di siero (dalla stessa specie ospite come al punto 3.8) e 0,5 mL di Triton X-100). Diluire l'anticorpo primario utilizzando la soluzione di diluizione dell'anticorpo e aggiungere 500 µ l della soluzione di ogni campione. Sigillare la piastra con Parafilm e incubare per una notte a 4 ° C su un agitatore meccanico.
    Nota: La nestina e Sox2 anticorpi primari sono stati diluiti 1: 400 in soluzione di diluizione di anticorpo da concentrazione originale del produttore.
  10. Aspirare la soluzione di anticorpo da ogni campione e lavare i campioni con PBST per 60 min a temperatura ambiente su un rocker 15 giri/min. Ripetere il passaggio di lavaggio 3 volte.
  11. Diluire il brodo secondario di anticorpi e 5 mg/mL DAPI (1:2, 000) utilizzando la soluzione di diluizione dell'anticorpo e aggiungere 500 µ l della soluzione di ogni campione. Coprire la piastra a 24 pozzetti con carta stagnola e incubare per una notte a 4 ° C su un agitatore meccanico.
    Nota: Come gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce, i campioni devono essere protetti da photobleaching per tutti i passaggi successivi. Capra anti-topo e capra anti-coniglio gli anticorpi secondari sono stati diluiti 1: 500 in soluzione di diluizione di anticorpo da concentrazione originale del produttore.
  12. Aspirare la soluzione di anticorpo da ogni campione e lavare i campioni con PBST per 30 min a temperatura ambiente sul rocker. Ripetere il passaggio di lavaggio 3 volte.
  13. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio salterà sulla superficie di un vetrino. Usando il forcipe, rimuovere la soluzione in eccesso dallo stampo tamponando leggermente il bordo dello stampo su un tovagliolo di carta. Posizionare lo stampo capovolto sul supporto montaggio ed evitare di introdurre bolle.
  14. Consentire la soluzione di montaggio indurire per 48 h a temperatura ambiente. Conservare i campioni a temperatura ambiente o a 4 ° C. Consentire il mezzo di montaggio completamente impostare per 48 h prima dell'imaging come indice di rifrazione del mezzo cambierà nel corso dell'indurimento. Sigillare i campioni sul vetrino di copertura con smalto trasparente per mitigare il movimento di contaminazione o campione.
  15. Immagine i campioni utilizzando un microscopio confocale.

Risultati

Il ELPs utilizzata nel presente protocollo sono costituite da cinque regioni: un tag di T7, His6 tag, sito di clivaggio Enterochinasi (EK), una regione di bio-attivi e una regione di elastina-like (Figura 1). I tag T7 e His6 consentono per una facile identificazione mediante tecniche di Western blot standard. Introduzione del sito di clivaggio EK permette la rimozione enzimatica della regione tag, se necessario. La regione di bio-attivi codifica per l'estesa,...

Discussione

Purificazione ed espressione recombinant della proteina è un potente strumento per sintetizzare biomateriali con elevata riproducibilità. A causa dell'avvento della clonazione molecolare commercializzato in gran parte, plasmidi ricombinanti personalizzati possono essere acquistati da diversi fornitori, che riduce significativamente il tempo di lavorare con materiali come ELPs. Allo stesso modo, plasmidi possono essere richiesti direttamente dal laboratorio di origine quando l'opera originale è stata sostenuta da un co...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano T. Palmer e H. Basile (Stanford neurochirurgia) per la fornitura di murino NPC. Vector art nella Figura 4 è stato usato e adattato da Servier arte medica sotto Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Parte di questo lavoro è stato effettuato presso la Stanford Nano ha condiviso strutture (FNS), sostenuto dalla National Science Foundation sotto Premio ECCS-1542152. N.a.s. riconosce sostegno dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health (32GM 008412). C.m.m. riconosce il supporto da un NRSA NIH pre-dottorato (F31 EB020502) e il programma di studiosi di Siebel. S.C.H riconosce sostegno dal National Institutes of Health (U19 AI116484 ed EB018407 R21), National Science Foundation (DMR 1508006) e il California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Questa ricerca ha ricevuto finanziamenti dall'alleanza rigenerativa riabilitazione Research & Training (AR3T), che è sostenuta dalla Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Human Development (NICHD), Istituto nazionale di Disordini neurologici e colpo (NINDS) e Istituto nazionale di Imaging biomedico e Bioingegneria (NIBIB) degli istituti nazionali di salute sotto Premio numero P2CHD086843. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni del National Institutes of Health.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Elastin-Like Protein Expression and Purification
10 cm Petri DishesThermo Fisher ScientificFB0875713
70% EthanolRICCA Chemical2546.70-1
Ammonium SulfateSigma-AldrichA3920-500G
AmpicillinThermo Fisher ScientificBP1760-25G
Bacto AgarThermo Fisher Scientific9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS Competent CellsInvitrogenC606003
ChloramphenicolAmresco0230-100G 
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichDN25
EDTA disodium salt, dihydrateThermo Fisher ScientificO2793-500
GlycerolThermo Fisher ScientificBP229-4
IsopropanolThermo Fisher ScientificA451-4
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher ScientificBP1755-10G
Luria BrothEMD Millipore1.10285.5007
ParafilmVWR52858-000
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)MP Biomedicals195381
Sodium ChlorideThermo Fisher ScientificBP358-212
Sodium HydroxideSigma-AldrichS 8045-1KG
Syringe Filter Unit (0.22 μm)MilliporeSLGP033RB
Terrific BrothMillipore71754-4
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-1
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels
0.22 μm syringe filtersMilliporeSLGV004SL
0.5 mm thick silicone sheetElectron Microscopy Science70338-05
24-well tissue culture plates Corning353047
Disposable Biopsy Punch (2 mm)Integra Miltex33-31
Disposable Biopsy Punch (4 mm)Integra Miltex33-34
Disposable Biopsy Punch (5 mm)Integra Miltex33-35
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) Corning21-031-CM
No. 1 12 mm glass coverslipsThermo Fisher Scientific12-545-80
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC)Sigma-Aldrich404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTAThermo Fisher 15400054
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15701
Bovine Serum Albumin (BSA)Roche3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Molecular ProbesD1306 
Donkey SerumLampire Biological Labs7332100
Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488)Molecular ProbesA-11017
Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546)Molecular ProbesA-11071
Goat SerumGibco16210-072
Mouse Nestin Primary AntibodyBD Pharmingen556309
Mouse Sox2 Primary AntibodyCell Signaling Technology23064S
Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium Vector LabsH-1400 

Riferimenti

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